本实验方案的目的是通过光化学方法在大鼠的视神经后段诱导缺血性损伤。该模型对于研究视神经后段缺血性病变的病理生理机制、此类及其他视神经病变的治疗策略，以及中枢神经系统其他缺血性疾病的机制至关重要。
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摘要
摘要
后部缺血性视神经病变（PION）是临床实践中一种致盲性疾病。然而，其发病机制和自然病程至今尚不明确。 仍 poorly understood。最近，我们建立了一种可靠且可重复的PION动物模型，并在该模型中测试了某些神经营养因子的治疗效果1本视频旨在演示我们建立的光化学诱导的后部缺血性视神经病变模型，并通过视网膜神经节细胞的逆行标记评估其效应。在手术暴露后段视神经后，静脉注射光敏染料赤藓红B，并将激光束聚焦照射于视神经表面。照射期间，赤藓红B与激光发生光化学反应，损伤血管内皮，引发由血小板血栓形成及水肿压迫介导的微血管闭塞。由此产生的缺血性损伤导致视网膜神经节细胞出现渐进性但显著的轴突退变，其原因是轴突输入丧失——这是一种远隔的、损伤诱导的、具有临床相关性的结果。因此，该模型为研究PION的病理生理过程提供了一个新颖的平台。 并可进一步优化用于视神经病变及其他中枢神经系统缺血性疾病的治疗策略研究。
引言
对于50岁以上的患者，缺血性视神经病变（ION）是急性视神经病变中最常见的类型2该病症可根据受累血液供应的具体来源表现为两种亚型之一。 临床表现：前部（AION）或后部（PION）3. 尽管AION的发病机制和病程 已被广泛研究4-7，由于后部缺血性视神经病变（PION）发病率低、临床表现多样、诊断标准不明确且缺乏动物模型，其病理机制一直 poorly understood。此外，目前尚无任何治疗方法被证实可有效预防或逆转前部缺血性视神经病变（AION）或PION所致的视力丧失。因此，建立一种可重复且可靠的PION动物模型对于研究该疾病的发病机制具有重要意义 体内 并测试用于神经保护和轴突再生的新治疗方案。
光化学诱导的微血管缺血性损伤可导致血管源性水肿和血栓形成，从而有效引发局部组织缺血8-12。将光敏染料赤藓红B注入血管循环后，在激光照射 靶血管时可产生活性单线态氧分子。单线态氧直接使血管内皮发生过氧化，促进血小板黏附/聚集，进而导致闭塞性血栓形成。由于血管源性水肿引起的微血管受压，缺血性损伤会向邻近区域扩散 并进一步加重 。本方案的总体目标是通过光化学方法在 球后视神经诱导缺血，以模拟PION所造成的损伤。
据我们所知，这是首个针对后段视神经缺血性损伤....
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方案
所有动物实验程序均经加州大学圣地亚哥分校和迈阿密大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并遵循ARVO关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明进行。手术中使用的所有试剂和仪器均为无菌。
1. 麻醉大鼠并进行手术准备
- 手术前，根据大鼠体重，通过腹腔注射给予氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）进行麻醉。麻醉深度应通过脚趾夹捏刺激无反应来确认。
- 麻醉成功后，将舌头向前牵拉以防止窒息，并在双眼涂抹润滑眼膏，以防手术期间角膜干燥。
- 使用毛发剪剃除手术区域的毛发，并用10%聚维酮-碘洗涤剂溶液和70%乙醇各擦拭三次。
- 将动物置于无菌区域内，并覆盖无菌巾。手术过程中使用无菌手套和无菌手术器械。在不同动物之间，需使用高温珠灭菌器对器械尖端进行重新灭菌。
2. 手术入路
- PION 诱导
- 股静脉插管
- 准备并清洁手术区域。使用毛发修剪器剃除右侧大腿内侧的毛发，然后依次用10%聚维酮-碘消毒液和70%乙醇各擦拭三次。
- 准备导管。剪取一段40 cm长的聚乙烯导管（PE 10），该导管经70%乙醇灭菌。用生理盐水冲洗导管，并将其连接至含有预先量取的2%赤藓红溶液的1 ml注射器上。 B染料（1 &#....
- 股静脉插管
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结果
该技术诱导的缺血性损伤会导致视网膜神经节细胞在缺血性轴突损伤后出现渐进但显著的死亡。这一结果在临床上具有相关性，类似于人类疾病中所观察到的现象。采用氟金（FluoroGold，FG）逆行标记法对PION术后视网膜神经节细胞（RGC）的存活情况进行定量分析。该方法同样用于验证动物模型构建的成功，以及评估不同治疗方案的效果。图1展示了对照组（图1A）、假手术组（仅激光处理，无赤藓红B，图1B）及PION处理后2周（图1C）动物视网膜铺片中FG阳性细胞的代表性共聚焦图像。与对照组动物相比，PION诱导2周后动物视网膜中FG阳性细胞数量明显减少。而对照组与假手术组（仅激光处理，无赤藓红B）动物的RGC数量之间无显著差异。这表明PION诱导的RGC丢失是由赤藓红B与激光照射共同作用所致，而非仅由激光产生的热能引起。
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讨论
本文详细描述了一种在大鼠模型中诱导PION的方法。该实验方案最关键的步骤是视神经的暴露与照射——需尽可能充分暴露视神经，同时避免因使用尖端精细镊子或牵拉过度而造成损伤。在大鼠中，眼动脉在距视盘≤1 mm处进入视神经。因此，对距离视盘3–4 mm处的视神经进行照射，仅会导致供应视神经的毛细血管发生缺血，而不会影响供应视网膜内层的动脉。必须通过眼底检查来确认视网膜中央动脉和静脉的血管完整性。经过练习，整个手术过程可在半小时内完成。结合固定的激光照射参数，该模型具有可重复的细胞死亡时间进程。
由于峰值强度和照射持续时间是决定缺血性损伤严重程度的两个因素，因此可以通过调整这些参数来改变损伤程度，以满足不同的研究目的。
作为首个且目前唯一可用的PION动物模型，该技术为研究PION的发病机制和分子变化提供了全新的平台，并可用于筛选治疗PION及其他中枢神经系统缺血性疾病的药物。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Eleut Hernandez在动物饲养方面提供的帮助，Gabe Gaidosh在显微成像方面的专业支持，以及Khue Tran和Zhenyang Zhao在视频剪辑方面的贡献。本研究由美国国立卫生研究院国家眼科研究所资助，项目编号为R01-EY022129（授予JLG），P30-EY022589（授予加州大学圣地亚哥分校）和P30-EY014801（授予迈阿密大学）；同时获得美国心脏协会、James和Esther King基金会、复旦大学研究生院博士生交换项目基金（编号2010033）以及防盲研究组织（Research to Prevent Blindness, Inc.）的无限制资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 532-nm Nd:YAG 激光器 | Laserglow | LRS-532-KM-200-3 | |
| 光束斩波器 | 定制 | 定制 | |
| 机械快门及配套快门驱动定时器 | Vincent Associates | SD-10 | |
| 25 cm 焦距球面透镜 | CVI/Melles-Griot | 01 LPX 293 | 平凸 BK7 玻璃透镜，带 HEBBARTM 抗反射涂层 |
| 伊红 B | MP Biomedicals | 190449 | |
| 荧光金 | Fluorochrome, LLC | ||
| 明胶海绵 | Cardinal Health | CAH1203421 | |
| 聚乙烯导管（PE10） | BD Intramedic | 427400 | |
| 10 号刀片 | Miltex | 4-110 | |
| 精细镊子 | F.S.T. | 91150-20 | Dumont #5 无磁不锈钢 |
| 带齿镊子 | F.S.T. | 11153-10 | 德国不锈钢 |
| 镊子 | F.S.T. | 18025-10 | 德国不锈钢 |
| Vannas 弹簧剪 | F.S.T. | 2-220 | JJECK 不锈钢 |
| 聚乳酸羟基乙酸缝合线 | Ethicon | J488G | 7-0 缝线 |
| 止血钳 | F.S.T. | 12075-12 | 德国不锈钢 |
参考文献
- Wang, Y., Brown, D. P. Jr, Duan, Y., Kong, W., Watson, B. D., Goldberg, J. L. A novel rodent model of posterior ischemic optic neuropathy. JAMA Ophthalmology. 131, 194-204 (2013).
- Rucker, J. C., Biousse, V., Newman, N. J. Ischemic optic neuropathies. Curr Opin Neurol. 17, 27-35 (2004).
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重印与许可
