大鼠颈髓扩散成像

摘要

本实验方案的目标是获得高质量的大鼠脊髓扩散加权磁共振成像（DWI），以无创表征组织微结构。本方案描述了磁共振成像序列、射频线圈及分析方法的优化，以实现无伪影的扩散加权成像。

摘要

磁共振成像（MRI）是无创评估脊髓状态的先进技术，可用于疾病或损伤情况下的诊断与预后判断。扩散加权成像（DWI）对水分子的热运动敏感，能够推断组织微结构信息。本报告描述了一种在小型动物专用系统上获取和分析大鼠颈段脊髓扩散加权成像的实验方案。该方案展示了活体麻醉动物的成像设置，并推荐了一套高质量成像的DWI采集流程，包括脊髓固定和呼吸运动控制。实验中采用不同方向和强度（b值）的扩散加权测量。最后，利用多种数学模型对所得信号进行分析，生成反映脊髓组织内扩散过程的图谱，从而揭示正常脊髓的特征，并可用于无创监测损伤或疾病进程。

引言

磁共振成像（MRI）是一种无创性工具，可在健康和疾病状态下观察大脑和脊髓。MRI 已彻底改变了临床诊断，但它同时也是实验室研究的重要工具。神经系统损伤或疾病的动物模型为理解其病理生理机制以及加速治疗策略的发现提供了平台。在本报告中，我们展示了将 MRI 应用于脊髓损伤大鼠模型，通过扩散张量成像（DTI）来探索微结构损伤的潜在影像学生物标志物¹。潜在影像学生物标志物的发现将有助于脊髓损伤患者的诊断与管理。这些标志物有望在临床前模型的治疗发现中发挥作用，并推动其向临床应用转化过程中的观察与预后评估。

DTI 是一种专门的 MRI 形式，用于测量水分子的微观运动（即 弥散）。由于神经系统中存在轴突，其内部的弥散沿轴突方向明显快于垂直方向，因此DTI在神经系统中具有显著优势，可提供有关轴突取向和微结构组成的信息。由DTI导出的标量指标包括反映组织内总体弥散程度的平均弥散率（mean diffusivity, MD），以及反映弥散方向依赖性的分数各向异性（fractional anisotropy, FA）^2,3，已广泛应用于健康与疾病状态下 nervous system 微观结构的表征⁴这些指标揭示了通过大多数其他磁共振成像方法无法观察到的微观组织特征。先前的研究表明，DTI能够检测大鼠胸段脊髓损伤后颈段脊髓内远端的微结构变化。¹损伤灶远端的DTI改变可能反映了整个脊髓对损伤的反应，且有可能作为继发性损伤的生物标志物。

在活体大鼠脊髓成像过程中存在若干独特的挑战。其中最显著的是，脊髓会受到呼吸运动的影响，因此需要采用多种方法并加以仔细控制，以最大限度地减少运动伪影。在以往的研究中，固定装置被用于在扫描期间消除脊柱的移动⁵。对于颈段脊髓的成像，我们采用头部固定器和耳杆等物理约束装置，这类装置可减弱但无法完全消除由呼吸引起的运动。此外，我们采用一种定制的呼吸门控方案，以高效地将图像采集与呼吸周期同步。这些改进措施能够有效消除因呼吸引起的大范围整体运动所导致的伪影⁶。扩散加权成像（DWI）对微观运动高度敏感，包括脑脊液流动和血流搏动，而此类较小的运动干扰源也可通过呼吸门控方案得到缓解。另外，脊髓的横截面积较小，仅占成像视野的一小部分。在颈段脊柱成像中，由于脊髓位于动物体内较深的位置，因此需要使用具有足够信号穿透能力的圆柱形射频线圈，才能实现高分辨率的颈段脊髓成像。通过外周容积抑制（OVS）技术可减小成像视野，该方法还可抑制或破坏来自脊髓以外组织的信号。这一被称为扰相梯度或外周容积抑制的方法，同时也有助于降低这些组织中残余动物运动、脑脊液流动或血流搏动可能带来的信号污染。

脊髓的结构特点也可用于简化成像方案。脊髓白质（WM）中的轴突几乎全部平行于脊髓的主轴方向排列。因此，与脑部弥散加权成像（DWI）需要沿至少6个方向进行测量以确保结果不受磁体内部位置影响（该过程称为弥散张量成像）不同，脊髓的测量仅需沿平行和垂直于脊髓的两个方向进行^7,8，下文分别称之为纵向和横向。因此，可以在两个方向上分别测量扩散率及其他参数，从而对正常或疾病、损伤状态下组织的微结构进行推断。

方案

注意：伦理声明：所有实验程序均已获得威斯康星医学院和克莱门特·J·扎布洛基退伍军人事务医疗中心的机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. 动物准备与监测

1. 将大鼠置于诱导室中，使用5%异氟烷与医用空气混合气体进行麻醉。当翻正反射消失，且挤压后肢足垫无回缩反射时，将麻醉浓度降至2%，并将动物以头先进俯卧位转移至扫描仪床。整个过程中通过鼻罩装置维持2%异氟烷麻醉，医用空气流速保持约1 L/min。在麻醉期间，向大鼠眼部涂抹少量润滑眼膏，以防角膜受损。
2. 将呼吸监测带牢固地环绕于大鼠躯干，并连接至呼吸门控系统。在将大鼠推入扫描仪孔洞前，检查呼吸监测计算机，确保呼吸周期清晰且稳定。必要时调整监测带位置，此步骤对图像质量至关重要。
3. 通过直肠探头和暖风加热系统监测并维持动物体温在37 °C。通过调节麻醉浓度在1.2%至2%之间，将呼吸频率维持在每分钟30–45次。
4. 将大鼠置于头部固定装置中，使用咬合杆和旋入式耳杆（图1），并将头部滑入四通道容积线圈，直至颈椎位于线圈中心。
   注意：大鼠的肩部可能限制其进一步进入线圈。
5. 将大鼠及其支撑装置推入扫描仪孔洞。如适用，根据线圈供应商提供的说明，调节线圈的调谐和匹配电容至适当的频率和阻抗。

2. MRI 扫描参数

注意：此处描述的实验步骤采用的是9.4 T水平孔径小型动物成像系统，但也适用于其他场强的小型动物MRI系统。

1. 使用 MRI 系统的自动化程序检测共振频率，迭代优化磁场均匀性（匀场），校准射频功率，并调整接收增益。
2. 通过系统的软件界面获取默认的三平面定位像扫描，以确保正确的位置。
   1. 点击“新建扫描”，选择 tripilot，然后点击“交通灯”图标以采集图像。
   2. 确保颈椎中心与磁体中心及 MRI 线圈中心对齐。为将脊柱置于磁体中心，可前后推动扫描床，并重新采集定位像以验证位置。
   3. 如需调整颈椎相对于 MRI 线圈的位置，需将扫描床从磁体中移出进行重新定位。如有必要，重复此过程直至位置一致。若动物被重新定位，则需重复步骤 2.1。
3. 在当前成像协议中添加一个新的平面回波扩散加权自旋回波序列（DtiEpi）。
   1. 使用 DWI 序列配置并采集扩散加权图像，除以下设置外，其余均采用默认参数：
   2. 打开层面位置图形界面，设定 12 个层面，层厚为 0.75 mm。将层面方向设为垂直于颈髓主轴。使用小脑基底部作为内部参考，以确保不同动物或不同扫描会话之间的层面位置一致。
   3. 将饱和带设为“开启”。在脊髓外侧设置 4 个厚度为 10 mm 的饱和带，以最小化这些组织的信号并减少其可能引起的伪影（图 3）。将呼吸门控（“触发模块”）设为“开启”。
      注：自定义呼吸门控需要具备脉冲序列编程的知识与经验。若不具备该条件，可采取替代方案：将层面数减少至 3–5 层，TR 缩短至 1 s，以确保所有层面均在动物呼气间期完成采集。随后对另一组层面重复完整序列，以覆盖整个颈髓区域。
   4. 点击工具箱图标，然后点击“编辑方法”。将 EPI 分段数设为 4。将相位编码方向改为左右方向。其他默认设置应为：回波间距 = 0.3234 ms，每 EPI 分段的总回波链长度 = 32。
      注：将相位编码方向设为左右方向而非前后方向，可减少来自其他结构的运动干扰。
   5. 采用以下几何参数设置：矩阵大小 = 128 × 128，平面内视野 = 25.6 × 25.6 mm，从而获得平面内空间分辨率为 0.200 × 0.200 mm。确保层厚 = 0.75 mm。层面顺序 = “交错式”，层间间隙 = 0 mm。
   6. 采用以下扩散加权参数设置：DW 测量模式 = “DW 对比”，扩散梯度持续时间（δ）= 7 ms，扩散梯度间隔（Δ）= 12 ms，b 值数量 = 8，目标 b 值 = 0、250、500、750、1,000、1,500、2,500、3,500 mm/s²，扩散编码方向数 = 2，扩散加权方向 = [1 0 0] 和 [0 0 1]（设定为平行于和垂直于脊髓轴的平面内）。
      注：采用上述设置，我们实现了高达 3,500 s/mm² 的 b 值。由于扩散梯度持续时间（δ）和扩散梯度间隔（Δ）依赖于梯度性能，硬件规格和其他系统性能可能限制 b 值的实现；本系统的梯度性能为：最大梯度强度：440 mT/m，最大爬升速率：3,440 T/m/s。对于峰度测量，建议使用 2 个 b 值，其中较高 b 值至少为 2,000 s/mm²。
   7. 采用以下时序参数设置：回波时间（TE）= 27 ms（通过输入 0 设为最小值），重复时间（TR）= 1,800 ms。
4. 执行已配置的序列。根据上述参数，总采集时间约为 25 分钟。
5. 在整个扫描过程中，监控呼吸门控软件，并调整“触发”信号（软件检测到呼气）与 MRI 系统信号之间的延迟时间，确保数据采集仅发生在呼吸周期的静止（无运动）阶段（图 2a，灰色线的稳定部分）。根据动物的呼吸模式，触发延迟通常需设置在 100–400 ms 之间。这有助于减少由呼吸运动引起的伪影（图 3e）。
6. 如条件允许，可重复该序列并启用自定义的“反向翻转”（reverse blips）模式，此操作将额外增加约 25 分钟的采集时间。
   注：若无法使用自定义的“反向翻转”序列⁹（步骤 3 中用于校正磁敏感伪影），则只能使用单一 EPI 相位编码方向；而反向翻转序列的修改版本允许选择相位编码方向（从右到左或从左到右）。
7. 成像完成后，将动物从固定装置中取出并送回笼中。在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看护。

3. 图像处理

1. 直接从系统以 DICOM 格式导出数据（推荐），或使用自定义或第三方软件将数据转换为 NIFTI 格式。
2. 进行磁敏感伪影校正。
   1. 使用 FSL 或其他 MRI 软件包提供的工具，将每次扫描中的 b=0 图像提取到单个文件中。每种相位编码方向各需一个文件。
      注意：例如，如果每次扫描包含8次不同b值的扫描，且在横断方向上施加扩散加权，随后再进行8次在纵向方向上施加扩散加权的扫描，则图像文件中的b=0扫描位于第1个^st 和 9^th 体积，并可通过以下 shell 代码提取和组装：
      fslroi ${up}_dwi_masked.nii.gz temp1 0 1
      fslroi ${up}_dwi_masked.nii.gz temp2 8 1
      fslroi ${down}_dwi_masked.nii.gz temp3 0 1
      fslroi ${down}_dwi_masked.nii.gz temp4 8 1
      fslmerge -t blip_both temp1 temp2 temp3 temp4
      （其中 $up 和 $down 分别表示正常和反转相位编码方向的扫描）。
   2. 在 fsl 中使用 'topup' 命令^10,11 创建一个校正后的文件，以减少图像扭曲伪影。将此校正应用于原始DWI图像，用于生成参数图。
      注意：该命令的使用说明可在以下地址找到 http://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/TOPUP/TopupUsersGuide在此情况下使用该命令的示例代码如下：
      topup --imain=blip_both_nlmf_b0images_masked.nii --datain=../topup_data.txt --config=./b02b0_ratspine.cnf --out=topup_splines_nlmf --iout=$out --verbose --logout=topuplog.log
      dwiup=`ls ${up}*dwi_nlmFilt.nii`
      dwidown=`ls ${down}*dwi_nlmFilt.nii`
      applytopup --imain=${dwiup},${dwidown} --datain=../topup_data.txt --method=jac --inindex=1,$ind --topup=topup_splines_nlmf --out=DWI_${out} –v
      在 ${FSLDIR}/etc/flirtsch/b02b0.cnf 中复制并编辑默认文件，通过将 --warpres 和 --fwhm 行中的每个值均缩小至原来的十分之一，以适配大鼠脊髓。
3. 如果沿至少6个非正交方向采集了具有扩散加权的图像（在Paravision中使用DTI方案或类似的自定义设计），请使用fsl的Diffusion Toolbox等软件包¹² 或 Camino¹³ 用于计算标准DTI参数图。若无法实现，则采用仅沿两个方向进行扩散加权的自定义流程来生成有用的指标，例如从步骤3.4起所述方法。
4. 将 TOPUP 校正后输出的 DWI 文件载入 fslview，并选择“文件 -> 从菜单中选择“Create Mask”。使用铅笔工具在一种组织类型内绘制感兴趣区域（例如 GM、背侧 WM 或腹外侧 WM）。保存此文件，并对其他需要的感兴趣区域重复此步骤，以供后续使用。
   注意：已有文献记录其他从脊髓中分割感兴趣区域（ROIs）的方法^14,15 对于高级用户而言，这可能更为合适。
5. 使用 ROI 文件对 DWI 文件进行掩膜，然后通过以下命令计算每个图像体积中 ROI 内的平均信号：
   fslstats -t DWI_corrected.nii.gz -k GM_mask.nii.gz –M
6. 将前8个结果复制到MATLAB等数值计算程序中，作为横向信号的向量（例如命名为sig_T），将后8个结果作为纵向信号的向量（sig_L），其中8为所使用的b值数量。
   1. 将b值作为包含8个b值的向量复制到数值计算程序中。横向与纵向方向的b值相同。如果可能，应从扫描仪中获取有效b值而非标称b值，该值在步骤2.3.5的参数窗口中列为“Effective B value”。
   2. 在命令提示符中输入 cftools，使用数值计算程序的曲线拟合工具箱将信号与b值数据按所需模型进行拟合。操作时，点击“Data…”并选择信号向量作为y数据，b值作为x数据。点击“Fitting…”，在“拟合类型”下选择“自定义方程”，然后点击“New”和“General Equations”以输入拟合方程。
7. 为适配标准扩散模型，输入以下方程：
   S0.*exp(-x.*D)” (1)
8. 拟合包含扩散和二阶项（峰度；K）的模型，以测量对高斯扩散的偏离程度¹⁶，输入方程：
   S0.*exp(-x.*D+(1/6).*(x.*D).^2.*K) (2)
9. 单击“确定”和“应用”。在输出窗口中观察扩散率（D）和峰度（K）的估计值。在“数据集：”选择器中，选择用于公式（1）或（2）的 sig_T（或 sig_L）数据，然后单击“应用”。
10. 使用横向和纵向扩散系数计算各向异性指数（AI）：
    AI=(D_L- D_T)/(D_L+D_T)   (3)
    这类似于从DTI模型计算得到的分数各向异性（FA）。也可利用横向和纵向峰度替代扩散率，计算峰度的各向异性指数。
    注意：该方法可提供模型参数（如 K）的数值_T，D_T，等等。还可以使用曲线拟合工具箱的命令行操作，对脊柱内的每个体素进行拟合，从而生成模型中各参数的参数图。其他拟合方法也可使用，相关细节见其他文献。¹⁷

结果

正确的操作步骤可最大限度地减少运动伪影，从而获得高质量的大鼠颈髓扩散加权图像。通过使用定制的呼吸门控（图2）、抑制脊髓外组织的非目标信号（图3B和3C），以及进行磁场敏感性失真校正，可获得如图4和图5所示的扩散加权图像。操作不当或未进行门控采集的图像将产生鬼影伪影（图3E），而正确门控的图像则无此类伪影。

对12个层面的扩散加权图像进行视觉检查，可以揭示与脊髓微结构相关的特征。具体而言，组织中扩散越快，在扩散加权图像上的信号丢失就越明显，且随着扩散加权程度（b值）的增加，这种信号衰减会进一步加剧。当扩散加权方向垂直于脊髓轴时，脊髓周边的白质呈现较高信号，因为在此方向上轴突周围的扩散速度较慢且受到限制。相比之下，脊髓中央区域的灰质信号较暗，因其由轴突和细胞体组成，这些结构并非全部沿单一方向排列。而当扩散加权方向平行于脊髓轴时，白质呈现较暗的信号，因为沿轴突方向的扩散速度较快；此时灰质则相对更亮。需要注意的是，不同b值下的扩散加权图像分别显示，因为在不同b值下，平行和垂直方向的扩散加权对白质与灰质之间的对比度表现最佳。

通过数学形式化方法整合所有弥散加权图像，可生成弥散参数的图谱。分别绘制白质和灰质的平均信号随平行方向和垂直方向弥散加权因子（b值）的变化曲线。这些定量数据进一步支持了图4中所示的弥散加权图像。具体而言，白质的信号对弥散加权方向（纵向或横向）具有显著依赖性，而灰质对方向的依赖性较弱。类似地，通过弥散峰度方程对每个体素的信号进行拟合，可获得弥散参数的定量图谱（图6B），这些图谱同样突显了这种方向依赖性。白质在弥散（AID）和峰度（AIK）测量中均表现出高度的各向异性。因此，横向弥散和峰度揭示了脊髓的潜在微观结构，这与组织学研究结果一致。这些在活体但麻醉动物中获取的弥散参数，反映了诸如轴突密度和直径等微观组织特性。由损伤和疾病引起的这些参数变化，将有助于无创评估损伤后果及潜在治疗手段的效果。因此，大鼠颈段脊髓的弥散加权成像有望成为脊髓损伤及脊髓疾病临床前研究的工具。

图1：用于颈脊髓MRI的线圈及固定装置设计。 采用定制的正交体积线圈（Doty Scientific Inc）对颈椎进行成像，具有高灵敏度和均匀性。通过图示的气体接口向鼻锥输送麻醉气体和医用空气，鼻锥舒适地贴合在大鼠鼻部周围。呼出及多余的气体在轻微负压下由排气管收集。大鼠头部通过置于门齿周围的咬杆以及轻柔插入耳道内的耳杆固定。其他生理监测组件，包括呼吸监测仪和温度探头，未在图中显示。

图 2： 呼吸门控方案。图中示意性地显示了来自门控单元的典型呼吸信号（灰色）和触发信号（红色）（A）。在典型的门控实施方式（B）中，使用单个触发信号在重复时间（TR）内均匀分布的时间点上采集所有层面（垂直线；此处显示12个层面）。如果TR超过典型的呼吸周期，则多个层面可能在一次呼吸过程中被采集，因而易受运动影响（红色）。在改进的方案（C）中，触发后迅速采集一部分层面（此处显示6个），随后加入延迟，其余层面在下一次触发后采集。通过重新安排序列内的延迟，两种方案的有效TR保持一致。

图3： MRI切片定位、饱和带及运动控制。 在定位像（A）上排列了12个轴向切片，最前部的切片位于脑干与小脑交界处前方一个固定距离的位置。添加饱和带（B）以消除感兴趣区域外的非预期信号。一幅无扩散加权的图像（C）和一幅采用定制门控方案的扩散加权图像（D）清晰显示了脊髓的解剖结构，且无伪影。若使用非优化的门控方案或呼吸门控不当，扩散加权图像会出现伪影（E），表现为脊髓内部信号丢失，或脊髓外部出现多个“重影”，从而影响后续分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：典型的弥散加权图像。 通过采用文中所述的优化方法，获得了高质量的弥散加权图像，其中弥散加权方向分别垂直（A）和平行（B）于脊髓主轴。为清晰展示白质与灰质之间的对比度，每种方向均展示了提供最佳对比度的不同b值图像。对于每个方向或b值，全部12层切片均在约90秒内完成采集。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：相位编码反转校正过程。 左侧一列显示的是按照本实验方案所述扩散加权成像（DWI）序列获取的单个切片图像（“正向”图像）。中间一列显示的是将“反向梯度回波”设置为“开启”后再次采集的序列图像。请注意，第一幅图像中被拉伸的结构在中间列中呈现为压缩状态。右侧一列显示的是使用 TOPUP 进行校正后的扩散加权图像。最上一行为非扩散加权图像，中间一行为在横向施加扩散加权的示例，最下一行为在纵向施加扩散加权的示例。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：扩散度与峰度的计算图谱。归一化信号（图像强度）被绘制为扩散加权（b值）的函数，分别对应横向（T）和纵向（L）扩散编码方向（A）。基于每个体素的信号计算出高质量的扩散度（D）、峰度（K）和各向异性（AI）图谱（B），揭示了脊髓组织的独特特征。具体而言，白质与灰质之间的参数存在明显差异，且白质区域内部也呈现出区域性差异。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述技术可提供高质量的大鼠活体脊髓扩散加权成像。图像质量受多种因素影响，但脊髓存在若干独特的关键问题。

运动是一个重要问题，若不加以校正，将导致图像无法使用。因此，在磁共振成像（MRI）扫描过程中必须仔细监测。如果在初始扫描中观察到与运动一致的图像伪影，应立即停止扫描并采取措施消除伪影，因为这些伪影在后期处理中很难去除。确保呼吸计算机能够从呼吸监测装置接收到稳定且规律的信号。呼吸带可能需要调整至适当的张力，以提供稳定的信号，同时不阻碍动物的呼吸。应始终维持合适的麻醉深度；根据我们的经验，可使用1.5–2.0%的异氟烷。同样，减少动物整体及脊柱的运动是获得无伪影图像的另一个重要方面。与人类脊髓不同，啮齿类动物的脑脊液（CSF）搏动主要与呼吸周期相关，而非人类那样显著受心动周期影响¹⁸。尽管完全消除脊髓的所有运动十分困难，但尽可能减少运动至关重要，这通常需要通过反复尝试来实现。此外，患有各种神经系统损伤或疾病的实验大鼠可能具有异常的呼吸频率或其他生理并发症，可能需要对本文所述的操作流程进行相应调整。

针对呼吸门控对脉冲序列进行的修改，以及为此目的量身定制的图像重建流程，可最大限度地减少由非均匀磁场引起的失真影响，而这些失真无法通过磁共振成像系统自身的调节完全消除。

同样，图像质量取决于成像时间的长短。在本示例中，将扩散加权方向限制为仅两个方向，可缩短总成像时间。该方法的一个局限性在于，其不再适用于完整的张量分析（DTI），而DTI是许多其他研究中的常规方法。 alternatively，采用较少的信号平均次数但增加扩散方向或b值的数量，可在保持相同采集时间的同时实现更优的表征效果。既往研究表明，双方向方法所提供的信息与六方向（DTI）方法具有一致性¹⁹，但必须注意确保扫描层面（及扩散方向）精确地平行或垂直于脊髓。然而，采集多个b值有助于更准确地表征并进行数学拟合以计算峰度，因此建议优于仅使用单一b值。此外，整个序列以反转的相位编码方向重复采集，这可减轻磁场敏感性伪影的影响，并通过信号平均提高整体图像质量。最后，本方案所采用的图像分辨率能够清晰区分白质与灰质。尽管可实现更高分辨率的成像，但这通常会以延长扫描时间或增加伪影风险为代价。

射频线圈、脉冲序列以及后处理方法的改进，将在该方法未来的应用中提升脊髓成像的质量。例如，表面线圈可能有助于提高图像质量，其效果类似于在小鼠中所观察到的结果。²⁰ 这些技术措施极有可能作为生物标志物，用于脊髓损伤的临床诊断与管理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小型动物成像射频线圈	Doty	SAIP400-H-38-S
呼吸门控系统	SA Instruments	1030
磁共振扫描仪	Bruker	Biospec 94/30 USR