评估大鼠行为灵活性的操作性实验方法

摘要

评估大鼠行为灵活性等执行功能的能力，有助于研究完整动物和疾病模型中的认知神经生物学机制。本文描述了用于评估策略转换和反转学习的自动化任务，这些任务对前额叶皮层网络的功能障碍尤为敏感。

摘要

执行功能包含多种高级认知过程，这些过程驱动规则生成和行为选择。这些过程的一个涌现特性是能够根据个体环境的变化来调整行为即行为灵活性）。这些过程对正常的人类行为至关重要，并可能在多种神经精神疾病中受到破坏，包括精神分裂症、酒精成瘾、抑郁症、中风和阿尔茨海默病。由于出现了可用于评估行为灵活性各个独立成分（特别是策略转换和反转学习）的动物任务，人们对执行功能神经生物学的理解已取得显著进展。尽管已开发出多种类型的任务，但大多数任务均为非自动化、劳动密集型，且每次只能测试一只动物。近期发展的基于操作性条件反射的自动化任务可简化测试流程，标准化刺激呈现和数据记录，并显著提高通量。本文中，我们描述了使用由定制软件程序控制的操作箱进行的自动化策略转换与反转学习任务。利用这些任务，我们已证明在大鼠中，内侧前额叶皮层调控策略转换而非反转学习，这与人类观察到的分离现象相似。此外，新生期海马损伤（一种精神分裂症的神经发育模型）的动物在策略转换任务中表现出选择性损伤，而在反转学习任务中则不受影响。策略转换任务还可区分不同类型的执行错误，每种错误均与特定的神经基础相关。这些自动化任务的可及性，以及不同前额叶区域贡献可分离性的证据，使其成为研究基本神经生物学过程以及在疾病模型中进行药物发现与筛选的尤为合适的检测方法。

引言

规则生成、行为选择和策略评估等高级认知过程统称为“执行功能”或“行为灵活性¹”。这些过程对正常的认知功能至关重要，并可能在精神分裂症、酒精依赖、抑郁症、中风和阿尔茨海默病等多种疾病中受损^2-7。执行功能过程的调控主要由大脑额叶皮层区域介导，包括人类的背外侧前额叶皮层和眶额叶皮层^8-10。

开发用于评估非人类动物（尤其是啮齿类动物）执行功能和/或行为灵活性的任务，极大地推动了对认知神经生物学的理解^11-14。此类任务使得研究者能够分别测量行为灵活性的不同组成部分，包括策略转换和反转学习。策略转换指的是在获取一种新的、相互竞争的策略时，主动抑制先前已习得的反应策略的能力，尤其是在不同刺激维度之间进行转换（即维度间转换）——例如，从基于视觉的辨别任务（红色 vs. 绿色，其中红色为“正确”选项，触觉刺激为无关因素）转换为基于触觉的辨别任务（光滑 vs. 粗糙，其中光滑为“正确”选项，视觉刺激此时变为无关因素）。另一方面，反转学习也涉及反应策略的改变，但这种改变发生在同一刺激维度内——例如，在“红色 vs. 绿色”的例子中，如果先前红色是正确的，那么反转后绿色变为正确选项，而触觉刺激仍保持无关。

已开发出多种任务用于研究啮齿类动物的行为灵活性。十字迷宫任务要求动物首先学会基于方向的规则（例如，“始终右转”）或基于视觉的规则（例如，“始终转向视觉线索”），并达到一定的表现标准。随后，要求动物出乎意料地在模态之间切换至相反的规则（策略转换，最初称为“非逆转转换”¹⁵），或在同一模态内切换至相反的关联（逆转学习）^13,14,16。此类任务对涉及前额叶皮层、丘脑和纹状体的皮层及皮层下神经网络的功能障碍具有敏感性^{1,13,14,16-18}。另一种类型的注意性策略转移任务（有时称为挖掘任务）要求训练动物区分在两个或三个刺激维度上存在差异的容器（挖掘介质、气味和/或外部质地）。与十字迷宫任务类似，随后要求动物在维度之间转换（策略转换）或在同一维度内转换（逆转学习），这些任务同样对前额叶皮层的操作具有敏感性^11,19。该任务的一个优势在于，在跨维度策略转换过程中，大鼠会接触到全新的刺激集（范例），这确保了在此阶段出现的行为表现受损更可能归因于将注意力从复合刺激的某些方面转移到其他方面的能力受损，而非无法停止对先前与奖励相关联的特定刺激的趋近行为。然而，这一特点也使得更准确地确定策略转换过程中缺陷的具体性质变得更加困难。

尽管上述任务在文献中已有充分记载，但它们都存在若干操作上的缺点，主要在于测试动物所需时间较长。在十字迷宫任务和挖掘任务中，每次只能测试一只动物；此外，测试必须由专职实验人员实时进行，每只动物每天的测试时间可能长达数小时。另外，这两类任务中刺激的呈现和行为反应的记录均由实验人员手动控制，因此容易受到人为误差和主观判断的影响。

本文介绍了一种利用操作性实验程序自动评估大鼠策略转换和反转学习能力的方法，该方法简化了刺激控制和数据呈现过程，并显著提高了数据采集速度和通量^20,21。文中详细描述了大鼠的塑造与训练方法、任务本身的各个组成部分以及所得数据的分析方式。我们发现，与十字迷宫和挖掘任务类似，这些自动化任务对前额叶及皮层下神经环路的功能障碍，以及模拟精神分裂症的神经发育干预均具有敏感性^20-23。

方案

注意：此处描述的所有实验程序均已获得马里兰圣玛丽学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）或不列颠哥伦比亚大学加拿大动物护理委员会的批准。

1. 动物

1. 使用成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠或成年雄性 Long-Evans 大鼠。
   注意：尽管尚未对这两种品系在行为表现上的差异进行正式测试，但 Long-Evans 大鼠在视觉线索辨别任务（如下所述）中的习得速度通常略快于 Sprague-Dawley 大鼠（Floresco，未发表观察结果）。
2. 动物到达饲养室后，根据实验需求和设施条件，可单独或分组饲养。对于需要食物限制的实验，应采用单只饲养，以便更好地控制食物摄入量。动物到达后，至少让其在无操作和食物限制的情况下适应饲养环境 3 天。
   注意：最近有研究报告指出，实验人员的性别可能对疼痛和焦虑行为的测量产生不利影响²⁴，该发现可能也适用于其他应激敏感行为，包括认知功能。在我们的研究中，尚未观察到由男性或女性操作者训练的大鼠在行为表现上存在明显差异，尽管我们未对此进行正式评估。
3. 在开始行为测试前，每天对动物进行约 3–5 分钟的手动接触操作，持续至少 3 天。在首次操作当天，记录每只大鼠的自由进食体重。若实施食物限制，目标体重应为该自由进食体重的 85–90%。将此目标体重记录下来，例如，记入实验记录本或动物笼卡上。在某些情况下，若使用的强化物具有高度适口性（例如，加糖牛奶），可能无需食物限制，但使用此类强化物时动物可能过快产生饱足感。
4. 在每次操作结束后，于每只动物的居住笼内放置约 10–20 粒奖励颗粒，以使大鼠（通常具有新物体恐惧倾向）适应将在任务中使用的强化物（见下文第 2.1.3 节）。
5. 在为期三天的操作期间，逐步减少动物每日的食物摄入量，使其达到目标体重。务必在笼卡或其他记录文件中注明动物已进入限制饮食状态。
   注意：食物限制必须事先获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）或其他监管机构的批准，方可实施任何相关操作。下述通用操作流程已获得作者所在机构相关机构的批准；请务必查阅各机构适用的本地和/或国家指南，以满足额外要求。
6. 每周至少称重两次，以监测动物健康状况，并确保其体重未显著低于目标体重。确保动物可随时自由获取饮水。

2. 仪器与软件

1. 使用配备（至少）两个可伸缩杠杆、两个刺激灯、一个箱内灯和一个强化物分配器的操作箱进行这些任务。
   1. 将两个杠杆置于中央强化物递送区域的两侧，每个杠杆上方各放置一个刺激物。
   2. 确保环境光能够照亮整个实验箱，同时不影响对刺激光的检测。 例如将屋内照明灯置于杠杆和刺激灯对面的墙上。
   3. 使用可口的食物（例如蔗糖颗粒^20,21 或蔗糖溶液²⁵）以进行强化。下文中凡提及“强化动物”的步骤，均给予一颗45 mg的蔗糖颗粒或规定剂量的蔗糖溶液。
2. 通过计算机接口控制刺激呈现、杠杆操作和数据采集。有关使用MED-PC软件编写任务程序的具体信息，请联系作者，该软件专为行为测试和数据采集设计。
   注意：用于行为测试的程序有一个关键特征，即逐次记录每次试验中的关键变量，包括线索灯的位置、动物选择的杠杆、动物作出的是正确反应、错误反应还是无反应（遗漏），以及作出选择的潜伏期。这些数据对于评估在选择序列不同阶段所犯错误的具体类型至关重要，下文将对此进行描述。
3. 在预训练开始时，将每只动物分配至一个操作箱，该动物在整个实验期间每天均在此操作箱中进行测试。整个实验过程中，应在每天大致相同的时间对动物进行测试。
4. 定期清洁操作式条件反射箱（至少每周一次），使用肥皂水和/或抗菌溶液进行清洗。

3. 预训练

注意：当动物达到目标食物限制体重后，即可开始在操作箱中进行塑造训练。预训练程序通常需要约10至20天，大鼠个体之间存在较大差异。有关操作流程的概述，请参见图1C。

1. 训练动物进行杠杆按压。
   1. 在固定比率（FR）-1 强化程序下训练动物， 即每次按压杠杆均给予一次强化。塑造训练可同时在两个杠杆均伸出的情况下进行（按压任意一个杠杆均给予强化），或每次仅在一个杠杆上进行（例如每天一个杠杆（左/右顺序在动物之间和/或实验条件之间进行交叉平衡）。
      1. 当两个操纵杆均伸出时进行塑形训练，继续每天一次、每次30分钟的训练，直到动物连续两天每天至少达到50–60次按压的最低标准。该过程通常需要约3–6天。
      2. 对每个杠杆分别进行塑形训练时，需持续对第一个杠杆进行训练，直到动物对该杠杆的反应次数达到至少50–60次。随后的塑形训练应使用相反的杠杆，直到大鼠再次达到此标准。通常情况下，大鼠在学会按压第一个杠杆后，能迅速达到第二个标准。
         注意：每次仅对一个杠杆进行塑造所需时间更长（动物需分别对每个杠杆达到标准两次），但可确保动物获得在两个杠杆之间响应及交替操作的经验，这是下述任务中的关键组成部分。
2. 给予动物可伸缩杠杆训练，使其熟悉杠杆的伸出与缩回动作，并确保大鼠的遗漏反应较少（通常 <5) 当他们进入任务的主要测试阶段时。
   1. 每次试验中，确定应伸出的杠杆。以伪随机顺序交替伸出左右杠杆，使左杠杆和右杠杆各伸出45次，且相同杠杆连续伸出的次数不超过两次。
   2. 伸长选定的杠杆。在杠杆伸出后的10秒内，若动物按压该杠杆，则给予强化，随后收回杠杆。
   3. 如果动物在10秒内无反应，收回杠杆并记录为遗漏。
   4. 在整个实验过程中，每隔 20 秒开始一次试验。
      注意：在可伸缩杠杆训练期间，对刺激灯进行预先暴露（每次杠杆伸出时，左右两侧刺激灯均被点亮） 可能 可用于降低面板灯光的新颖性和显著性，从而增加后续转换注意力任务的难度²⁰采用该程序将显著增加动物达到下述视觉线索辨别标准所需完成的试验次数，在此条件下，动物可能需要多天才能学会该规则。
   5. 继续进行可伸缩杠杆训练（每天1次，每次30分钟），持续固定天数，或直至动物连续两天内遗漏次数达到每天5次或更少的最低标准。此过程通常需要约5至10天。
      1. 对于采用急性干预的研究（例如，药物测试），使用固定的天数（例如，5天）以确保所有大鼠对杠杆的暴露程度相似。
3. 评估动物的侧向偏好。
   1. 在可伸缩杠杆训练的最后一次训练结束后立即进行侧向偏好测试（同一天内；参见 图1C）。侧向偏好任务包含七次试验，每次试验由2至8个子试验组成，子试验之间以固定的20秒间隔（ITI）分隔。
   2. 每次子试验中，将两个杠杆伸入箱内持续10秒，或直至动物做出按压杠杆的反应。此训练阶段不点亮刺激灯。
   3. 在每次试验的首个子试验中，强化任一杠杆上的反应，并将其记录为“初始反应”。
      1. 在同一试验内的后续子试验中，不要对同一杠杆上的反应进行强化。允许在同一试验内对同一杠杆最多连续产生六次反应，之后给予一次强制子试验。强制子试验中仅伸展对侧杠杆，持续10秒或直至发生反应为止。
   4. 每次试验中，在动物首次做出反应后，强化其在相反杠杆上的第一次反应，随后结束该次试验。因此，在每次试验（包含最多八个子试验）中，要求动物在每个杠杆上至少反应一次。
   5. 将每只动物的侧向偏好定义为多数初始反应发生的一侧（七次试验中至少有四次）。
   6. 然而，如果在实验过程中动物对其中一个杠杆的反应显著多于另一个（定义为比例超过2:1），则记录该侧为动物的偏好侧。
   7. 在侧偏好测试结束后的下一个连续日开始测试。
      注意：根据我们的经验，大多数动物并未表现出明显的侧向偏好。对于存在偏好的动物，在反应辨别训练期间要求其按压与偏好相反一侧的杠杆，可确保动物学习的是该杠杆所对应的特定反应-奖励关联，而非仅仅在偏好的杠杆上做出反应。

4. 测试

注意：动物可接受以下三种序列之一进行测试，每种序列均包含两个不同的任务。策略转换通过（1）从线索到反应的集合转换和/或（2）从反应到线索的集合转换进行评估；反转学习通过（3）反应反转进行评估。（第四个可能的序列，即线索反转，因下文所述原因不推荐使用。）

1. 关于任务和序列的一般信息
   1. 每个序列需在连续的日期进行。每个序列至少需要两天（初始辨别学习，随后进行转换或反转）。
   2. 单次任务中最多使用150至200次试验，具体取决于实验性质。（需注意，试验次数增加将必然导致整个实验时长达到或超过60分钟，对于作用时间较短的药物进行药理学测试时，此因素需加以考虑。）
   3. 对每个序列，先让动物完成一项任务（“Set”），随后进行第二项任务（“Shift”或“Reversal”）。每只动物的测试最多持续3天。即每个任务进行450-600次试验，总计最多6天。
      1. 在3天内未达到标准的动物予以剔除 首先 实验中的任务（“Set”）
      2. 对于在3天内未达到标准的动物 第二 任务（“Shift”或“Reversal”），为达到标准的试验分配最高分，该分数代表所经历的试验次数即，共3天，每天150次试验，总计450次试验。
      3. 如果任务参数已被调整，使得对照动物可在单日内达到标准表现，则应修改任务，使所有大鼠仅接受一次测试会话，并对在规定试验次数内未达到标准的个体赋予最高分值（150-200次试验，具体取决于任务的设置方式）。
      4. 在转换或逆转任务中，可让动物在开始阶段立即执行新规则，或先进行20次“提示”试验，使其按照训练第一阶段所习得的规则完成任务，随后在当次实验过程中切换规则。²².
         注意：后一种程序对于评估可能改善灵活性的潜在促认知化合物尤其有用，因为它可用于阐明在转换/反转阶段表现提升究竟是源于灵活性增强，还是源于对先前规则的记忆提取受损，后者可能促进新规则在转换期间的学习。
2. 任务转换：从线索任务到反应任务
   1. 开始在提示任务中测试动物（参见 图1A），使动物在点亮的刺激灯（线索）下方的杠杆上做出反应时获得强化。在线索任务序列中，线索任务即为“设定”任务。
      1. 每次试验开始时，两个操纵杆均处于缩回状态。
      2. 照亮左侧或右侧刺激光源3秒；然后将两个杠杆伸入实验箱中持续10秒，或直至动物产生反应。
      3. 仅对信号杠杆上的正确反应进行强化。任一杠杆上发生反应后，立即收回两个杠杆。
      4. 每节实验中每隔20秒开始一次试验。试验顺序采用伪随机化设计，确保相同刺激光（左侧或右侧）连续出现的次数不超过两次。
      5. 继续试验，直到动物达到标准（完成连续10次正确反应）且至少完成30次试验，或完成150至200次试验但未达到标准为止。
      6. 如果第一天未达到标准，则在第二天再次对动物进行线索任务（Cue task）测试，但取消完成至少30次试验的要求。如果第二天仍未达到标准，则在第三天按照相同程序继续测试动物。
   2. 在完成线索任务标准的次日，将动物转入 反应任务（参见 图1B），该任务通过强化动物按压与其偏好侧相反的杠杆来训练动物，无论刺激灯（线索）是否点亮。此序贯任务中的“反应任务”即为“转换”任务。
      1. 每次试验开始时，两个杠杆均处于缩回状态。
      2. 照亮左侧或右侧刺激灯3秒；然后将两个杠杆伸入实验箱中持续10秒，或直至动物产生反应。（注意：在此任务中，刺激灯的位置无关紧要。）
      3. 仅在正确位置的操纵杆（左侧或右侧，与动物的偏好侧相反）上给予强化。当任一操纵杆被触发后，立即收回两个操纵杆。
      4. 每轮会话中每隔20秒开始一次试验。以伪随机方式确定试验顺序，确保相同刺激光（左侧或右侧）连续点亮的试验不超过两次。
      5. 继续试验，直到动物达到标准（完成连续10次正确反应）或完成150次试验仍未达到标准为止。
      6. 如果第一天未达到标准，则在第二天再次对该动物进行反应任务测试。如果第二天仍未达到标准，则在第三天采用相同程序进行测试。

图 1：策略转换序列中使用的辨别任务。 本图展示了在“线索-反应”序列中执行的任务；请注意，在“反应-线索”序列中，任务内容相同，只是顺序相反。（A） 在视觉线索辨别学习阶段，当刺激灯点亮时，动物在对应下方的压杆上做出反应会受到强化。（B） 在反应辨别学习阶段，动物无论刺激灯位于哪一侧，只要在特定一个压杆（左侧或右侧）上做出反应即会受到强化。（C） 典型策略转换实验的训练阶段流程图，从预训练到测试阶段的完整流程。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 任务转换：对线索的反应。
   注意：此实验序列最能从视觉线索灯光预暴露条件加入预训练中获益^20,21（见上述步骤 3.2.4）。先前研究表明，在可伸缩杠杆训练期间对大鼠进行灯光预暴露，会使对线索的反应转换更加困难，并依赖于内侧前额叶皮层。相反，若未采用这些预训练程序，则前额叶失活不会损害此类转换²⁰。
   1. 开始对动物进行“反应任务”测试，该任务强化动物在与其侧向偏好相反的杠杆上做出反应，而不考虑刺激灯（线索）是否点亮。“反应任务”是此序列中的“设定”任务。
      1. 按照上述步骤 4.2.2（反应任务）中详述的方法进行测试。
      2. 由于该任务为“设定”任务，需让动物至少完成 30 次试验。
   2. 在动物达到“反应任务”标准后的第二天，将其转换至“线索任务”进行测试，该任务强化动物在被点亮的刺激灯（线索）下方的杠杆上做出反应。“线索任务”是此序列中的“转换”任务。
      1. 按照上述步骤 4.2.1（线索任务）中详述的方法进行测试。当该任务作为“转换”任务时，无需完成最少 30 次试验。
4. 反应任务的反转。
   1. 开始对动物进行“反应任务”测试，该任务强化动物在与其侧向偏好相反的杠杆上做出反应，而不考虑刺激灯（线索）是否点亮。“反应任务”是此序列中的“设定”任务。
      1. 按照上述步骤 4.2.2（反应任务）中详述的方法进行测试。
      2. 由于该任务为“设定”任务，需让动物至少完成 30 次试验。
   2. 在动物达到“反应任务”标准后的第二天，对动物进行“反应任务”的反转测试，该任务强化动物在与前一任务相反的杠杆上做出反应，i.e.，对应其原始侧向偏好的杠杆。这一新的“反应任务”是此序列中的“反转”任务。
      1. 按照上述步骤 4.2.2 中详述的方法进行测试，唯一例外是现在被强化的杠杆位置等于动物原始的侧向偏好。

5. 行为学测量

1. 分别记录“设定”任务和“转换”任务中达到标准所需的试验次数。达到标准所需的试验次数是准确性的主要衡量指标，定义为完成连续10次正确试验所需的试验总数（包括这10次试验）。请注意，计算该指标时应排除遗漏试验的次数（例如，若一只大鼠需要100次试验才能达到标准，并发生了10次遗漏，则实际达到标准所需的试验次数为90次）。
2. 分别统计在“设定”任务和“转换”任务中达到标准之前所犯的错误次数。达到标准前的错误次数是准确性的补充性衡量指标，可能比达到标准所需的试验次数更敏感，且不受遗漏率升高的影响。
3. 针对转换错误类型，进一步分析在设定-转换序列中的“转换”任务所犯的错误类型。
   1. 当动物在“转换”任务中根据前一日“设定”任务的正确规则做出错误反应时，将该错误计为“持续性/回归性类型”。然后，按照以下指南将此类错误进一步划分为持续性错误和回归性错误。
      1. 将“转换”任务的测试阶段划分为每16个连续完成的试验为一个区组（不包括遗漏的试验）。在每个区组内，识别符合此类定义的错误，即，大鼠做出的错误反应符合“设定”任务的规则。每个16次试验的区组中，此类错误最多可能出现8次。
      2. 将识别出的错误记为持续性错误，直到某个区组内此类错误少于6次为止。
      3. 从下一个区组开始，直至任务结束，将此类错误记为回归性错误。
      4. 如果动物在多个测试日接受“转换”任务测试，则应将各日的区组视为连续的，继续进行错误评分。
   2. 当动物在“转换”任务中做出既不符合“设定”任务也不符合“转换”任务正确规则的错误反应时，将该错误计为“从未被强化类型”。
4. 针对反转错误类型，进一步分析在反转学习序列中的“反转”任务所犯的错误类型。反转错误从两个维度进行分类：（1）持续性错误与回归性错误；（2）朝向干扰刺激错误与远离干扰刺激错误。
   1. 将总错误数划分为持续性错误和回归性错误。
      1. 将“反转”任务的测试阶段划分为每16个连续完成的试验为一个区组。统计每个区组内的错误次数（每个区组最多可能出现16次错误）。
      2. 将错误记为持续性错误，直到某个区组内错误数少于10次为止。
      3. 从下一个区组开始，直至任务结束，将错误记为回归性错误。
      4. 如果动物在多个测试日接受“反转”任务测试，则应将各日的区组视为连续的，继续进行错误评分。
   2. 将总错误数划分为朝向干扰刺激错误（刺激灯亮起于错误且被按压的杠杆上方）和远离干扰刺激错误（刺激灯亮起于正确但未被按压的杠杆上方）。
5. 记录遗漏试验的次数，以作为动物动机水平的粗略衡量指标。
   1. 每次每日测试结束后检查遗漏分数，以排除设备故障的可能性，因高遗漏分数可能提示设备异常。
   2. 在排除设备故障的前提下，若动物在任一任务中的遗漏次数异常偏高（通常为超过平均值3个标准差及以上），则应将其遗漏数据予以剔除。
6. 通过测量杠杆伸出至动物做出反应之间的时间间隔来记录反应潜伏期。潜伏期可作为运动功能和/或信息处理速度的粗略指标。

结果

通过手术植入的灌注套管，将局部麻醉剂盐酸布比卡因（0.75%，0.5 µl）注入前边缘区，可在测试前约10分钟实现前额叶皮层的急性、可逆性失活²⁰。此外，可通过在第一项任务（“设定”）或第二项任务（“转换”或“反转”）期间进行失活处理，评估其对学习可能产生的普遍影响。图2展示了在执行线索-反应策略转换序列任务的动物中进行此类失活处理的结果。在第一天（线索/“设定”任务）对前额叶进行失活处理并未损害动物的表现（图2A），表明内侧前额叶皮层在初始辨别学习过程中并非必需。然而，在第二天（反应/“转换”任务）对前额叶进行失活处理则显著损害了动物的表现，表现为动物需要显著更多的试验次数才能达到标准表现水平（图2B）。当前额叶皮层被失活时，动物在转换任务中表现出更多的类似持续性错误，而非从未被强化的错误（图2C）。这些发现重复了以往关于内侧前额叶皮层在策略转换中重要作用的研究结果，特别是其在抑制先前已习得策略方面的作用^13,20。

相反，接受反应序列逆转训练的动物未表现出这种前额叶依赖性。在“逆转”当天接受前额叶皮层失活的动物，其初始反应辨别（图3A）以及随后的逆转表现（图3B）均与注入生理盐水的动物无差异²⁰。这些发现与先前的研究结果一致，表明在多种任务中，包括与本文所述相似的操作式任务，调控逆转学习的是眶额叶皮层而非内侧前额叶皮层^12,19,2627。

图 2. 前额叶皮层失活损害策略转移能力。 A， 接受生理盐水或布比卡因（Bupi）注入内侧前额叶皮层的大鼠在“设定”日完成初始线索辨别任务（“Set”）所需达到标准的尝试次数。前额叶失活对初始学习无影响。B， 在“转移”日接受内侧前额叶注射生理盐水或布比卡因后，大鼠在转向“反应”任务（“Shift”）时达到标准所需的尝试次数。前额叶皮层失活损害了向反应任务的策略转移。C， 动物在转移日所犯错误的类型。在转移任务前进行前额叶失活（“sal-bupi”组）导致类似持续性错误的数量增加。*，p < .05，与 saline-saline 组相比。本图经 Floresco 等²⁰ 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3. 前额叶皮层失活不影响逆转学习。A， 大鼠在初始反应辨别训练中达到标准所需的试验次数，这些大鼠随后在逆转训练前接受向内侧前额叶皮层注入生理盐水或布比卡因（Bupi）的处理。两者之间未见差异。B， 在内侧前额叶皮层注入生理盐水或布比卡因后，进行反应辨别逆转期间达到标准所需的试验次数。前额叶失活并未损害逆转学习。该图改编自 Floresco et al.²⁰

数据如图所示 图4 提供了一个示例，说明在策略转换之前要求大鼠执行基于旧规则的“提示”试验，有助于数据的解释。在此研究中（Enomotor 和 Floresco，未发表观察结果），大鼠在第1天学习视觉线索规则时的表现被匹配图4A）。 第2天，大鼠接受溶剂处理或0.2 mg/kg氟哌啶醇。在第2天测试阶段开始时，大鼠需根据第1天习得的视觉线索规则进行20次试验，随后在测试中途转换为反应辨别规则。如图所示 图4B，该处理在实验阶段的前20次提示试验中损害了视觉线索规则的提取。随后，经氟哌啶醇处理的大鼠达到标准所需的试验次数较少（图4C） 且 perseverative 错误更少（图 4D） 策略转换. 需要注意的是，如果我们未在转换前使用提示试验，这些数据可能会被解释为氟哌啶醇改善了集合转移能力。然而，规则提取阶段出现的损伤提示，这些效应更应被理解为对先前习得规则的记忆受损，这可能导致大鼠在学习新规则时反应冲突减少，从而表现出更快的转移。

图4. 氟哌啶醇处理导致规则提取受损但促进任务集转换。A， 大鼠在次日进行策略转换前，分别接受溶剂（生理盐水）或多巴胺D2受体拮抗剂氟哌啶醇（0.2 mg/kg）处理后，在视觉线索辨别任务中达到标准所需的试验次数。两组动物在给药前的表现相当。B， 在第2天测试开始时，大鼠接受20次提示试验，要求其继续使用第1天的视觉线索规则进行反应。氟哌啶醇处理显著降低了这些提示试验中的准确性。C， 在20次提示试验后，任务规则在会话中途转换为反应辨别。接受氟哌啶醇处理的大鼠在转换过程中达到标准所需的试验次数更少。D. 氟哌啶醇处理还减少了持续性错误。尽管这些数据可能提示表现改善，但在B中显示的规则提取障碍表明，表面上的“策略转换增强”更可能是由于先前习得规则的干扰减少所致。Enomoto 和 Floresco，未发表观察结果。 *，p < .05，与溶剂组相比。

新生期腹侧海马区损伤（NVHL）操作已被用于在大鼠中模拟精神分裂症的某些特征²⁸，特别是认知功能障碍^29,30。简而言之，在出生后第7天的大鼠海马区施加兴奋性毒性损伤，随后在成年期（出生后60天以上）进行行为测试。该模型模拟了精神分裂症假定的发育轨迹²⁸。图5展示了NVHL大鼠与对照组大鼠在“刺激预暴露”版本的策略转换—线索反应序列任务中的表现。 NVHL大鼠在学习第一条规则（反应/“设定”，图5A）时未表现出损伤，但在转换到新规则（线索/“转换”）时表现出显著缺陷，表现为达到标准所需试验次数明显增加（图5B）。此外，这种缺陷主要源于 perseverative errors（持续性错误）的增加，如图5C所示，提示存在前额叶功能异常^20,21。这些结果证实了既往研究中利用十字迷宫任务所发现的NVHL动物策略转换能力受损的现象²⁹。

与上述前额叶失活动物的数据类似，NVHL 动物在反转学习中并未表现出缺陷（图 6A,B），尽管其反应速度较慢（图 6C,D）。这一阴性结果表明，所观察到的策略转换缺陷并非源于在刺激之间进行简单切换的能力丧失²¹。

图5. 精神分裂症NVHL模型中的集合转移能力受损。 NVHL动物与假手术对照组动物在先前暴露的集合转移序列（从反应到线索）任务中的表现。A，NVHL动物在反应（“集合”）任务中表现未受损。B，然而，在视觉线索（“转移”）任务中，NVHL动物达到标准所需的试验次数显著多于假手术组。C，“转移”日的错误类型。NVHL动物的持续性错误多于假手术组动物，但在回归性错误或从未强化的错误上无差异。*，p < 0.05，与假手术组相比。该图改编自Placek et al.²¹

图6. NVHL损伤对反转学习无显著影响。A,B，NVHL组与假手术组动物在初始反应学习任务（“设定”）或反应反转任务的习得能力上无显著差异。C,D，NVHL组动物在“设定”和“反转”任务中的反应速度均慢于假手术组。该图改编自Placek 等²¹

最后，预实验结果表明，动物几乎无法学会线索任务的逆转。 即，按压杠杆 相反 被照亮的刺激光。在6只受试动物中，有5只在未达到标准的情况下完成了450次反转试验（3天），第6只动物则需要418次试验（Brady，未发表观察结果；数据未显示）。这可能是因为刺激光作为非常显著且具有吸引力的线索，使得大鼠极难将反应从其上转移。因此，不推荐使用此测试流程。

讨论

开发用于测量啮齿类动物高阶认知结构的行为任务，对于推进认知神经生物学知识至关重要。通过设计良好且经过验证的任务，可以在复杂程度上对啮齿类动物进行评估，其复杂性可与灵长类动物甚至人类相媲美。本文展示了如何利用自动化操作性技术，在啮齿类动物中研究执行功能的两个方面：策略转换和反转学习。使用这些自动化任务，我们重复了以往在十字迷宫和挖掘任务中关于策略转移和反转学习神经基础的研究结果^{11,13,18-21,27,29}，表明这些操作性任务是对上述认知结构的有效评估方法。

这些自动化任务相较于现有的非自动化迷宫穿梭和挖掘任务具有多项优势。最显著的优势在于自动化操作任务的数据采集效率更高。每天的训练或测试仅需30至60分钟，且全程由计算机控制，实验人员几乎无需干预。此外，通过多腔室操作装置可同时对多只动物进行测试。从行为塑造到最终测试的整个任务流程可在约2至3周内完成。自动化任务的另一重要优势在于能够精确控制刺激呈现，从而最大限度地减少实验者误差。例如，每轮试验中线索位置的呈现顺序由计算机随机化并控制，而非由实验者手动参照逐项试验列表进行操作。试验间的间隔时间被精确测量并保持一致，不会受到实验者操作所需时间的干扰。 例如，从十字迷宫中移出一只大鼠或重新排列挖掘容器。强化物的递送是自动的，不受实验者操作误差的影响（例如，忘记在十字迷宫的正确臂中放置诱饵）。数据收集也得到类似改善，可自动记录反应模式，包括精确测量反应潜伏期。在不存在其他运动异常的情况下，反应潜伏期的变化可用于推断信息处理速度的改变，和/或判断任务的认知复杂程度^21,22.

自动化任务还保留了十字迷宫任务的一个重要优势：能够对转换日或逆转日所犯错误的类型进行详细分析。区分那些重复前一天策略的策略转换错误（即持续性或回归性错误）与代表此前未尝试过策略的错误（即从未强化过的错误），有助于刻画行为灵活性方面的特定缺陷。特别是，测试早期出现的持续性错误反映了动物无法放弃先前策略，而后期出现的回归性错误则反映了在持续性行为停止后，动物无法维持新策略的能力²⁰。从未强化过的错误可能表明动物未能习得新策略，或无法根据规则进行系统性的反应²⁰。以往研究^16,17,20已证明这些错误类型具有可分离的神经解剖学基础，这对解读此类任务的结果同样具有重要价值。

我们的实验流程是针对大鼠开发并优化的。尽管如此，其他研究团队已采用类似流程来检测小鼠的策略转换能力³¹。然而，由于物种差异，对小鼠需进行某些调整，包括在杠杆伸出前延长视觉提示灯的呈现时间、每天进行30次试验并持续多天训练，以及在错误选择后引入超时惩罚。尽管这些调整使该检测方法在药理学干预实验中的适用性降低，但其可能有助于评估基因修饰小鼠的认知灵活性（尽管尚不明确这些调整是否能够保留该任务对前额叶皮层功能的敏感性）。

当然，这些任务也存在一定的局限性。其中一些局限性源于任务的自动化特性，而另一些则与任务本身的参数有关。就后者而言，本文所描述的转换任务（以及跨迷宫转换任务）²⁶）使用的刺激和反应范围有限。与挖掘任务不同，后者使用新颖的样本（例如，不熟悉的气味或挖掘介质）可在每个阶段用于构建新的注意集^11,19操作性设定转移任务必然要求动物在两个熟悉的刺激之间进行选择——即左侧与右侧线索灯，或左侧与右侧位置。这意味着操作性任务与交叉迷宫设定转移任务均涉及反应冲突以及策略转换，尽管两者都保留了将策略转向新的、先前无关刺激维度这一核心概念。^20,23需要注意的是，此处所述的设定转移和反转操作任务不允许引入第三种刺激维度，而挖掘任务则可能包含挖掘介质、气味和质地三个维度。^11,19然而，我们并不认为这是一个致命缺陷，因为操作性策略转换任务仍然要求动物抑制先前相关的辨别策略，并转而关注先前被忽略的刺激维度。此外，通过修改设备和任务参数，或许可以引入第三个刺激维度，例如听觉线索或气味，尽管这些增加可能会使学习过程更加困难，并降低其在单日药理学测试中的适用性。

最后，任何基于操作性条件反射任务的潜在局限性在于会丧失关于大鼠行为的直接信息—— 即实验者不再直接观察大鼠。我们认为，自动化在客观性和数据采集速度方面带来的优势足以弥补这一不足，而如果需要恢复对个体的视觉观察，可在操作箱内安装摄像头，这是一种相对简便的解决方案。

为最大限度提高使用这些操作性任务的成功率，可采取若干步骤。首先，训练开始前对动物进行充分的抓握和适应处理至关重要；与任何行为学任务一样，经过良好处理的动物更易于操作，应激水平较低，且通常产生更稳定的数据。其次，可能需要进行一些预实验，以确定一天中最佳的测试时间；我们在光照周期内进行测试，发现当动物在该周期接近结束时接受测试，其表现最为理想。例如，大约为光照周期结束前3小时（例如光照周期在下午7:00结束，则训练时间约为下午4:00）。第三，必须确保动物在进入下一训练阶段前，已在每一预训练阶段达到稳定的表现。例如，在可伸缩杠杆训练阶段表现出持续且强劲的反应行为，是动物在后续“设定”辨别任务中表现良好的重要预测指标。关于实验设备，尽管所有操作步骤均已自动化，但仍需实验人员定期干预，以确认各组件均处于正常工作状态。例如，应每天（或在测试动物数量较多时每日多次）运行设备检查程序，确保所有灯光、杠杆及奖励递送系统均正常运作。尤其需要注意的是，奖励递送系统（特别是颗粒饲料分配器）的故障会显著影响动物表现。若某日出现异常高的遗漏次数，可能提示奖励递送设备存在问题，因此实验人员应每日检查数据输出，且该人员需熟悉任务流程及预期的表现水平。若排除设备故障，高遗漏率可能提示动物动机不足或健康状况存在问题。若动物整体健康状况良好，可短暂增加食物限制程度，使动物体重降至自由进食体重的80–85%，直至其表现恢复。

这些策略转换和反转任务可应用于多种实验范式中。例如，可用于研究诸如脑损伤、发育期处理、饮食干预、长期药物治疗或基因修饰等操作的影响。尽管处理对策略转换或反转阶段的影响可能是主要关注点，但需注意，由于此类慢性或永久性处理必须在训练开始前施加，因此也必须考察其对表现多个阶段（尤其是初始辨别或“定势”阶段）的影响²¹。急性干预手段，如药物处理或暂时性神经解剖学失活，尤其适用于这些任务。在此类实验中，增设第三个对照组（如图2所示）是十分有益的：主要实验组在策略转换或反转当天接受目标干预，一个对照组在初始辨别或“定势”阶段当天接受相同干预，以检测干预对学习的广泛影响，而第二个对照组则在两天均不接受干预（或接受假处理）^20,22。需要注意的是，在此类急性干预研究中，建议根据大鼠在初始定势学习阶段的表现进行匹配，并据此将其分配至实验组和（第二个）对照组，以最大限度地避免因个体间学习辨别刺激能力的差异而混淆处理引起的性能差异。此外，若实验需在数周或数月内分批测试多个队列，则每个队列均应包含所有实验组的动物。例如，一项研究急性药物干预在策略转换期间效应的实验，总共可能需要48只大鼠，分为3个实验组，分三批进行测试，每批16只动物。在此情况下，每批应包含每个实验组5至6只大鼠。理想情况下，统计分析应包含一个因素，以确认各批大鼠之间在行为表现上无显著差异。最后，由于此类操作性任务具备受控环境、刺激呈现与反应时间精确、动物活动受限等特点，而这些特点在十字迷宫或挖掘任务中不可用或不切实际，因此这些任务特别适用于应用体内记录技术，包括微透析、伏安法和电生理学记录。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带可伸缩杠杆的行为实验箱套装	Med Associates, Inc.	MED-008-B2	所需组件包括两个可伸缩杠杆、两个刺激灯、笼内照明灯和强化物递送系统
MED-PC 软件	Med Associates, Inc.	SOF-735
MPC2XL 软件	Med Associates, Inc.	SOF-731	用于将原始数据导入 Excel 格式的数据传输工具
无尘精密颗粒饲料，45 mg，含糖	Bio-Serv	F0042