光化学诱导大鼠后部缺血性视神经病变模型

摘要

本实验方案的目的是通过光化学方法在大鼠的视神经后段诱导缺血性损伤。该模型对于研究视神经后段缺血性病变的病理生理机制、此类及其他视神经病变的治疗策略，以及中枢神经系统其他缺血性疾病的机制至关重要。

摘要

后部缺血性视神经病变（PION）是临床实践中一种致盲性疾病。然而，其发病机制和自然病程至今尚不明确。 仍 poorly understood。最近，我们建立了一种可靠且可重复的PION动物模型，并在该模型中测试了某些神经营养因子的治疗效果¹本视频旨在演示我们建立的光化学诱导的后部缺血性视神经病变模型，并通过视网膜神经节细胞的逆行标记评估其效应。在手术暴露后段视神经后，静脉注射光敏染料赤藓红B，并将激光束聚焦照射于视神经表面。照射期间，赤藓红B与激光发生光化学反应，损伤血管内皮，引发由血小板血栓形成及水肿压迫介导的微血管闭塞。由此产生的缺血性损伤导致视网膜神经节细胞出现渐进性但显著的轴突退变，其原因是轴突输入丧失——这是一种远隔的、损伤诱导的、具有临床相关性的结果。因此，该模型为研究PION的病理生理过程提供了一个新颖的平台。 并可进一步优化用于视神经病变及其他中枢神经系统缺血性疾病的治疗策略研究。

引言

对于50岁以上的患者，缺血性视神经病变（ION）是急性视神经病变中最常见的类型²该病症可根据受累血液供应的具体来源表现为两种亚型之一。 临床表现：前部（AION）或后部（PION）³. 尽管AION的发病机制和病程 已被广泛研究^4-7，由于后部缺血性视神经病变（PION）发病率低、临床表现多样、诊断标准不明确且缺乏动物模型，其病理机制一直 poorly understood。此外，目前尚无任何治疗方法被证实可有效预防或逆转前部缺血性视神经病变（AION）或PION所致的视力丧失。因此，建立一种可重复且可靠的PION动物模型对于研究该疾病的发病机制具有重要意义 体内 并测试用于神经保护和轴突再生的新治疗方案。

光化学诱导的微血管缺血性损伤可导致血管源性水肿和血栓形成，从而有效引发局部组织缺血^8-12。将光敏染料赤藓红B注入血管循环后，在激光照射 靶血管时可产生活性单线态氧分子。单线态氧直接使血管内皮发生过氧化，促进血小板黏附/聚集，进而导致闭塞性血栓形成。由于血管源性水肿引起的微血管受压，缺血性损伤会向邻近区域扩散 并进一步加重 。本方案的总体目标是通过光化学方法在 球后视神经诱导缺血，以模拟PION所造成的损伤。

据我们所知，这是首个针对后段视神经缺血性损伤的模型¹。由于该模型在不造成物理创伤的前提下诱导缺血，因而能更真实地模拟并研究后段缺血性视神经病变的生理过程。此外，该模型为视神经病变及其他中枢神经系统缺血性疾病的候选治疗药物筛选提供了全新的平台。本文详细描述了在大鼠PION模型中进行股静脉插管、视神经暴露、静脉注射伊红B以及激光照射的完整实验方案。

方案

所有动物实验程序均经加州大学圣地亚哥分校和迈阿密大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并遵循ARVO关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明进行。手术中使用的所有试剂和仪器均为无菌。

1. 麻醉大鼠并进行手术准备

1. 手术前，根据大鼠体重，通过腹腔注射给予氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）进行麻醉。麻醉深度应通过脚趾夹捏刺激无反应来确认。
2. 麻醉成功后，将舌头向前牵拉以防止窒息，并在双眼涂抹润滑眼膏，以防手术期间角膜干燥。
3. 使用毛发剪剃除手术区域的毛发，并用10%聚维酮-碘洗涤剂溶液和70%乙醇各擦拭三次。
4. 将动物置于无菌区域内，并覆盖无菌巾。手术过程中使用无菌手套和无菌手术器械。在不同动物之间，需使用高温珠灭菌器对器械尖端进行重新灭菌。

2. 手术入路

1. PION 诱导
   1. 股静脉插管
      1. 准备并清洁手术区域。使用毛发修剪器剃除右侧大腿内侧的毛发，然后依次用10%聚维酮-碘消毒液和70%乙醇各擦拭三次。
      2. 准备导管。剪取一段40 cm长的聚乙烯导管（PE 10），该导管经70%乙醇灭菌。用生理盐水冲洗导管，并将其连接至含有预先量取的2%赤藓红溶液的1 ml注射器上。 B染料（1 μl/mg，给药剂量为20 mg/kg体重）。将注射器安装至脚踏开关控制的输注泵中，设定流速为600 μ升/分钟
      3. 使用15号刀片，在右侧大腿根部做一个小的横向切口。切开并撑开内部膜组织，用无菌棉签清洁该区域。
      4. 用镊子分离肌肉，直至可见股静脉的分支。动脉、静脉和神经周围包有筋膜鞘。捏住并向上牵拉此筋膜鞘。 用镊子（尖头Dumont镊）夹住，使用Vannas弹簧剪在三角形楔状组织基部附近剪开一个小切口（通常2-4 mm即可）。根据需要扩大切口。
      5. 用钝性显微外科钩沿静脉走向平行分离静脉与动脉。注意避免损伤脆弱的膜结构及静脉分支。随后，轻柔抬起静脉，将其与下方的结缔组织分离。
      6. 获取一根无针尼龙缝合线，将其放置于股静脉旁。使用显微外科钩抬起静脉，并将缝合线穿过 用精细尖头镊子在远端区域下方操作。抓住缝线一端，将其从静脉下方穿过，结扎远端静脉并扎紧。以相似方式将第二根缝线穿过近端静脉下方，并打一个松结。
      7. 在远端结扎处附近用Vannas弹簧剪在静脉上做一个小切口。必要时用尖头镊子扩大切口。可能会有少量血液从切口渗出。使用冰冷的无菌BSS溶液和无菌棉签清洁手术区域。
      8. 用持针器夹住切口边缘的静脉壁，将预先用生理盐水冲洗过的导管插入血管。收紧近端结扎线，将其固定在静脉和导管周围。随后，通过将导管与远端缝线打结，将其固定锚定。
      9. 通过按压脚踏开关注入生理盐水，检查导管插入的质量， <1 ml 即可。确保管路畅通无阻且无泄漏。暂时用缝线关闭切口，以保护导管插入部位及周围组织。
   2. 视神经暴露
      1. 用10%聚维酮碘消毒液和70%乙醇分别对左眼上方已剃毛区域擦拭三次，以准备手术部位。
      2. 用15号刀片在眼球后方2-3 mm处的皮肤上做一切口。用有齿镊夹起并提起结缔组织，使用Vannas弹簧剪做一小切口。该小切口通常长约5 mm，但可根据需要适当延长，以提供更充分的暴露视野 接受培训的外科医生。继续沿眶骨上缘钝性分离结缔组织，注意避免损伤血管。使用棉签清洁手术区域。
      3. 向下分离结膜，直至显露出上直肌。钳夹并分离该肌肉，使其从眼眶深部游离出来。此时可利用周围组织协助牵拉和抬高眼球，以利于视野的暴露。
      4. 向侧方和下方牵拉皮肤及结缔组织瓣，并用缝线和止血钳固定。这将使眼球向前外侧旋转，从而暴露包绕视神经的含脂肪鞘膜。
      5. 小心插入一对尖头镊子，沿视神经方向平行展开，以分离包裹鞘周围的结缔组织。切勿用镊子的尖端接触视神经。
      6. 此时应可见一段长约5 mm的视神经及其周围鞘膜。鞘膜表面的微血管网络环绕视神经，激光照射时将以此为靶点。
   3. 静脉注射伊红B与激光照射
      1. 始终佩戴橙色安全护目镜，以保护自己免受绿光激光的伤害。打开激光器，开启快门，并根据需要调节激光的峰值功率和平均功率。随后关闭快门。
      2. 将大鼠置于激光照射装置中。为确保光束准确定位，可通过将激光束经100 μm小孔进行空间滤波，产生一束较弱的瞄准光束 µ在闭合的快门叶片上钻一个直径为 m 的孔。使用精细镊子重新暴露视神经，并将瞄准光束对准视神经乳头后 3 mm 至 4 mm 处的眶内视神经。
      3. 注射2%伊红溶液 B 通过启动输液泵注入。在几秒钟内循环，同时外科医生添加少量BSS以湿润视神经表面。
      4. 验证瞄准光束的位置，然后点击脚踏开关以启动照射。显微镜光路中会立即触发一个橙色的安全滤光片，1秒延迟后快门随之打开。
      5. 照射视神经90秒 峰值功率为135 mW、平均功率为18 mW，由以250 Hz频率旋转且占空比为15%的光束斩波器产生（以最小化热效应）。视神经上表面将发出荧光，在安全滤光片下呈现为亮橙色，该荧光足以确保光束照射到位 神经对称地。
      6. 照射后，橙色安全滤光片将自动打开。在某些情况下可观察到微出血。
      7. 放松眼外肌的牵拉，将眼球恢复至中立位置。使用间断缝合关闭切口。随后拔出导管 结扎股静脉并扎紧，以防渗漏；采用间断缝合关闭切口。在两处切口处涂抹抗生素软膏。检查眼底，以确认视网膜中央静脉和动脉的血管完整性。
2. 逆行标记视网膜神经节细胞（RGCs） 注意：为了评估RGC 存活实验中，应在PION手术前一周完成氟金（Fluorogold, FG）逆行标记。该方法在文中已有详细描述。 乔维 方案 819¹³.
   1. 简要步骤：使用氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）麻醉动物，并剃除头部毛发。
   2. 手术刷洗切口部位，并沿头部中线做一切口以暴露颅骨。
   3. 在颅骨上钻出双侧孔洞（ø 距矢状缝和横缝均为 0.5 mm 的 2×2 mm 区域。
   4. 使用真空泵小心吸除上丘（SC）背侧表面的脑组织。然后，将一小块浸有4% FG的明胶海绵置于SC表面。
   5. 用缝线闭合切口，并按照标准术后护理程序对动物进行护理。
3. 术后护理与安乐死
   1. 手术后，将动物置于单独的清洁笼具中，并放置在循环加热水垫上，直至动物恢复。
   2. 术后镇痛剂（盐酸丁丙诺啡，0.01 mg/kg）应每天给药两次，连续三天，以减轻不适。
   3. 大鼠应单独饲养并密切观察，直至能够维持胸卧位并恢复足够的意识。
   4. 术后需每日监测恢复状况及健康体征，至少持续5天，或直至缝线拆除且手术部位充分愈合，以两者中较晚发生者为准。
   5. 在手术后根据研究需求选择科学合理的实验时间点，通过4% PFA灌注处死动物。

结果

该技术诱导的缺血性损伤会导致视网膜缺血性轴突损伤后，视网膜神经节细胞逐渐但显著地死亡。这是一种具有临床相关性的结果，类似于人类疾病中所观察到的现象。采用荧光金逆行标记法来量化PION术后RGC的存活情况。该方法既用于验证模型构建成功，也用于评估不同治疗方案的效果。图1展示了对照组（图1A）、假手术组（仅激光照射/无伊红B，图1B）以及PION处理后2周（图1C）动物视网膜铺片中FG阳性细胞的代表性共聚焦图像。与对照组动物相比，PION诱导后2周的动物中FG阳性细胞数量减少。而对照组与假手术组（仅激光照射/无伊红B）动物之间的RGC数量无显著差异。这表明PION诱导的RGC丢失是由伊红B与激光照射共同作用所致，而非仅由激光的热能引起。

讨论

本文详细描述了一种在大鼠模型中诱导PION的方法。该实验方案最关键的步骤是视神经的暴露与照射——需尽可能充分暴露视神经，同时避免因使用尖端精细镊子或牵拉过度而造成损伤。在大鼠中，眼动脉在距视盘≤1 mm处进入视神经。因此，对距离视盘3–4 mm处的视神经进行照射，仅会导致供应视神经的毛细血管发生缺血，而不会影响供应视网膜内层的动脉。必须通过眼底检查来确认视网膜中央动脉和静脉的血管完整性。经过练习，整个手术过程可在半小时内完成。结合固定的激光照射参数，该模型具有可重复的细胞死亡时间进程。

由于峰值强度和照射持续时间是决定缺血性损伤严重程度的两个因素，因此可以通过调整这些参数来改变损伤程度，以满足不同的研究目的。

作为首个且目前唯一可用的PION动物模型，该技术为研究PION的发病机制和分子变化提供了全新的平台，并可用于筛选治疗PION及其他中枢神经系统缺血性疾病的药物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
532-nm Nd:YAG 激光器	Laserglow	LRS-532-KM-200-3
光束斩波器	定制	定制
机械快门及配套快门驱动定时器	Vincent Associates	SD-10
25 cm 焦距球面透镜	CVI/Melles-Griot	01 LPX 293	平凸 BK7 玻璃透镜，带 HEBBARTM 抗反射涂层
伊红 B	MP Biomedicals	190449
荧光金	Fluorochrome, LLC
明胶海绵	Cardinal Health	CAH1203421
聚乙烯导管（PE10）	BD Intramedic	427400
10 号刀片	Miltex	4-110
精细镊子	F.S.T.	91150-20	Dumont #5 无磁不锈钢
带齿镊子	F.S.T.	11153-10	德国不锈钢
镊子	F.S.T.	18025-10	德国不锈钢
Vannas 弹簧剪	F.S.T.	2-220	JJECK 不锈钢
聚乳酸羟基乙酸缝合线	Ethicon	J488G	7-0 缝线
止血钳	F.S.T.	12075-12	德国不锈钢