方法文章

在生物安全二级条件下利用含四顺反子微基因组的病毒样颗粒模拟埃博拉病毒生命周期

38.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52381

⸱

2014年9月27日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Virology, Division of Intramural Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2Research Technology Branch, Division of Intramural Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

本文内容

摘要

埃博拉病毒的感染性实验仅限在生物安全四级实验室中进行。含四顺反子最小基因组的复制和转录活性病毒样颗粒（trVLPs）是一种可模拟病毒生命周期的模型系统，该系统完全依赖埃博拉病毒组分，可在生物安全二级条件下安全地模拟多个感染周期。

摘要

埃博拉病毒可导致人类和非人灵长类动物发生严重的出血热，病死率高达90%。目前尚无批准用于该病毒所致疾病的有效疫苗或特异性治疗方法，且对具有感染性的埃博拉病毒的研究仅限于生物安全四级（BSL-4）实验室中进行，这极大地限制了相关研究的开展。生命周期模拟系统可在生物安全二级（BSL-2）条件下模拟病毒的生命周期；然而，直到最近，这类系统仅能模拟病毒生命周期的个别环节，或仅限于单个感染周期。四顺反子微型基因组由埃博拉病毒的非编码区、一个报告基因以及三个参与病毒形态发生、出芽和进入过程的埃博拉病毒基因（VP40、GP1,2 和 VP24）组成，可用于产生包含这些微型基因组的、具有复制和转录能力的病毒样颗粒（trVLPs）。这些trVLPs能够持续感染表达埃博拉病毒基因组复制与转录相关蛋白的细胞，从而让我们能够在生物安全二级条件下安全地模拟多个感染周期。重要的是，该系统中的病毒组分完全来源于埃博拉病毒，而非其他病毒（例如使用假型病毒的系统即涉及其他病毒），并且在此系统中VP40、GP1,2 和 VP24 并未过表达，因此该系统特别适用于研究病毒的形态发生、出芽和进入过程，尽管该系统也可用于模拟病毒生命周期的其他方面，如基因组复制和转录。因此，四顺反子trVLP检测是目前可用于埃博拉病毒的最全面的生命周期模拟系统，在未来研究埃博拉病毒生物学特性方面具有巨大潜力。本文中，我们提供了该系统的详细使用方法以及预期实验结果的相关信息。

引言

埃博拉病毒是引起人类和非人灵长类动物严重出血热的病原体，在人类疫情中病死率高达90%1。尽管近年来在疫苗开发以及特异性治疗方面已取得显著进展（详见综述2,3），但这些疫苗和疗法尚未获得批准用于人类。埃博拉病毒颗粒具有特征性的丝状外观，长度约为1 µm，直径为96至98 nm4。病毒颗粒的核心为核衣壳，由以下成分组成：1）非分段的单股负链RNA基因组，编码7个埃博拉病毒基因（图1）；2）包裹基因组的核蛋白NP；3）由聚合酶L及其辅因子VP35组成的病毒聚合酶复合物；以及4）转录激活因子VP30。此外，最近研究显示蛋白VP24也与核衣壳相关4。核衣壳周围为基质区，其中含有基质蛋白VP40，该蛋白负责病毒颗粒的形态发生和出芽。病毒颗粒还具有包膜，包膜中嵌有唯一的表面蛋白GP1,2，该蛋白介导病毒颗粒的附着与入侵。

对具有感染性的埃博拉病毒的研究必须在生物安全等级（BSL）4级条件下于最高级别封闭实验室中进行，这使得此类研究仅限于全球少数设施开展。为了在BSL2条件下研究这些病毒的生物学特性或开发新型治疗方法，研究人员通常依赖于埃博拉病毒蛋白的重组过表达系统，或病毒生命周期模拟系统，这些系统均可在不使用具有感染性埃博拉病毒的情况下进行操作。埃博拉病毒蛋白的重组表达可通过表达质粒或病毒载体实现。该策略的一种特殊形式是在表达重组GP1,2蛋白的情况下，利用非埃博拉病毒（最常见为逆转录病毒或水疱性口炎病毒）产生病毒颗粒或病毒样颗粒，从而生成假型颗粒，可用于研究丝状病毒的入侵过程并筛选入侵抑制剂5。此外，也可构建编码埃博拉病毒GP1,2而非其自身糖蛋白的重组病毒（例如，水疱性口炎病毒），用于在生物安全二级条件下研究病毒进入机制6。

生命周期模拟系统是一种反向遗传学系统，其特征是使用截短的埃博拉病毒基因组类似物（即微型基因组），这些微型基因组最初由cDNA产生，随后由以反式提供的埃博拉病毒蛋白进行复制和转录。首个用于埃博拉病毒的微型基因组系统于15年多前建立7，此后已被广泛用于研究埃博拉病毒基因组的复制与转录过程（详见综述8,9）。在该系统中，一个单顺反子的微型基因组包含一个报告基因，其两侧为埃博拉病毒基因组末端的非编码区（称为leader和trailer）（图1），该微型基因组在哺乳动物细胞中表达（通常通过T7 RNA聚合酶介导的转录实现），同时共表达病毒蛋白L、VP35、VP30和NP。微型基因组被NP包裹形成核衣壳，随后由其他核衣壳蛋白利用定位于leader和trailer区的顺式作用信号进行复制和转录，从而产生可检测的报告基因活性，反映病毒生命周期中的这两个关键过程（图2）。

为了模拟病毒生命周期的其他步骤，已开发出具有转录和复制能力的病毒样颗粒（trVLP）系统。该系统基于经典的微基因组系统，但额外通过表达质粒表达了其他病毒蛋白VP24、VP40和GP1,210,11。VP40的存在促使trVLP的形成，这些颗粒表面携带GP1,2，内部则含有携带微基因组的核衣壳。这些trVLP可用于感染靶细胞：靶细胞可预先转染了表达L、VP35、VP30和NP蛋白的质粒，以促进由trVLP带入的微基因组在靶细胞内的复制与转录11；也可为未经转染的 naïve 靶细胞（即 不表达质粒驱动的埃博拉病毒蛋白）10。由此可在靶细胞中检测到报告基因活性，该信号反映了以下过程：在生产细胞中微基因组的复制、trVLPs的形态发生与出芽、其进入靶细胞的过程，以及1）在预先转染的靶细胞中，还包含基因组复制及次级转录（即 由靶细胞内产生的病毒蛋白介导的转录）；或2）在naïve靶细胞中，还包括初级转录（即 由trVLP带入靶细胞的病毒蛋白介导的转录）（图3）。需要强调的是，这些系统仅用于模拟单个感染周期，且依赖于所有病毒蛋白的过表达；其中VP24和VP40的过表达尤为成问题，因为已有研究表明，当这些蛋白由质粒过量表达时，会强烈抑制基因组复制和转录12,13。此外，此类系统产生的trVLP制剂中含有大量非感染性颗粒，给感染性trVLP的生化分析带来了挑战14。

为了解决上述问题，我们近期开发了一种四顺反子微型基因组系统，该系统除报告基因外，还包含编码 VP40、GP1,2 和 VP24 的基因（图1）。与传统的单顺反子微型基因组系统类似，该系统可产生能够感染靶细胞的转录复制型病毒样颗粒（trVLPs）（图4）15。然而，与传统微型基因组系统不同的是，VP40、GP1,2 和 VP24 是在病毒基因组转录后表达产生的，而非通过质粒过表达。因此，这些蛋白的表达动力学和表达水平更接近病毒生命周期中的真实情况，从而使该系统中具有感染性与非感染性 trVLPs 的比例提高约500倍15。此外，利用该系统可实现对含四顺反子微型基因组的 trVLPs 进行连续传代，模拟多个感染周期。因此，四顺反子 trVLPs 目前是可在BSL2条件下研究埃博拉病毒生物学的最为全面的生命周期模拟系统。本文将详细介绍该系统的使用方法以及预期实验结果。

方案

1. 初始生产trVLP时生产细胞的传代

  1. 从在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养的 75 cm2 培养瓶内 80–90% 汇合度的 293 细胞中吸出培养基，该培养基含有 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和 1× 青霉素/链霉素（DMEM10）。用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞两次，注意避免细胞脱落，然后向细胞中加入 2 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液。
  2. 将细胞在室温下孵育，直至在显微镜下观察到细胞明显变圆（约 30 秒）。轻敲培养瓶使细胞脱落，加入 8 ml DMEM10 培养基。通过轻柔吹打充分重悬细胞，直至在显微镜下观察到单细胞悬液。
  3. 使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。将细胞用 DMEM10 培养基稀释至每毫升 2 × 105 个细胞。每孔加入 2 ml 细胞悬液至 6 孔板中（每孔含 4 × 105 个细胞）。
  4. 将 6 孔板置于 37 °C、5% CO2 的湿润化组织培养孵箱中孵育。

2. 初始 trVLP 生产用生产细胞的转染

  1. 细胞传代后24小时（实验时间安排概览见图5），使用滤芯吸头将质粒DNA15（用量见表1）移入无菌2 ml冻存管中。每孔加入100 µl OptiMEM至DNA中。短暂涡旋混合，然后使用微量离心机轻轻离心以沉降管壁液体。若多个孔需转染相同的质粒，可配制多孔用量的主混合液。
  2. 使用前对Transit LT1试剂短暂涡旋。按每孔7.5 µl量加入稀释后的DNA溶液中。轻轻涡旋混合，注意避免液体进入冻存管盖内，室温孵育15分钟。
  3. 通过移液吹打数次轻柔混匀转染复合物。将100 µl转染复合物逐滴加入每孔中。前后及左右轻摇培养板以均匀分布转染复合物。切勿旋转摇动培养板，以免导致转染复合物分布不均。
  4. 将细胞放回培养箱继续培养。
  5. 24小时后，移除细胞上清液。向细胞中加入4 ml含5% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和1× 青霉素/链霉素的DMEM培养基（DMEM5）。若各孔样品相同，此步骤可同时处理最多3 个孔而不致孔内干燥；若样品不同，由于本系统中trVLP具有自我扩增特性，可能发生交叉污染，因此应逐孔操作。
  6. 将细胞放回培养箱继续培养。

3. 靶细胞的制备

  1. 按照第1节所述方法传代293细胞，每孔接种4 × 105个细胞于6孔板中，每孔加入2 ml DMEM10培养基。
  2. 靶细胞传代后24小时，感染前24小时，按照第2节所述方法转染靶细胞，使用表1中的DNA用量，每孔加入4.5 µl Transit LT1。

4. 靶细胞感染与生产细胞收获

  1. 将生产细胞的上清液转移至15 ml离心管中。使用真空管移除并弃去任何残留的上清液。向细胞中加入250 µl Glo裂解缓冲液。
  2. 在室温下以800 × g离心上清液5分钟，以去除细胞碎片。
  3. 移除靶细胞一个孔中的上清液。使用移液器以最慢的速度小心加入3 ml已澄清的生产细胞上清液至靶细胞中。避免直接将液体加到细胞上，以防破坏细胞单层。此步骤必须一次处理一个孔。
  4. 当所有样品转移完成后，将靶细胞放回培养箱中，使trVLPs沉降并感染靶细胞。
  5. 在Glo裂解缓冲液中室温孵育15分钟后，用设定为150 µl的微量移液器将生产细胞在裂解缓冲液中重悬，并将样品转移至2 ml冻存管中。此时，裂解物可于-80 °C冷冻保存，或按第6节所述直接进行测定。
  6. 感染后24小时，移除靶细胞的上清液。向每个孔中加入4 ml DMEM5。如果多个孔中含有相同的样品，则此步骤可一次处理最多三个孔；否则，由于该系统中trVLPs具有自我扩增特性，可能发生交叉污染，此时应一次仅处理一个孔。

5. 单周期感染靶细胞的收获

  1. 若仅需评估单个感染周期，则在感染后72小时，使用真空管吸除靶细胞的上清液。
  2. 按照第4节中所述方法，用250 μl Glo裂解缓冲液收集细胞（针对生产细胞的方法）。

6. 目标细胞的收获与trVLPs的连续传代

  1. 若需对trVLPs进行连续传代，请按照第3节所述方法准备一组新的靶细胞，使其在第一组靶细胞感染后72小时即可用于感染（见图5）。
  2. 按照第4节所述方法感染新一组的靶细胞（将第一组靶细胞作为生产细胞使用）。
  3. 每72小时重复一次上述步骤。

7. 报告基因活性分析

  1. 若细胞裂解物已冷冻，请在室温下解冻。测量前确保样品已达到室温。
  2. 在室温下解冻所需量的Renilla Glo检测试剂缓冲液（每份样品40 µl，建议分装后冷冻保存）。在使用前确保缓冲液已完全升至室温。
  3. 加入1/100th 将Renilla Glo底物加入Renilla Glo检测缓冲液中，配制成Renilla Glo试剂，涡旋混匀。用移液器向白色96孔板中加入40 µl Renilla Glo试剂。
  4. 向Renilla-Glo试剂中加入40 μl样品。室温避光孵育10分钟，然后使用1秒积分时间在化学发光仪中检测样品。

结果

将编码埃博拉病毒核衣壳蛋白NP、VP35、VP30和L的表达质粒、四顺反子微型基因组以及辅助性T7聚合酶共转染293生产细胞后，可实现微型基因组的复制与转录，并在72小时时检测到明显的报告基因活性（图6）。重要的是，所观察到的报告基因活性（105.6相对发光单位（RLU））比未转染L蛋白编码质粒的阴性对照组（103 RLU）高出两个数量级以上。即使在缺乏L蛋白的情况下仍观察到的低水平活性，很可能源于微型基因组质粒中存在的隐蔽启动子。用生产细胞上清液中的trVLPs感染靶细胞后，报告基因活性较生产细胞本身略有升高，具体数值依传代次数不同而介于106至107 RLU之间。相比之下，当将–L对照组生产细胞的上清液传代至靶细胞（靶细胞表达包括L在内的全部核衣壳蛋白）时，报告基因活性未超过发光检测仪的背景噪声水平（约102 RLU）。

四重顺反子trVLP检测可用于研究埃博拉病毒的生命周期。例如，trVLP感染293细胞依赖于黏附因子（如Tim-1）的存在 16，必须提供 在转染中 在这些细胞中。因此，在四顺反子trVLP检测中，若缺乏Tim-1，靶细胞中的报告基因活性会下降约100倍图7A）。利用RNAi技术结合该方法还可评估特定（病毒或细胞）蛋白质在病毒生命周期中的作用。例如，通过RNAi介导的L蛋白下调会导致报告基因活性下降约100倍，反映出L蛋白在复制与转录过程中的核心作用。图7B)7此外，还可以直接对迷你基因组进行操作，以评估突变对病毒生命周期的影响。例如，在起始密码子下游立即引入3个终止密码子以阻断迷你基因组中VP24的表达，结果发现生产细胞中的报告基因活性未发生显著变化；然而，在经过一次传代后，靶细胞中的报告基因活性降低了约20倍，经过两次传代后则降低了约400倍，表明VP24在感染性trVLPs的产生过程中发挥重要作用（图7C）15.

埃博拉病毒基因组示意图，显示单顺反子和四顺反子微型基因组结构。
图1. 埃博拉病毒基因组以及单顺反子和四顺反子微型基因组的结构。 埃博拉病毒蛋白的编码区以红色（NP、VP35、VP30 和 L）、黄色（VP40 和 VP24）或蓝色（GP1,2）矩形框表示。非编码区（NCRs）以绿色表示，并标示出 leader 和 trailer 区域。下标表示用于连接编码区的病毒 NCR。报告基因（rep）的编码区以紫色表示。

病毒基因组复制示意图；T7-pol 转录、NP 包装、mRNA 翻译过程。
图 2. 单顺反子微基因组检测。 细胞被转染表达埃博拉病毒核衣壳蛋白（NP、VP35、VP30、L）的表达质粒、一个单顺反子微基因组（mg）以及T7聚合酶。微基因组最初由T7聚合酶（a）转录为与病毒基因组（vRNA）相同方向的未包装微基因组RNA，随后被NP包裝（b）。该已包装的vRNA通过互补的微基因组RNA（cRNA）中间体（c）进行复制，并进一步转录为报告基因mRNA（d），后者翻译生成报告蛋白（e）。

详细说明基因组复制、转录和报告基因活性的病毒RNA复制与转录示意图。
图3. 使用单顺反子微基因组的trVLP检测。 细胞被转染表达微基因组检测所需组分的质粒（埃博拉病毒核衣壳蛋白NP、VP35、VP30、L、单顺反子微基因组以及T7 RNA聚合酶），同时转染VP40、GP1,2和VP24。这导致形成包含含有微基因组的核衣壳（f）的trVLP。这些trVLP随后可感染靶细胞（g），靶细胞要么预先转染了表达NP、VP35、VP30和L的质粒（上图），从而实现微基因组的复制和次级转录（d），并导致报告基因表达（e）；要么为未经处理的 naïve 靶细胞（下图），仅发生微基因组的初级转录（h），同样导致报告基因表达（e）。

病毒基因组复制示意图；转录、包装、翻译、进入靶细胞。
图 4. 使用四顺反子型迷你基因组的trVLP检测。 细胞被转染表达埃博拉病毒核衣壳蛋白（NP、VP35、VP30、L）的表达质粒、四顺反子型迷你基因组（mg）以及T7 RNA聚合酶。初始转录（a）、包装（b）、基因组复制（c）和转录（d），以及翻译（e）的过程与单顺反子型迷你基因组检测中相同。然而，与单顺反子系统不同的是，四顺反子型迷你基因组还会额外转录出VP40、GP1,2 和VP24的mRNA，从而导致trVLP的形成（f）。这些trVLP可感染已预先转染了编码核衣壳蛋白NP、VP35、VP30和L的表达质粒、以及细胞表面埃博拉病毒附着因子Tim-1的靶细胞，进而在靶细胞内实现基因组复制与转录，并产生新的trVLP，可用于感染新一轮的靶细胞。

细胞培养过程示意图；接种、转染、感染、收获，共17天；时间线图表。
图5. 三连续传代的四顺反子trVLP检测时间安排。 图中显示了三次连续传代（以箭头表示）中细胞接种（s）、转染（t）、感染（i）、换液（c）以及细胞和trVLP收获（h）的时间点。

log RLU 与传代次数关系图，比较 p0:-L 和 p0:+L；误差线，背景噪声线。
图6. 四顺反子trVLP检测中观察到的报告基因活性典型水平。 按照本文所述方案，进行了连续5次传代的四顺反子trVLP检测。作为阴性对照，在p0代生产细胞的转染过程中省略了编码L蛋白的表达质粒（-L）。在p1至p5代中，靶细胞均转染包含所有核衣壳蛋白（包括L蛋白）的表达质粒。图中虚线表示荧光计的背景噪声水平。数据来自3次独立实验，显示4个生物学重复的均值及标准差。

实验基因表达柱状图；log[RLU] 与不同蛋白质条件的比较。
图 7. 利用四顺反子型trVLPs评估多种病毒和细胞因子对病毒生命周期的影响。（A）Tim-1 作为附着因子。 靶细胞预先转染编码核衣壳蛋白的表达质粒，并同时转染或不转染编码Tim-1的质粒（见文献15），随后用四顺反子型trVLPs感染。感染后72小时测定p1靶细胞中的报告基因活性。结果显示来自4次独立实验的4个生物学重复的均值及标准差。（B）RNAi介导的L蛋白敲低对基因组复制和转录的影响。 靶细胞预先转染编码核衣壳组分、Tim-1以及靶向L蛋白（anti-L）或无关蛋白（anti-GFP）的miRNA的表达质粒（见文献15），随后用四顺反子型trVLPs感染。感染后72小时测定p1靶细胞中的报告基因活性。结果显示来自2次独立实验的5个生物学重复的均值及标准差。（C）迷你基因组突变对trVLP感染性的影响。 采用野生型迷你基因组（4cis-WT）或在VP24起始密码子后立即引入3个终止密码子的突变型迷你基因组进行四顺反子型trVLP实验；该突变可完全阻断VP24蛋白的表达，同时对迷你基因组的长度、核酸组成、二级结构等仅造成最小程度的改变。在转染/感染后72小时测定p0、p1和p2细胞中的报告基因活性。结果显示来自3次独立实验的3个生物学重复的均值及标准差。

生产细胞 (p0)靶细胞 (p1 及以上)
pCAGGS-NP125125
pCAGGS-VP35125125
pCAGGS-VP307575
pCAGGS-L1,0001,000
p4cis-vRNA-RLuc250-
pCAGGS-T7250-
pCAGGS-Tim1-250

表1. 转染所需的DNA量。 转染生产细胞和靶细胞时，每孔6孔板所需的各质粒用量以纳克（ng）表示。所有质粒均在Watt et al15中有所描述。

讨论

本研究中描述的四顺反子trVLP检测法能够对埃博拉病毒生命周期在多个感染周期中的过程进行建模。重要的是，该系统产生的trVLP不含编码核衣壳蛋白NP、VP35、VP30和L的遗传信息，而这四种蛋白共同构成了埃博拉病毒基因组近60%的序列，且对病毒复制至关重要。相反，这些蛋白必须通过表达质粒在靶细胞中以反式方式提供，任何不表达这四种蛋白的细胞感染均为无效感染。值得注意的是，目前尚无丝状病毒发生遗传重组的证据，且四顺反子微型基因组与编码核衣壳蛋白的表达质粒之间不存在同源区域。因此，既无实际证据也无理论基础表明该系统可能产生全长的埃博拉病毒基因组，进而导致感染性埃博拉病毒的生成，这使得该系统在BSL2条件下使用是安全的。

四重荧光素酶trVLP检测中有两个关键步骤受实验条件影响， 即 trVLPs 的制备以及利用这些 trVLPs 感染靶细胞。trVLPs 的产生依赖于高水平的迷你基因组复制与转录，而后者又依赖于高效的转染效率。转染效率可通过设置-L对照组来简便评估，即用编码eGFP的表达质粒替换L蛋白的表达质粒。在转染后24小时，通过荧光显微镜观察，此条件下的转染率应超过50%。此外，细胞必须无支原体污染，因为根据我们的经验，支原体污染会显著抑制迷你基因组的复制与转录（未发表数据）。由于293细胞具有较高的转染效率，因此是进行trVLP检测的首选细胞系；然而，这些细胞对埃博拉病毒的感染相对不易感（尽管并非完全抵抗）16表达诸如Tim-1之类的附着因子可使293细胞对trVLPs的感染效率提高约100倍，并在多轮传代过程中对该系统的成功至关重要。

虽然四顺反子型trVLP本身不具备自我复制能力，但在表达核衣壳蛋白的细胞中具有自我复制能力。因此，必须采取预防措施，避免含有不同trVLP的孔板之间发生交叉污染（例如，使用含不同突变的迷你基因组）。从技术角度来看，由于本实验中阳性与阴性信号之间差异较大（约4个数量级），在检测荧光素酶活性时样品间可能发生信号串扰；然而，该问题可通过在96孔板中每份样品之间留出一个空孔而轻松避免。

四顺反子型trVLP具有多种可能的应用。显然，它们非常适合用于研究丝状病毒颗粒的进入过程，因为具有感染性的trVLP具有与感染性丝状病毒相同的典型丝状结构14，并且含有与丝状病毒颗粒相同的病毒组分。重要的是，它们不包含其他病毒的组分，这与使用假型病毒颗粒或病毒样颗粒（如携带GP1,2的逆转录病毒颗粒）或重组病毒（如表达GP1,2的重组水泡性口炎病毒）的情况不同。在该系统中使用293细胞作为靶细胞时，对黏附因子的需求可用于筛选并研究此类黏附因子的作用，而其他细胞因子（如参与基因组复制与转录以及形态发生和出芽的因子）的作用则可通过RNAi技术进行研究。病毒蛋白中突变对病毒生命周期的影响也可被研究，但需注意的是，VP40、GP1,2和VP24是在病毒转录后表达的，而其他病毒蛋白则由表达质粒表达，因此必须考虑这些蛋白过表达所带来的影响。此外，需注意确保对迷你基因组的突变不会显著改变其长度，因为报告基因活性直接受迷你基因组长度的影响15。最后，由于四顺反子型迷你基因组是携带病毒基因的病毒基因组类似物，并由病毒聚合酶复合物进行复制，因此在BSL2条件下研究这些基因在突变压力下的进化也是可行的。因此，尽管该方向仍需进一步研究，但例如可在迷你基因组中的基因内引入次优突变，随后连续传代trVLP，直至互补性突变出现。

四重感染性trVLP检测系统的一个局限性需要注意：尽管该系统能够模拟病毒生命周期的大部分过程，但由于靶细胞必须表达核衣壳蛋白，因此无法模拟靶细胞中的初级转录过程。 在转染中 为使trVLPs能够复制。如果需要评估初级转录，则可以使用未经处理的靶细胞10；然而，在这种情况下，靶细胞内不会发生基因组复制，也不会产生新的感染性trVLP，从而使感染终止。这是一个根本性问题，除非通过在迷你基因组中加入编码核衣壳蛋白的基因，使trVLP完全具备自我复制能力，否则无法克服；但这样做实际上会使其转变为具有感染性的重组埃博拉病毒。事实上，已有研究成功构建出表达荧光素酶或其他报告基因的埃博拉病毒，可用于评估和研究病毒基因组的复制与转录过程17,18；然而，它们的使用仅限于BSL4实验室。同时必须注意，尽管VP40、GP1,2，VP24 由病毒基因组类似物表达，其在最小基因组中的位置（2nd, 3rd，以及 4th 转录单位）与其在病毒基因组中的位置并不相同（3rd, 4th，以及6th 转录单元），这可能会影响它们的绝对表达水平，以及彼此之间的相对表达水平。

总体而言，四顺反子trVLP检测法代表了迄今为止可用于埃博拉病毒的最全面的生命周期模拟系统，能够在多个感染周期中模拟基因组复制与转录、病毒颗粒形态发生与出芽，以及病毒与靶细胞的附着和入侵过程。因此，该系统在生物安全二级（BSL2）条件下研究埃博拉病毒生物学方面具有巨大应用潜力。

披露

作者声明不存在竞争性经济利益。

致谢

作者非常感谢美国国立卫生研究院（NIH）过敏与传染病研究所（NIAID）实验室访客项目（LV, DIR, NIAID, NIH）的 Bob Fischer 担任本视频的解说员，同时感谢 NIH 动物资源处（RTB, DIR, NIAID, NIH）的 Austin Athman 以及 NIH 办公室研究服务处（DOHS, ORS, OD, NIH）的 Megan Morgan 在制作本论文配套视频过程中提供的帮助。此外，我们还要感谢 NIAID 实验室访客项目（LV, DIR, NIAID, NIH）的 Allison Groseth 对本论文的审阅。本研究由 NIH 所属 NIAID 的院内研究计划资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
75 cm2 细胞培养瓶Corning 430641
DMEMSigmaD6546使用前预热至 37 °C
FBSLife Technologies26140-07956 °C 加热灭活 30 分钟
L-谷氨酰胺Life Technologies25030-081100 倍浓度
青霉素-链霉素溶液（Pen/strep）Life Technologies15070-063100 倍浓度
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液Life Technologies25200-056
PBS8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，加 H2O 至 1 L；高压灭菌后室温保存 
6 孔板Costar3516
Opti-MEM I 培养基Life Technologies31985-070
Transit LT1 转染试剂MirusMIR 2300
Glo 裂解缓冲液PromegaE2661
海肾荧光素酶检测试剂盒（Renilla Glo luciferase assay system）PromegaE2720
96 孔检测板（白色）Costar3912
Modulus 微孔板发光检测仪Turner Microsystems998-9300

参考文献

  1. Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
  2. Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
  3. Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
  4. Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608(2012).
  5. Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. Enna, S. J. , (2010).
  6. Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
  7. Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
  8. Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
  9. Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
  10. Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
  11. Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
  12. Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
  13. Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
  14. Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
  15. Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
  16. Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
  17. Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
  18. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

TRVLP VP40 GP12 VP24

相关文章