关联特定基因的DNA甲基化与表达的变化和星形胶质细胞的转录活性 KCNJ10（Kir4.1）

Summary

DNA 甲基化能够维持稳定的基因表达水平，并允许基因表达响应于各种刺激而发生动态变化。我们详细介绍了允许研究 DNA 甲基化的基因特异性变化以及这些变化对基因表达的影响的技术。

Abstract

DNA 甲基化通过甲基共价附着在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸中胞嘧啶的 C5 位置来调节基因表达。虽然 DNA 甲基化提供了持久稳定的基因表达变化，但 DNA 甲基化的模式和水平也会根据各种信号和刺激而变化。因此，DNA 甲基化是基因表达的强大而动态的调节因子。神经表观遗传学的研究揭示了与 DNA 甲基化的整体和基因特异性变化相关的各种生理和病理状态。具体来说，基因表达和 DNA 甲基化变化之间存在显着的相关性，存在于神经精神和神经退行性疾病、突触可塑性期间和 CNS 损伤后。然而，随着神经表观遗传学领域不断扩大对 DNA 甲基化在 CNS 生理学中的作用的理解，描绘基因表达和 DNA 甲基化变化的因果关系至关重要。此外，就神经科学的更大领域而言，在研究转录组、蛋白质组和表观基因组时，存在巨大的区域和细胞特异性差异需要解决这些差异的技术。在这里，我们描述了皮质星形胶质细胞的FACS分选，它允许随后检查RNA转录和DNA甲基化。此外，我们详细介绍了一种检查 DNA 甲基化、甲基化敏感高分辨率熔解分析 （MS-HRMA） 以及荧光素酶启动子测定的技术。通过使用这些组合技术，不仅可以探索 DNA 甲基化和基因表达之间的相关变化，还可以直接评估给定基因区域的 DNA 甲基化状态的变化是否足以影响转录活性。

Introduction

表观遗传学是研究可影响基因组转录活性的化学修饰的学科。从本质上讲，如果不改变 DNA 序列，表观遗传修饰（如 DNA 甲基化、组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化）就足以可逆地改变基因表达模式 ¹。DNA 甲基化是基因表达的有效调节因子，是特征最明确的表观遗传修饰。DNA 甲基化是甲基在胞嘧啶 C5 位点上的共价连接，通常是胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的胞嘧啶，也称为 CpG 位点。包含高密度 CpG 位点的区域称为 CpG 岛 （CGI）。CGI 通常与转录起始位点 （TSS） 和基因启动子 ^1-3 相关。因此，虽然 CGI 上 DNA 甲基化的变化并不总是与细胞表达或功能的变化同时发生，但 CGI 上 DNA 甲基化的变化可以对转录活性产生强大的调节^{作用 2}。

从历史上看，观察到 DNA 甲基化在胚胎发生、印记和发育中是必不可少的，有丝分裂后细胞中 DNA 甲基化水平几乎没有变化（癌症相关基因的改变除外）^4,5。然而，神经表观遗传学领域强调了 DNA 甲基化的重要非发育作用。具体来说，认知表观遗传学已将 DNA 甲基化重新定义为一种高度可塑的机制，在介导对学习和记忆过程至关重要的基因的转录激活和抑制中不可或缺 ⁶。除了认知表观遗传学外，模拟缺血性损伤和神经性疼痛的研究将 DNA 甲基化描述为一种对各种 CNS 损伤迅速做出反应的不稳定机制 ^7-9。关于星形胶质细胞，几条证据表明 DNA 甲基化在星形胶质细胞发生中起重要作用。Fan 等人发现，神经祖细胞 （NPC） 中 DNMT1 的条件性 KO 导致星形胶质细胞早熟发育，这与整体低甲基化状态一致 ¹⁰。此外，Perisic 等人得出结论，GLT-1 启动子的 DNA 甲基化水平差异介导了皮层和小脑中谷氨酸转运蛋白的表达水平差异，强调了 DNA 甲基化在建立星形胶质细胞基因表达的脑区特异性模式中的作用 ¹¹。总体而言，许多研究强调了 CNS 中 DNA 甲基化的动态性和不稳定性，因为环境、药物和损伤都已被证明会改变 DNA 甲基化，并且通常会改变基因表达 ^4,9。总之，这些神经表观遗传学研究指出 DNA 甲基化是一种可行的治疗靶点，有可能缓解各种 CNS 病理。

随着表观遗传学领域扩大了对 DNA 甲基化在神经发育和疾病中的作用的理解，将 DNA 甲基化转向治疗靶点的挑战不仅在于进行定义特定基因靶点和位点的相关研究，还在于进行致病研究。此外，研究特定于大脑区域和细胞类型的 DNA 甲基化变化仍然是神经表观遗传学领域独有的一项持续且值得时间的挑战。该方案利用多种技术，包括星形胶质细胞的荧光激活细胞分选 （FACS）、甲基化敏感高分辨率熔解分析 （MS-HRM） 和甲基化荧光素酶测定来研究 KCNJ10 的 DNA 甲基化状态，KCNJ10 是一种编码 Kir4.1 的基因。Kir4.1 是一种神经胶质特异性钾通道，在 CNS ^12-16 中表现出脑区和细胞特异性表达模式。 Kir4.1 表达从喙部移动到尾部 CNS 区域增加，其中脊髓表达最高 ¹⁵。虽然该通道在室管膜细胞、少突胶质细胞及其前体细胞中表达，但 Kir4.1 主要在星形胶质细胞中表达，并且被认为对于维持钾的稳态水平以及通过将星形胶质细胞静息膜电位设置为超极化 -80mV 来支持谷氨酸摄取至关重要 ^12,16-19。重要的是，Kir4.1 的表达在发育过程中和多种形式的 CNS 损伤后都是非静态的 ^20-25。我们希望检查该通道的表观遗传调控，特别是在发育过程中的星形胶质细胞中。所使用的技术提供基因特异性和靶向 CpG 位点分析，为 DNA 甲基化在调节 KCNJ10 基因表达中的作用提供因果证据。这些技术可以应用于其他基因。

Protocol

所有动物均按照健康准则全国学院处理。动物护理和使用委员会在阿拉巴马大学伯明翰分校批准的动物使用。

1.使用荧光激活细胞从全脑组织排序星形胶质细胞（FACS）从富集的星形胶质细胞人口获得的RNA和DNA

1. 稳重动物用CO ₂ 1分钟，然后迅速斩首。在阿尔布开克等人解剖皮层^，26。这是没有必要去除脑膜。
   注：表示在S100β绿色荧光蛋白（星形胶质细胞标记物）子转基因大鼠由板仓等 ²⁷产生和利用的星形胶质细胞的FACS分选。
2. 使用根据制造商的协议在非无菌条件下用木瓜蛋白酶的解离试剂盒制备全脑匀浆。在水浴热激活的木瓜蛋白酶在37℃下进行10分钟。注意：木瓜蛋白酶溶液通过制造商提供，并包含L-半胱氨酸和EDTA（见表材料）。
   1. 切割或DREMEL空穴到50毫升锥形管的顶部，以允许管道携带_{95％O 2：5％}的CO 2被送入一个封闭的圆锥管（图1A）。放置在10毫米培养皿含有解离媒体解剖皮层（MEM补充有20mM的葡萄糖和青霉素/链霉素（500U / ml）和平衡至_95％O 2，5％CO _2），并使用干净的刀片剁碎组织成1- ×1毫米^2件 。
3. 用10ml手册的Pipetman至50ml锥形管含有木瓜蛋白酶溶液转移组织。让组织来履行，以尽量减少分离介质的结转额前下沉到移液管的底部。保持平衡至95％ _的 O 2的木瓜蛋白酶溶液_：5％的CO 2经由该孵育期间表面气体交换。不要泡木瓜蛋白酶soluti上。孵育组织为在37℃水浴20分钟。
4. 孵育后在木瓜蛋白酶溶液，磨碎的组织的10倍以低速10ml的移液管。离心浑浊细胞悬浮液在1000×g离心5分钟，室温。
   1. 平衡经由表面气体交换的DNase /白蛋白抑制剂溶液（由制造商提供的），并在3ml的DNA酶/清蛋白抑制剂溶液重新悬浮沉淀的细胞。制备商业不连续密度梯度依照制造商的指令。
5. 自旋不连续密度梯度，在1000×g离心6分钟。通过抽吸底部沉淀用吸管隔离管的底部离解的细胞。
6. 重悬离解的细胞在2-3毫升的DPBS用0.02％牛血清白蛋白和1毫克/毫升DNA酶或缓冲培养基优选HEPES。流式细胞仪（ 图2A），然后通过40微米的过滤器传递。保持细胞在冰上，直到排序。
   1. 执行流式细胞仪^28。</ LI>
   2. 沉淀细胞在1.5ml的离心管中，在2000×g离心5分钟，在4℃。
      注意：丸粒化星形胶质细胞可以立即使用或保存在-80℃直至DNA提取。
7. RNA和DNA使用优选的分离方法^{29 30}提取。通过分光光度计和生物分析仪³¹评估RNA和DNA的浓度和质量。
   注意：利用仅高质量RNA和DNA在随后的步骤中，260个/ 280个= 2.0-2.2和1.8-1.9，分别。生物分析仪分析是必不可少的，以评估RNA降解或DNA片段。 RNA或DNA可以立即使用或储存于-80℃或-20℃，分别用于随后的研究。

2.评估使用甲基化敏感高分辨率熔解分析（MS-HRMA）的基因的DNA甲基化状态

1. 进入首选网上甲基化地图软件感兴趣的基因序列，以识别任何CpG岛的基因关注^32。
   1. 亚硫酸氢盐对设计的引物转化DNA序列^33和扩增按照制造商的方案使用优选的DNA聚合酶。通过运行在100伏的1％琼脂糖凝胶的DNA 45分钟确认扩增产物的大小。商店引物储备浓度20μM的在-20℃。
2. 亚硫酸氢盐转化500-1000毫微克的每个样品和甲基化DNA的标准范围从0-100％来自同一动物种类³⁴的DNA。洗脱样本以提供20毫微克/微升的浓度。通过分光光度计³¹验证的亚硫酸氢盐转化的DNA浓度。
3. 设置20微升反应为根据表1和2使用优选的DNA聚合酶和引物在5微米浓度的MS-HRM扩增。运行所有的样品，包括流式细胞仪DNA和甲基化的标准，以一式三份。
4. 根据分析软件，设置前置和后置启动和停止参数周围的熔解曲线的过渡。组预先熔融开始和预熔融停止参数，使两者之间的差为0.2 - 0.5℃。设置后开始融化，后熔停止类似。提取峰值温度的差数据的每个样本。
5. 使用百分之甲基标准（y值）和它们的相应的平均峰温度差（x值）生成的线性回归方程（图3A-B，表3-4）。使用该线性回归方程来估算未知样品³⁵的甲基化状态。

3.通过使用荧光素酶测定的评估超甲基化的启动子活性

1. 确定目标基因（步骤2.1）的CpG岛。 PCR扩增感兴趣^36和克隆区域luc2萤火虫萤光素酶报道基因的上游，以产生的CpG岛luc2质粒^37。
2. 线性化30微克的通过限制的CpG岛luc2质粒酶消化^38。验证网站的限制消化，避免使用首选刀具软件³⁸双削减。热灭活根据制造商的协议如下消化在适当的温度和持续时间的酶。在线性化步骤是DNA的损失降到最低。
3. 使用的CpG甲基化酶（M.Sssl）O / N在30°C或将未经处理的，按照制造商的协议，除了以下调整甲醇线性质粒。
4. 执行50微升反应。
5. 使用5个单位的CpG甲基对甲基化700纳克线性化的质粒。
6. 运行反应O / N为13-19小时。
7. 以下的CpG甲基化酶反应，使用标准的，根据制造商的协议市售硅胶膜上清理试剂盒进行DNA的清理。 DNA的显著损耗发生以下的CpG甲基化酶反应，30-60％的损失。
8. 通过中Hpa II酶切验证质粒甲基化。
9. 取1微克的甲基化或非甲基化DNA和限制在37℃下消化用的Hpa II 1小时。使用5-10个单位的Hpa II为每微克DNA。继中Hpa II消化，使用的是首选，市售的硅胶膜清洁套装进行DNA清理。运行在100V在TAE或TBE缓冲液的1％琼脂糖凝胶的DNA在两个CpG的甲基化和非甲基化的质粒45分钟进行可视化（图4B）。
10. 受试者都甲基化和非甲基化的质粒双重消化用合适的限制性酶释放的全长的luc 2（矢量）和CpG岛（插入） ^片 38。以下，根据制造商的协议消化进行双酶切O / N在适当的温度和热灭活酶。在双酶切出现DNA浓度的损失降到最低。
11. 运行在1％琼脂糖凝胶双酶切质粒在100V 1小时，以允许分离ö˚F载体和插入（图4C）。注意事项。戴防护紫外线面罩，放置在桌面黑光DNA凝胶可视化的乐队。基于大小，消费甲基化和非甲基化的插入和非甲基化的载体用干净的手术刀。
12. 凝胶提取DNA用饱和酚，pH值6.6。简单地说，衡量含载体或插入DNA凝胶。用100微升苯酚每0.1克DNA凝胶。用玻璃Dounce匀浆均质DNA凝胶苯酚。
13. 加氯仿（以苯酚量的1/5），并摇动样品20秒。孵育的样品在RT 2-3分钟。离心15分钟以最大速度（16.1×1,000 XG）在4℃。
14. 除去水溶液，并添加3M乙酸钠和乙醇2.5X体积0.1X体积。孵育样品1小时，在-80℃下。孵育后，除去乙醇并于30μl优选缓冲液重悬的DNA。 DNA的显著损失发生的插入和载体以下隔离，30-50％LOSS。
15. 再结扎甲基化和非甲基化的插入物，使用T4 DNA连接酶³⁸未甲基矢量。使用1：4的比例矢量的插入用于连接反应。根据制造商的说明书设置反应。使用50微升的总体积的反应和孵化O / N在-20°C或在冰上用盖在冰桶。
16. 连接后，使用的是首选，市售的硅胶膜清洁套装进行DNA清理。的DNA显著损失发生以下的连接反应，DNA的近似30-50％的损失。验证重新结扎通过在1％琼脂糖凝胶的DNA 45分钟运行，在100 V和评估的重新连接质粒（图4D）的浓度。
17. 染甲基化或非甲基化的质粒导入使用根据制造商的协议的市售的转染试剂D54细胞。种子D54细胞到12孔板，在一个^0.14×10 6个细胞/孔。
18. 继24小时，转染细胞无线个相等的浓度，无论（1）非methyated CpG的luc2质粒+海肾或其他控制荧光素酶载体或（2）甲基化的CpG-luc2质粒+海肾或其他控制荧光素酶载体。
19. 让细胞进行双荧光素酶检测前转24小时。根据制造商的说明进行检测。执行用光度计读数。一式三份阅读每口井。
20. 计算萤火虫荧光素酶活性的比为海肾或其他控制的荧光素酶的活性。通过将甲基化荧光素酶活性非甲基化的荧光素酶控制的荧光素酶：规范化甲基化萤火虫：控制荧光素酶的活性，以非甲基化的萤火虫

Results

经由的eGFP-S100β转基因动物^27的 FACS分选被收购的星形胶质细胞的富集群。由于降低年龄P0-P40细胞和年龄超过出生后第50天（P50）动物中分离分子的分子，动物的质量是最适合这样的实验。皮质组织被用于这些实验。从两个到六个动物皮质合并在一起。流式细胞仪在UAB综合流式细胞仪核心设施进行。在Becton Dickinson公司FacsAria II进行排序。采用488 nm激光获得绿色荧光蛋白的激励;没有补偿是必要的。基于前向和侧向散射（ 图1B）门控人口目标。阿活细胞群体，用溴化乙锭死细胞指示器确定和门（图1C）。基于所述的eGFP轮廓（ 图1D），观察两个不同的种群。通过经验性测试，细胞群更高的eGFP信息被确定为的eGFP阳性细胞群体（图1F-F''）。第二群体与低级eGFP的轮廓的视觉分析显示表达eGFP的细胞碎片，但不含细胞核，可能代表来自星形细胞过程（ 图1G-G''）碎片。解离的eGFP阳...

Discussion

该协议描述了通过FACS以及允许DNA甲基化和基因表达之间进行相关和致病研究的各种技术分离富集的星形胶质细胞群。这些技术单独或组合使用，对于处理高细胞异质性组织或对特定基因或基因区域的 DNA 甲基化状态与整体 DNA 甲基化变化感兴趣的实验室特别有用。研究中枢神经系统表观基因组的一个相对独特的挑战是细胞群的多样性。由于感兴趣的基因可能在中枢神经系统中以不同程度的表达，具有时间和空间上独特的模式，因此使用整个组织通常会混淆转录和 DNA 甲基化研究的数据。

Kir4.1 是感兴趣的蛋白质，在星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜细胞中受到空间和时间调节 ^13,14,40-47。因此，使用eGFP-S100β转基因动物 ²⁷ 进行FACS提供了丰富的星形胶质细胞群 ¹⁵，因此可以更准确地评估该细胞群特异性的基因转录和DNA甲基化水平。尽管有这个优势，但使用 FACS 分选星形胶质细胞仍存在一些挑战。制备用于FACS的细胞悬液需要对整个组织进行重大破坏，并改变温度和外部培养基环境。虽然维持 pH 值和温度以促进细胞活力并稳...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
甲基引物	Applied Biosystems	在线	软件，用于定位 CpG Islands
EZ DNA 甲基化试剂盒	Zymo Research	D5001
大鼠预混校准标准	EpiGenDx	80-8060R-Premix
CpG 甲基化酶 （M.Sssl）	Zymo Research	E2010
QIAquick 凝胶提取	QIagen	28704	用于凝胶提取和 DNA 纯化
限制性内切酶	New England BioLabs
NEB 切割机	New England BioLabs	在线	验证限制性内切酶位点
双荧光素酶报告基因检测系统	Promega	E1910
Luc2 载体，pGL4.10	Promega	E6651
海肾载体，pGL4.74	Promega	E2241
TD-20/20 光度计	特纳设计
Lipofectamine LTX 和 Plus 试剂	Life Technologies	A12621
苯酚，饱和 pH 值 6.6/6.9	Fisher Scientific	BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c 分光仪	ThermoScientific
MeltDoctor 预混液	Life Technologies	4415440
高分辨率熔解 （HRM） 软件 v2.0	Life Technologies	4397808
AB SDS 软件 v2.3	Life Technologies	在线
AB 高分辨率熔解入门指南	Life Technologies	在线
AB 7900HT Fast 实时系统	Life Technologies