关联星形胶质细胞 KCNJ10（Kir4.1）基因特异性 DNA 甲基化变化与其表达及转录活性

摘要

DNA甲基化能够维持基因表达的稳定水平，同时也能在多种刺激条件下介导基因表达的动态变化。本文详细介绍了用于研究DNA甲基化在特定基因上的变化及其对基因表达影响的技术方法。

摘要

DNA甲基化通过将甲基共价连接到胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸中胞嘧啶的C5位点，从而调控基因表达。尽管DNA甲基化可导致基因表达发生持久且稳定的改变，但其甲基化模式和水平也会因多种信号和刺激而发生变化。因此，DNA甲基化作为基因表达的一种强大而动态的调控机制发挥作用。神经表观遗传学的研究揭示了多种生理和病理状态与全基因组范围及特定基因的DNA甲基化改变相关。具体而言，在神经精神疾病和神经退行性疾病中、突触可塑性过程中以及中枢神经系统（CNS）损伤后，基因表达变化与DNA甲基化之间存在显著的相关性。然而，随着神经表观遗传学领域对DNA甲基化在中枢神经系统生理功能中作用的理解不断深入，明确基因表达与DNA甲基化变化之间的因果关系至关重要。此外，就更广泛的神经科学领域而言，不同脑区和细胞类型之间存在广泛差异，因此在研究转录组、蛋白质组和表观基因组时，需要采用能够应对这些差异的技术。本文描述了通过FACS分选皮层星形胶质细胞，从而实现对RNA转录和DNA甲基化进行后续分析的方法。此外，我们详细介绍了检测DNA甲基化的技术——甲基化敏感性高分辨率熔解分析（MS-HRMA），以及荧光素酶启动子活性检测方法。通过结合使用这些技术，不仅能够探究DNA甲基化与基因表达之间的相关性变化，还可直接评估特定基因区域的DNA甲基化状态改变是否足以影响其转录活性。

引言

表观遗传学是研究能够影响基因组转录活性的化学修饰的学科。本质上，在不改变DNA序列的情况下，DNA甲基化、组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化等表观遗传修饰足以可逆地改变基因表达模式¹。其中，DNA甲基化是基因表达的一种强有力调控机制，也是目前研究最为清楚的表观遗传修饰。DNA甲基化是指甲基基团共价结合到胞嘧啶的C5位点上，通常发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（即CpG位点）中的胞嘧啶上。含有高密度CpG位点的区域被称为CpG岛（CGIs）。CGIs通常与转录起始位点（TSS）和基因启动子区域相关联^1-3。因此，尽管CGIs处DNA甲基化的变化并不总是伴随细胞表达或功能的改变，但CGIs处的DNA甲基化变化仍可对转录活性产生强有力的调控作用²。

历史上，DNA甲基化被认为在胚胎发生、基因组印记和发育过程中至关重要，而在有丝分裂后的细胞中，DNA甲基化水平的变化较小（癌症相关基因的改变除外）^4,5。然而，神经表观遗传学领域揭示了DNA甲基化在非发育过程中的重要作用。具体而言，认知表观遗传学将DNA甲基化重新定义为一种高度可塑的机制，该机制在介导学习与记忆过程中关键基因的转录激活和抑制方面发挥核心作用⁶。除认知表观遗传学外，模拟缺血性损伤和神经病理性疼痛的研究也表明，DNA甲基化是一种不稳定的机制，能够快速响应多种中枢神经系统（CNS）损伤^7-9。关于星形胶质细胞，多项证据表明DNA甲基化在星形胶质细胞生成（astrogliogenesis）中发挥重要作用。Fan et al. 发现，在神经前体细胞（NPCs）中条件性敲除DNMT1会导致星形胶质细胞过早发育，并伴随整体低甲基化状态¹⁰。此外，Perisic et al. 得出结论，GLT-1启动子区域DNA甲基化水平的差异介导了皮层与小脑中谷氨酸转运体表达水平的不同，强调了DNA甲基化在建立脑区特异性星形胶质细胞基因表达模式中的作用¹¹。总体而言，大量研究强调了DNA甲基化在中枢神经系统中的动态和不稳定特性，环境因素、药物和损伤均已被证明可改变DNA甲基化水平，并常常影响基因表达^4,9。这些神经表观遗传学研究共同表明，DNA甲基化是一个可行的治疗靶点，具有缓解多种中枢神经系统病理状态的潜力。

随着表观遗传学领域对DNA甲基化在神经发育和疾病中作用的理解不断深入，将DNA甲基化推向治疗靶点所面临的关键挑战在于：不仅要开展相关性研究，更要进行因果性研究，以明确特定的基因靶点和位点。此外，针对脑区和细胞类型特异性的DNA甲基化变化进行系统分析，仍是神经表观遗传学领域持续存在且具有重要意义的独特挑战。本实验方案结合多种技术，包括星形胶质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）、甲基化敏感性高分辨率熔解分析（MS-HRM）以及甲基化荧光素酶报告基因检测，用于研究KCNJ10基因的DNA甲基化状态。KCNJ10基因编码Kir4.1蛋白。Kir4.1是一种胶质细胞特异性的钾离子通道，在中枢神经系统（CNS）中表现出脑区和细胞类型的特异性表达模式^12-16。从头端到尾端的CNS区域，Kir4.1的表达水平逐渐升高，其中在脊髓中的表达最高¹⁵。尽管该通道在室管膜细胞、少突胶质细胞及其前体细胞中均有表达，但其主要在星形胶质细胞中表达，并被认为对于维持钾离子的稳态水平至关重要，同时通过将星形胶质细胞的静息膜电位维持在超极化的-80 mV水平，支持谷氨酸的摄取^12,16-19。重要的是，Kir4.1的表达在发育过程中以及多种中枢神经系统损伤后并非静态不变^20-25。我们希望探究该通道在发育过程中特别是在星形胶质细胞中的表观遗传调控机制。所采用的技术可实现对特定基因及靶向CpG位点的分析，为DNA甲基化调控KCNJ10基因表达的作用提供因果性证据。这些技术也可应用于其他基因的研究。

方案

所有动物操作均遵循美国国立卫生研究院的指导原则。动物使用已获得阿拉巴马大学伯明翰分校动物护理与使用委员会的批准。

1. 利用全脑组织中星形胶质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）获取富集星形胶质细胞群体的RNA和DNA

1. 用CO₂麻醉动物₂ 1 分钟后迅速断头处死，按 Albuquerque 所述方法分离皮层 等人，²⁶；无需去除软脑膜。
   注意：由 Itakura 构建了在 S100β（星形胶质细胞标志物）启动子驱动下表达 eGFP 的转基因大鼠。 等²⁷ 用于星形胶质细胞的FACS分选。
2. 使用木瓜蛋白酶解离试剂盒在非无菌条件下按照制造商方案制备全脑匀浆。将木瓜蛋白酶在37 °C水浴中加热活化10分钟。注意：木瓜蛋白酶溶液由制造商提供，含有L-半胱氨酸和EDTA（见材料表）。
   1. 在50 ml锥形管顶部切割或打磨出一个孔，以便让输送95%O₂/5%CO₂混合气体的管路穿过₂5% CO₂₂ 装入封闭的锥形管中（图1A）。将分离的皮层组织置于含有解离培养基（MEM 添加 20 mM 葡萄糖和青霉素/链霉素（500 U/ml），并平衡至 95% O₂₂5% CO₂₂）并使用洁净的剃须刀片将组织切成 1 x 1 mm 的碎块² 块。
3. 使用10 ml转移组织 手动移液器将溶液转移至含有木瓜蛋白酶溶液的50 ml锥形管中。在排液前，让组织沉降到移液管底部，以尽量减少解离液的带入量。保持木瓜蛋白酶溶液与95% O₂平衡₂5% CO₂₂ 通过表面气体交换维持孵育全过程。切勿向木瓜蛋白酶溶液中通气。将组织孵育20分钟 在37 °C水浴中。
4. 孵育于木瓜蛋白酶溶液后，用10 ml移液管吹打组织10次 以慢速使用移液管转移。将浑浊的细胞悬液在1,000 x g下离心5分钟。 室温下
   1. 通过表面气体交换平衡脱氧核糖核酸酶/白蛋白抑制剂溶液（由生产商提供），并将细胞沉淀重悬于3 ml脱氧核糖核酸酶/白蛋白抑制剂溶液中。按照生产商说明书制备商用不连续密度梯度液。
5. 在1,000 × g条件下离心6分钟，进行不连续密度梯度分离。用移液器吸取管底沉淀，收集解离的细胞。
6. 将解离的细胞重悬于 2–3 ml 含 0.02% 牛血清白蛋白和 1 mg/ml DNase 的 DPBS 溶液中，或使用偏好的 HEPES 缓冲培养基。在进行 FACS 前，经 40 µm 滤膜过滤。图2A将细胞置于冰上直至分选。
   1. 进行 FACS²⁸.
   2. 在1.5 ml离心管中以2,000 × g离心5分钟收集细胞 4 °C下
      注意：离心获得的星形胶质细胞可立即使用，或保存于 -80 °C 直至进行 DNA 提取。
7. 使用首选的分离方法提取 RNA 和 DNA ²⁹³⁰通过分光光度计和生物分析仪评估RNA和DNA的浓度与质量 ³¹.
   注意：后续步骤中仅使用高质量的RNA和DNA，其260/280比值分别为2.0–2.2和1.8–1.9。必须通过Bioanalyzer分析评估RNA降解或DNA片段化情况。RNA或DNA可立即使用，或分别储存于-80 °C或-20 °C用于后续研究。

2. 使用甲基化敏感高分辨率熔解分析（MS-HRMA）评估基因的DNA甲基化状态

1. 将感兴趣的基因序列输入首选的在线甲基化图谱分析软件，以鉴定该基因中是否存在CpG岛³²。
   1. 针对经亚硫酸氢盐转化的DNA序列设计引物³³，并根据制造商说明书使用首选的DNA聚合酶进行扩增。通过在100 V电压下运行1%琼脂糖DNA凝胶电泳45分钟，验证扩增产物大小。将引物以20 µM的储存浓度保存于-20 °C。
2. 对每个样本500–1,000 ng的DNA以及来自相同动物物种、甲基化水平为0–100%的甲基化DNA标准品进行亚硫酸氢盐转化³⁴。洗脱样本以获得20 ng/µl的浓度。通过分光光度计测定亚硫酸氢盐转化后DNA的浓度³¹。
3. 使用首选的DNA聚合酶和浓度为5 µM的引物，按照表1和表2设置20 µl的MS-HRM扩增反应体系。所有样本（包括FACS分离的DNA和甲基化标准品）均需设置三个重复。
4. 根据所用分析软件的要求，在熔解曲线相变区域前后设定起始和终止参数。设定预熔解起始和预熔解终止参数，使两者之差为0.2–0.5 °C；同样设定后熔解起始和后熔解终止参数。提取每个样本的峰值温度差数据。
5. 利用已知甲基化百分比标准品（y值）及其对应的平均峰值温度差（x值），建立线性回归方程（图3A-B，表3-4）。使用该线性回归方程估算未知样本的甲基化状态³⁵。

3. 利用荧光素酶检测评估高甲基化启动子活性

1. 鉴定目标基因的CpG岛（步骤2.1）。PCR扩增目的区域 ³⁶ 并克隆至上游 luc2 萤火虫荧光素酶报告基因用于构建CpG岛-luc2质粒 ³⁷.
2. 通过限制性内切酶消化线性化30 µg CpG-island-luc2质粒 ³⁸验证限制性酶切位点，使用首选的酶切分析软件避免重复切割 ³⁸根据制造商说明书，在消化后于适当温度和时间下热失活酶。线性化步骤中DNA的损失极小。
3. 使用CpG甲基化酶（M.SssI）在30 °C条件下对线性化质粒进行过夜甲基化处理，或根据试剂盒说明书进行未处理对照，但需遵循以下调整步骤。
4. 进行50 µl的反应体系。
5. 使用5单位的CpG甲基化酶对700 ng线性化质粒进行甲基化。
6. 过夜反应13-19小时。
7. CpG甲基化酶反应后，按照制造商说明书，使用标准的市售硅胶膜DNA纯化试剂盒进行DNA纯化。CpG甲基化酶反应后常发生显著的DNA损失，损失率为30%–60%。
8. 通过Hpa II限制性消化验证质粒的甲基化状态。
9. 取1 µg甲基化或非甲基化DNA，用Hpa II进行限制性消化反应1小时 在37 °C下进行。每1 µg DNA使用5-10单位的Hpa II。Hpa II消化完成后，采用常用的商业化硅胶膜DNA纯化试剂盒进行DNA纯化。将CpG甲基化和非甲基化的质粒同时在TAE或TBE缓冲液中以1%琼脂糖DNA凝胶于100 V电泳45分钟 用于可视化（图4B).
10. 对甲基化和非甲基化的质粒分别进行双酶切消化，使用适当的限制性内切酶释放全长的 luc 2（载体）片段和 CpG 岛（插入片段） ³⁸过夜进行双酶切反应，温度按酶的最适条件设置，消化完成后根据制造商说明书热失活酶。双限制性酶切过程中DNA浓度的损失极小。
11. 在1% DNA琼脂糖凝胶中以100 V电压电泳1小时，对双酶切质粒进行检测 以实现载体与插入片段的分离（图4C）。注意：佩戴防护性紫外面罩，将DNA凝胶置于台面式紫外灯上以观察条带。根据大小，使用洁净的手术刀切下甲基化和非甲基化的插入片段以及非甲基化的载体。
12. 使用饱和酚（pH 6.6）从凝胶中提取DNA。简而言之，称量含有载体或插入片段的DNA凝胶，每0.1克DNA凝胶使用100 µl酚。使用玻璃Dounce匀浆器在酚中匀浆DNA凝胶。
13. 加入氯仿（用量为酚体积的1/5），振荡样品20秒。室温孵育2–3分钟。4 °C、最大速度（16.1 × 1,000 × g）离心15分钟。
14. 去除水相，加入0.1倍体积的3 M乙酸钠和2.5倍体积的乙醇。在-80 °C下孵育样品1小时。孵育结束后，去除乙醇，并将DNA重新悬浮于30 µl所需的缓冲液中。在插入片段和载体纯化后，DNA会有显著损失，损失率为30–50%。
15. 使用T4 DNA连接酶将甲基化和非甲基化的插入片段重新连接至非甲基化的载体 ³⁸使用1:4的载体与插入片段比例进行连接反应。根据制造商说明书设置反应体系，总体积为50 µl，于-20 °C或置于冰桶中加盖冰上孵育过夜。
16. 连接反应后，使用优选的市售硅胶膜纯化试剂盒进行DNA纯化。连接反应后DNA损失显著，大约损失30-50%的DNA。通过在1%琼脂糖DNA凝胶中以100 V电泳45分钟验证重新连接情况 并评估重新连接的质粒的浓度（图4D).
17. 使用商品化转染试剂，按照生产商说明书将甲基化或非甲基化质粒转染至D54细胞中。将D54细胞以0.14 x 10⁶密度接种于12孔板中。⁶ 细胞/孔
18. 转染24小时后，用相同浓度的以下任一种质粒转染细胞：(1) 非甲基化CpG-luc2质粒 + Renilla或其他对照荧光素酶载体；或(2) 甲基化CpG-luc2质粒 + Renilla或其他对照荧光素酶载体。
19. 让细胞转染24小时 在进行双荧光素酶报告基因检测前，按照试剂盒说明书进行操作。使用化学发光仪检测，每个孔做三个复孔读数。
20. 计算比值 萤火虫 荧光素酶活性至 海肾 或其他对照荧光素酶活性。对甲基化进行归一化处理 萤火虫：对照 荧光素酶活性至非甲基化 萤火虫：对照 通过将甲基化荧光素酶活性除以非甲基化荧光素酶活性来计算荧光素酶活性

结果

通过FACS分选eGFP-S100β转基因动物获得富集的星形胶质细胞群体²⁷。由于出生后第50天（p50）以上动物所分离的细胞及分子质量逐渐下降，因此p0-p40日龄的动物最适合此类实验。本实验使用皮层组织，每次实验将2至6只动物的皮层组织合并收集。FACS分选在阿拉巴马大学伯明翰分校综合流式细胞术核心实验室进行，使用BD公司的FacsAria II仪器完成分选。eGFP的激发采用488 nm激光，无需补偿调节。根据前向散射和侧向散射信号设定门控以选择目标细胞群体（图1B）。使用溴化乙锭作为死细胞标记物来确定活细胞群体并进行门控（图1C）。根据eGFP表达水平可观察到两个不同的细胞群体（图1D）。通过经验性验证，eGFP信号较强的细胞群体被确认为eGFP阳性细胞群体（图1F-F''）。对eGFP信号较弱的第二个群体进行显微观察，发现其为表达eGFP但无细胞核的细胞碎片，可能来源于星形胶质细胞突起的残余物（图1G-G''）。图中展示了组织解离后、分选...

讨论

本方案描述了通过流式细胞分选（FACS）分离富集星形胶质细胞群体的方法，以及一系列可用于研究DNA甲基化与基因表达之间相关性及因果关系的技术。这些技术可单独或联合使用，特别适用于研究细胞异质性较高的组织，或关注特定基因或基因区域的DNA甲基化状态而非全基因组DNA甲基化变化的实验室。研究中枢神经系统（CNS）表观基因组的一个相对独特的挑战在于细胞群体的多样性。由于目标基因在中枢神经系统中可能以时空特异性的模式在不同水平上表达，使用整体组织常会导致转录和DNA甲基化研究的数据混杂不清。

Kir4.1 作为目标蛋白，在星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜细胞中具有时空特异性的调控表达^13,14,40-47。因此，使用 eGFP-S100β 转基因动物²⁷进行 FACS 分选可富集得到更高纯度的星形胶质细胞群体¹⁵，从而更准确地评估该细胞群体中特异的基因转录水平和 DNA 甲基化状态。尽管具有这一优势，采用 FACS 分选的星形胶质细胞仍面临若干挑战。为进行 FACS 而制备单细胞悬液需要对完整组织进行显著的机械解离，并经历...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒	Qiagen	80204
甲基化引物设计软件	Applied Biosystems	online	用于定位CpG岛的软件
EZ DNA甲基化试剂盒	Zymo Research	D5001
大鼠预混校准标准品	EpiGenDx	80-8060R-Premix
CpG甲基转移酶（M.Sssl）	Zymo Research	E2010
QIAquick凝胶回收	QIagen	28704	用于凝胶回收和DNA纯化
限制性内切酶	New England BioLabs
NEB cutter	New England BioLabs	online	验证限制性酶切位点
双荧光素酶报告基因检测系统	Promega	E1910
Luc2载体，pGL4.10	Promega	E6651
海肾荧光素酶载体，pGL4.74	Promega	E2241
TD-20/20 发光仪	Turner Designs
Lipofectamine LTX及Plus转染试剂	Life Technologies	A12621
苯酚，饱和pH 6.6/6.9	Fisher Scientific	BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c 分光光度计	ThermoScientific
MeltDoctor预混液	Life Technologies	4415440
高分辨率熔解（HRM）软件v2.0	Life Technologies	4397808
AB SDS软件v2.3	Life Technologies	online
AB高分辨率熔解分析入门指南	Life Technologies	online
AB 7900HT快速实时定量PCR系统	Life Technologies