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方法文章

通过固相树脂法合成不对称二茂铁衍生的生物共轭体系的方法学

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DOI：

10.3791/52399

⸱

2015年3月12日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Texas Christian University

本文内容

摘要

使用溶液法合成不对称的二茂铁化合物具有挑战性。本报告重点介绍通过固相合成法，采用简便且洁净的反应制备二茂铁-生物素生物偶联物的方法。实验表明，引入硫醇盐基团可赋予该化合物在金表面固定化的能力。

摘要

早期检测是大多数疾病成功治疗的关键，对于多种癌症的诊断和治疗尤其至关重要。目前最常用的技术是成像方法，如磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）和计算机断层扫描（CT），这些方法在了解疾病的物理结构方面具有优势，但由于使用造影剂以及总体成本较高，通常每四到六周才能进行一次。鉴于这一限制，开发可在临床医生诊室中及时评估疾病进展和/或治疗效果的“即时检测”技术（如生物传感器），将彻底改变现有的治疗方案1。为了探索基于二茂铁的生物传感器用于检测生物学相关分子2，本文描述了制备二茂铁-生物素生物共轭物的方法。本报告将重点介绍一种可固定在金表面的生物素-二茂铁-半胱氨酸体系。

引言

生物传感器是一种小型装置，利用生物分子识别技术作为选择性分析的平台，因其特异性、快速性和低成本而得到广泛应用。在生物分子检测领域，电化学生物传感器由于其结构简单、成本低廉且灵敏度高，处于该领域的前沿。1,3 这些传感器的总体结构由电极构成，电极上装有针对特定生物标志物的识别分子。当识别分子与生物标志物结合时，会引起局部电位或电流的变化，该变化可通过简单的测量手段检测。迄今为止，识别单元可包括酶、4-8 抗体9-12 全细胞，13-16 受体17-20 肽21-23 和 DNA24 并且主要集中在较大的生物分子上。25-28 该领域的研究工作主要集中于免疫传感器，其中将带有氧化还原活性核心（如二茂铁）的免疫球蛋白固定化，用于检测目标抗体。由于抗原/抗体使用过程中带来的复杂性，导致这些研究存在精密度差和耗时长的问题，因而未能应用于临床。1,3 近年来，人们对小分子（分子量小于1 kg/mol）的检测日益关注，这些小分子涉及生物医学、食品、环境以及国家安全等领域。29 最广为人知的生物传感器设备实例是自测式血糖监测仪，其采用丝网印刷的酶电极，并与掌上尺寸的安培计相连接。这些系统通常采用库仑法，通过测量葡萄糖氧化反应在一定时间内产生的总电荷量来实现检测。市场化设备必须具备便携性、耐用性及手持式设计，以便广大人群方便使用。

二茂铁等氧化还原标签对于溶液中生物标志物或小分子的电化学检测至关重要，因为大多数生物标志物本身不具备电化学活性。30-38 二茂铁是一种金属有机分子，是电化学领域的金标准，因此成为电化学生物传感器集成的理想选择。基于二茂铁的氧化还原活性物质因其分子尺寸小、稳定性好、合成简便、易于化学修饰、具有一定的亲脂性以及氧化还原电位易于调节等优点，已受到广泛关注。3,30-42 基于二茂铁核心的小分子已被广泛用作金属离子和小分子的检测剂。32-38,43 针对较大物种（如生物分子）的检测系统已采用将大分子抗体或免疫球蛋白与二茂铁衍生物结合的方法，后者被嵌入电化学表面。1,3,39,44 在每种情况下，Fe 的电位和电流强度III/FeII 氧化还原电对在分子偶联后发生改变，从而产生一种新的光谱信号，指示分析物分子的存在。这种变化源于环戊二烯基环的π体系与铁的d轨道之间发生的广泛重叠。如果π体系被修饰， 即， 发生衍生化或反应后，轨道相互作用随之改变，这将影响铁核，并可观察到铁的电位发生偏移III/FeII 一对40,45,46 这些特性使得该系统作为电化学免疫分析或生物传感器中的定量试剂具有吸引力。

为了制备适用于生物传感器功能的含二茂铁体系，最佳策略是将一个环戊二烯基（Cp）环修饰上针对目标分子的生物受体，同时将另一个Cp环作为分子连接臂与电化学读出装置或电极相连（图1）。这类不对称二茂铁衍生物的合成面临副反应的挑战，且易因分子间交联而生成二聚体或多聚体产物47。然而，通过形成酰胺键的偶联反应是将二茂铁与肽类及其代谢物等生物组分直接连接生成简单衍生物的最直接途径。因此，可将20世纪50年代Merrifield为肽合成首次开发的固相合成技术应用于含二茂铁的有机金属化合物。利用正交取代的1'-Fmoc-氨基-二茂铁-1-羧酸分子，本文构建并详细描述了一种包含受体部分（生物素）、电化学信号基团（二茂铁）以及固定化连接臂组分（半胱氨酸）的二茂铁体系。本文讨论了该生物偶联物的合成过程，并提供了其在金表面固定化的证据。本工作首次报道了一种由生物素、二茂铁和氨基酸组成的体系在金表面的固定化应用。

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方案

1. 生物素-Fc-半胱氨酸（1）的合成

  1. 用于制备树脂结合物1的固相方法。
    1. 将生物素负载的树脂（250 mg，0.145 mmol）放入带砂芯的注射器中，加入二甲基甲酰胺（5 ml）使其溶胀，并在实验室摇床上震荡20分钟。排出溶液，再用二甲基甲酰胺重复溶胀一次。
    2. 向注射器中加入4–6 ml含20%哌啶的二甲基甲酰胺溶液，震荡10–15分钟，以去除Fmoc保护基团。再用另一份4–6 ml哌啶溶液重复脱保护过程。随后依次用二甲基甲酰胺（3次）、二甲基甲酰胺:甲醇（1:1，3次）、甲醇:二氯甲烷（1:1，3次）、二氯甲烷（3次）洗涤树脂，每次约5 ml。取少量树脂珠（约10粒）进行茚三酮试验（+），加热后若出现蓝色则表明脱保护成功。
    3. 配制溶液：含1'-Fmoc-氨基-二茂铁-1-羧酸（203.3 mg，0.4350 mmol）、1-羟基苯并三唑水合物（58.8 mg，0.413 mmol）、二异丙基碳二亚胺（0.0673 ml，0.435 mmol）、二异丙基乙胺（0.0757 ml，0.435 mmol），以及二氯甲烷与二甲基甲酰胺的4:1混合溶剂。将此溶液吸入带砂芯的注射器中，在实验室摇床上轻柔震荡6小时。然后排出溶液，并按前述方法洗涤树脂。
    4. 按上述方法进行茚三酮试验（-）以确认偶联反应完成。尽管因含铁片段的连接使树脂珠呈橙色，茚三酮试验仍可用于有效验证偶联是否成功。
    5. 随后加入含20%哌啶的二甲基甲酰胺溶液去除Fmoc基团，并按前述方法进行洗涤。应使用茚三酮试验（+）验证Fmoc基团已被完全去除。
    6. 配制溶液：含Fmoc-Cys(Trt)-OH（254.8 mg，0.4350 mmol）、1-羟基苯并三唑水合物（58.8 mg，0.4125 mmol）、二异丙基碳二亚胺（0.0673 ml，0.4350 mmol）、二异丙基乙胺（0.0757 ml，0.4350 mmol），以及二氯甲烷与二甲基甲酰胺的4:1混合溶剂。将此半胱氨酸偶联混合液加入带砂芯的注射器中，轻柔震荡6小时，然后按前述方案进行洗涤。
    7. 使用茚三酮试验（-）确认偶联完成，随后用20%哌啶溶液去除Fmoc基团并进行洗涤。通过茚三酮试验（+）验证末端游离氨基的存在。
  2. 从树脂上裂解得到1。
    1. 配制TFA（9.45 ml）、水（0.25 ml）、1,2-乙二硫醇（0.25 ml）和三异丙基硅烷（0.1 ml）的混合溶液，加入注射器中，轻柔震荡4小时。
    2. 将所得红棕色溶液收集至离心管中，用气流缓慢蒸发除去TFA。
    3. 向离心管中加入冷的乙醚（约15 ml）以沉淀1，并轻轻搅动。通过离心（1 g，5分钟）分离产物。随后重复乙醚洗涤（总计约60 ml）和离心操作，得到呈红/棕色固体的1。

2. 1号样品的表征与分析

  1. 使用氘代甲醇（300 µl）中的1H（16次扫描） 和13C NMR（512次扫描）以及ESI-MS分析，确认其结构与图2所示的连接性和组成一致。
    预期结果如下：
    1H NMR谱图（CD3OD）δ/ppm：1.407–1.684（m，6H），2.245（t，2H），2.665–3.150（m，12H），4.015（t，1H），4.104（d，2H），4.274（q，1H），4.426（d，2H），4.479（q，1H），4.595（t，1H）；13C NMR谱图（CD3OD）δ/ppm：24.644（CH2），25.472（CH2），28.051（CH2），28.300（CH2），35.474（CH2），38.698（CH2），39.241（CH2），39.717（CH2），55.340/55.538（Cp环），60.286（CH），61.964（CH），62.521/62.821（Cp环），66.038/66.170（Cp环），69.153/69.328（Cp环），71.468/71.593（Cp环），76.466（CH），171.770（C=O），175.361（C=O）。
    ESI-MS（m/z）：实测值：639.00 [1+Na]+，理论值：639.1 [1+Na]+；HR-MS（m/z）：实测值：617.2049 [1+H]+，理论值：617.1622 [1+H]+。
  2. 对分离得到的1进行高效液相色谱（HPLC）和元素分析，以确认其组成。
    采用C8反相柱进行HPLC分析，流动相为100%甲醇，流速为0.5 ml/min。注：HPLC保留时间为3.198–4.674 min。

3. 将1固定在金表面上

  1. 将带聚合物背衬的金载玻片切割成约0.25英寸的正方形2.
  2. 用去离子水溶液填充一个50 ml烧杯 1 （约 1 mM）。
  3. 将金载玻片放入烧杯中，并用表面皿盖住。在室温下静置孵育过夜，不进行搅拌。
  4. 将金片从溶液中取出，并在空气中自然晾干。
  5. 使用扫描电子显微镜（或等效设备）获取扫描电子显微图像，以观察固定后的样品 1.

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结果

化合物1的树脂结合形式如图2所示。二茂铁组分的共价连接使树脂珠呈现橙色，该颜色在持续洗涤后仍保持不变，表明形成了含铁的固定化配合物，而非铁被树脂珠中的聚乙二醇（PEG）组分吸附所致。化合物1的游离树脂形式与树脂珠颜色完全相同。在将化合物从树脂珠上洗脱后，所得产物的纯度和收率（68%）显著优于常规溶液相方法。产物的元素分析表明，化合物1以三氟乙酸（TFA）盐形式被分离：C26H36FeN6O4S2·4TFA 的计算值（实测值）为：C, 38.07 (38.90)；H, 3.76 (4.20)；N, 7.83 (7.70)。基于元素分析结果，典型反应的最终收率为105.1 mg（68%）。在氘代甲醇中的核磁共振分析得到1H NMR 谱（CD3OD）δ/ppm：1.407–1.684（m, 6H），2.245（t, 2H），2.665–3.150（m, 12...

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讨论

在溶液中合成不对称二茂铁衍生物具有挑战性。例如，尝试在溶液中制备1时，目标产物的收率较低（低于20%）。同样，使用1'-氨基二茂铁甲酸（sans Fmoc）与固相载体结合的生物素进行反应时，得到不溶性产物，该产物与Baristic et al. 报道的聚合产物一致，且目标产物极少。47 此外，二茂铁及其衍生物对光敏感，而其氨基类似物在溶液中易发生二聚，进一步增加了反应难度。这些问题使得大量反应及后续处理变得困难。然而，可通过采用Merrifield首次开发的固相合成方法来规避此类反应性问题。二茂铁-肽类体系的合成已受到多个研究团队的关注，并已发展出一系列不对称肽-二茂铁体系的化合物库。46,48-52 本文所述工作详细描述了首例含生物素-二茂铁-半胱氨酸的不对称二茂铁生物共轭物的合成。该化合物可作为模型，用于探索其他小分子受体以检测生物学相关分子。在本研究中，该化合物被用作固定于金表面的连接臂。

合成的第一阶段是利用胺类连接剂将固定化的生物素核心固定在固相树脂上。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

KG 获得 R.A. Welch 基金会资助项目 P-1760 以及 TCU Andrews 数学研究所的支持 & 科学教育（资助对象：KG），TCU 研究与创造性活动资助（资助对象：KG）以及 TCU SERC 资助（资助对象：JHS）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Biotin Novatag 树脂NovaBiochem8550510001
TORVIQ 10 ml 鲁尔锁式带滤芯注射器FisherNC9299151
哌啶阿克罗斯P/3520/PB05
茚三酮试验Sigma-Aldrich60017-1ea
1’-Fmoc-氨基-二茂铁-1-羧酸Omm Scientific特殊订单
N,N′二异丙基碳二亚胺Sigma-AldrichD125407-5G
Fmoc-Cys(Trt)-OHNovabiochem8520080025
三氟乙酸Sigma-AldrichT5408
1,2-乙二硫醇Sigma-Aldrich2930
三异丙基硅烷Sigma-Aldrich233781
Eppendorf 管（20 ml）任何来源
甲醇任何来源使用前用分子筛干燥 &并储存于100 ml培养基瓶中以便使用
二氯甲烷任何来源使用前用分子筛干燥 &并储存于100 ml培养基瓶中以便使用
二甲基甲酰胺任何来源使用前用分子筛干燥 &并储存于100 ml培养基瓶中以便使用
离心机任何来源

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