关联星形胶质细胞 KCNJ10（Kir4.1）基因特异性 DNA 甲基化变化与其表达及转录活性

摘要

DNA甲基化能够维持基因表达的稳定水平，同时也能在多种刺激条件下介导基因表达的动态变化。本文详细介绍了用于研究DNA甲基化在特定基因上的变化及其对基因表达影响的技术方法。

摘要

DNA甲基化通过将甲基共价连接到胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸中胞嘧啶的C5位点，从而调控基因表达。尽管DNA甲基化可导致基因表达发生持久且稳定的改变，但其甲基化模式和水平也会因多种信号和刺激而发生变化。因此，DNA甲基化作为基因表达的一种强大而动态的调控机制发挥作用。神经表观遗传学的研究揭示了多种生理和病理状态与全基因组范围及特定基因的DNA甲基化改变相关。具体而言，在神经精神疾病和神经退行性疾病中、突触可塑性过程中以及中枢神经系统（CNS）损伤后，基因表达变化与DNA甲基化之间存在显著的相关性。然而，随着神经表观遗传学领域对DNA甲基化在中枢神经系统生理功能中作用的理解不断深入，明确基因表达与DNA甲基化变化之间的因果关系至关重要。此外，就更广泛的神经科学领域而言，不同脑区和细胞类型之间存在广泛差异，因此在研究转录组、蛋白质组和表观基因组时，需要采用能够应对这些差异的技术。本文描述了通过FACS分选皮层星形胶质细胞，从而实现对RNA转录和DNA甲基化进行后续分析的方法。此外，我们详细介绍了检测DNA甲基化的技术——甲基化敏感性高分辨率熔解分析（MS-HRMA），以及荧光素酶启动子活性检测方法。通过结合使用这些技术，不仅能够探究DNA甲基化与基因表达之间的相关性变化，还可直接评估特定基因区域的DNA甲基化状态改变是否足以影响其转录活性。

引言

表观遗传学是研究能够影响基因组转录活性的化学修饰的学科。本质上，在不改变DNA序列的情况下，DNA甲基化、组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化等表观遗传修饰足以可逆地改变基因表达模式¹。其中，DNA甲基化是基因表达的一种强有力调控机制，也是目前研究最为清楚的表观遗传修饰。DNA甲基化是指甲基基团共价结合到胞嘧啶的C5位点上，通常发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（即CpG位点）中的胞嘧啶上。含有高密度CpG位点的区域被称为CpG岛（CGIs）。CGIs通常与转录起始位点（TSS）和基因启动子区域相关联^1-3。因此，尽管CGIs处DNA甲基化的变化并不总是伴随细胞表达或功能的改变，但CGIs处的DNA甲基化变化仍可对转录活性产生强有力的调控作用²。

历史上，DNA甲基化被认为在胚胎发生、基因组印记和发育过程中至关重要，而在有丝分裂后的细胞中，DNA甲基化水平的变化较小（癌症相关基因的改变除外）^4,5。然而，神经表观遗传学领域揭示了DNA甲基化在非发育过程中的重要作用。具体而言，认知表观遗传学将DNA甲基化重新定义为一种高度可塑的机制，该机制在介导学习与记忆过程中关键基因的转录激活和抑制方面发挥核心作用⁶。除认知表观遗传学外，模拟缺血性损伤和神经病理性疼痛的研究也表明，DNA甲基化是一种不稳定的机制，能够快速响应多种中枢神经系统（CNS）损伤^7-9。关于星形胶质细胞....

方案

所有动物操作均遵循美国国立卫生研究院的指导原则。动物使用已获得阿拉巴马大学伯明翰分校动物护理与使用委员会的批准。

1. 利用全脑组织中星形胶质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）获取富集星形胶质细胞群体的RNA和DNA

1. 用CO₂麻醉动物₂ 1 分钟后迅速断头处死，按 Albuquerque 所述方法分离皮层 等人，²⁶；无需去除软脑膜。
   注意：由 Itakura 构建了在 S100β（星形胶质细胞标志物）启动子驱动下表达 eGFP 的转基因大鼠。 等²⁷ 用于星形胶质细胞的FACS分选。
2. 使用木瓜蛋白酶解离试剂盒在非无菌条件下按照制造商方案制备全脑匀浆。将木瓜蛋白酶在37 °C水浴中加热活化10分钟。注意：木瓜蛋白酶溶液由制造商提供，含有L-半胱氨酸和EDTA（见材料表）。
   1. 在50 ml锥形管顶部切割或打磨出一个孔，以便让输送95%O₂/5%CO₂混合气体的管路穿过₂5% CO₂₂ 装入封闭的锥形管中（图1A）。将分离的皮层组织置于含有解离培养基（MEM 添加 20 mM 葡萄糖和青霉素/链霉素（500 U/ml），并平衡至 95% O₂₂5% CO₂₂）并使用洁净的剃须刀片将....

结果

通过FACS分选eGFP-S100β转基因动物获得富集的星形胶质细胞群体²⁷。由于出生后第50天（p50）以上动物所分离的细胞及分子质量逐渐下降，因此p0-p40日龄的动物最适合此类实验。本实验使用皮层组织，每次实验将2至6只动物的皮层组织合并收集。FACS分选在阿拉巴马大学伯明翰分校综合流式细胞术核心实验室进行，使用BD公司的FacsAria II仪器完成分选。eGFP的激发采用488 nm激光，无需补偿调节。根据前向散射和侧向散射信号设定门控以选择目标细胞群体（图1B）。使用溴化乙锭作为死细胞标记物来确定活细胞群体并进行门控（图1C）。根据eGFP表达水平可观察到两个不同的细胞群体（图1D）。通过经验性验证，eGFP信号较强的细胞群体被确认为eGFP阳性细胞群体（图1F-F''）。对eGFP信号较弱的第二个群体进行显微观察，发现其为表达eGFP但无细胞核的细胞碎片，可能来源于星形胶质细胞突起的残余物（图1G-G''）。图中展示了组织解离后、分选.......

讨论

本方案描述了通过流式细胞分选（FACS）分离富集星形胶质细胞群体的方法，以及一系列可用于研究DNA甲基化与基因表达之间相关性及因果关系的技术。这些技术可单独或联合使用，特别适用于研究细胞异质性较高的组织，或关注特定基因或基因区域的DNA甲基化状态而非全基因组DNA甲基化变化的实验室。研究中枢神经系统（CNS）表观基因组的一个相对独特的挑战在于细胞群体的多样性。由于目标基因在中枢神经系统中可能以时空特异性的模式在不同水平上表达，使用整体组织常会导致转录和DNA甲基化研究的数据混杂不清。

Kir4.1 作为目标蛋白，在星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜细胞中具有时空特异性的调控表达^13,14,40-47。因此，使用 eGFP-S100β 转基因动物²⁷进行 FACS 分选可富集得到更高纯度的星形胶质细胞群体¹⁵，从而更准确地评估该细胞群体中特异的基因转录水平和 DNA 甲基化状态。尽管具有这一优势，采用 FACS 分选的星形胶质细胞仍面临若干挑战。为进行 FACS 而制备单细胞悬液需要对完整组织进行显著的机械解离，并经历.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒	Qiagen	80204
甲基化引物设计软件	Applied Biosystems	online	用于定位CpG岛的软件
EZ DNA甲基化试剂盒	Zymo Research	D5001
大鼠预混校准标准品	EpiGenDx	80-8060R-Premix
CpG甲基转移酶（M.Sssl）	Zymo Research	E2010
QIAquick凝胶回收	QIagen	28704	用于凝胶回收和DNA纯化
限制性内切酶	New England BioLabs
NEB cutter	New England BioLabs	online	验证限制性酶切位点
双荧光素酶报告基因检测系统	Promega	E1910
Luc2载体，pGL4.10	Promega	E6651
海肾荧光素酶载体，pGL4.74	Promega	E2241
TD-20/20 发光仪	Turner Designs
Lipofectamine LTX及Plus转染试剂	Life Technologies	A12621
苯酚，饱和pH 6.6/6.9	Fisher Scientific	BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c 分光光度计	ThermoScientific
MeltDoctor预混液	Life Technologies	4415440
高分辨率熔解（HRM）软件v2.0	Life Technologies	4397808
AB SDS软件v2.3	Life Technologies	online
AB高分辨率熔解分析入门指南	Life Technologies	online
AB 7900HT快速实时定量PCR系统	Life Technologies