中度产前酒精暴露与成年大鼠社交行为的量化分析

摘要

本方案旨在描述在产前大脑发育期间使大鼠暴露于中等水平酒精，并在成年期量化其社交行为变化的方法。

摘要

社交行为的改变是胎儿酒精谱系障碍（FASDs）儿童中观察到的主要负面后果之一。多家独立实验室已证实，在大脑发育期间暴露于酒精的啮齿类动物，其社交行为在广泛的暴露持续时间、暴露时期、剂量和行为量化年龄条件下均表现出显著改变。本实验室先前的研究已确定，在大鼠中度产前酒精暴露（PAE）后，特定形式的社交互动出现可靠且持续至成年期的行为改变，包括扭打行为增加和探究行为减少。这些行为改变有助于识别受中度PAE影响的神经环路¹，可能对推进对与产前酒精暴露（PAE）相关的社会行为改变的神经基础的更全面理解具有重要意义。本文描述了实施中度产前酒精暴露的实验流程，其中雌性大鼠在妊娠期间自愿摄入乙醇或糖精（对照），以及对成年后代社会行为的测量方法。

引言

据估计，有1%至5%的儿童被诊断患有胎儿酒精谱系障碍（Fetal Alcohol Spectrum Disorders, FASDs）²，其中包括胎儿酒精综合征（Fetal Alcohol Syndrome, FAS）、部分性FAS（pFAS）以及酒精相关性神经发育障碍（Alcohol-Related Neurodevelopmental Disorders, ARNDs）³。社会行为和认知功能缺陷是FASD患儿中最常见的不良后果之一^4-7。不良影响并不仅限于重度产前酒精暴露（PAE）；即使是中度PAE，虽未导致FAS典型的显著形态学、行为和认知缺陷，仍可在FASD人群^8-10以及大脑发育期间接触乙醇的非人类动物中引起相对轻微但持续存在的功能缺陷¹¹。鉴于目前估计显示，大多数FASD病例属于该谱系中较轻的范围，因此深入理解中度PAE所导致的行为及相应神经生物学后果显得尤为重要¹²。

多个独立实验室已报道，在大脑发育期间暴露于乙醇会导致啮齿类动物的社会行为发生改变，包括探究和互动行为减少^1,13-15、玩耍行为异常^14,16,17、攻击性互动增加^17,18、对社会刺激反应性的改变^19-21，以及社会获得性食物偏好和社会识别记忆的缺陷²²。在重度（血液乙醇浓度（BEC）~300 mg/dL）^22,23或较轻度（BEC ~80 mg/dL）¹乙醇暴露后均观察到社会行为缺陷，且这些缺陷在其他重要因素的广泛参数范围内均存在，包括暴露时机、暴露持续时间以及行为测定时的年龄。

先前的研究表明，成年期特定社交行为的改变能够区分产前暴露于中等剂量酒精的幼鼠与暴露于糖精的对照组动物^1,18。特别是，中等程度的产前酒精暴露（PAE）始终与成年期 wrestling 行为显著增加相关，提示攻击性行为增强，同时社交探究行为（e.g.，对同伴的嗅探）水平降低。由于社交行为的改变是 PAE 可靠的后果，因此在 PAE 后对社交行为进行量化，可能有助于更全面地理解 PAE 相关社交行为改变的神经基础，并推动干预策略的发展。本文及配套视频的目标是提供中等剂量 PAE 实验方案的详细操作指导，以及成年子代社交行为的量化方法，这些方法已可靠地区分了产前酒精暴露与未暴露的大鼠子代。

方案

本文及配套视频中所述所有操作程序均已获得新墨西哥大学健康科学中心和主校区机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 产前乙醇暴露

1. 准备所有必需的材料和化学品：糖精钠盐水合物、190 proof 乙醇（体积分数为95%的酒精）、珠状玻璃饮水管、天然白色橡胶 #4 单孔塞、1" 弯管-圆珠笔头型、从 www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers/ 打印的纸质标尺。
2. 从供应商或其他来源获取已验证的成年繁殖用大鼠。本实验方案中所使用的方法及代表性数据均采用 Long-Evans 品系繁殖鼠。雌鼠到达时体重为125–150 g，年龄为6–7周，使其在交配时（步骤1.5）约为9–10周龄。确保所有待用雌鼠均为初产母鼠。雄鼠应在到达时为12周龄，并在开始繁殖程序时达到15周龄。
3. 将动物单独饲养于塑料笼中，环境温度为22 °C，采用反向12小时光照/黑暗周期（光照时间为21:00至09:00）。在整个研究期间（包括所有饮水阶段）自由供应食物和自来水。在进入步骤1.4之前，至少给予1周时间以适应新环境。
4. 记录每只雌性大鼠的基础体重。
5. 在雌性大鼠妊娠前评估其饮水水平，持续2周。按顺序执行步骤1.5.1–1.5.6。
   1. 在第1天和第2天，使用含有0.066%糖精溶液（不含乙醇）的饮水管。为量化摄入量，在填充液体前，将带有毫米刻度的纸质标尺贴附于饮水管上。此方法可减少通过称重饮水管来测定乙醇消耗量时产生的误差。将液体加至标尺上的20 mm刻度处。每日四小时的饮水阶段（步骤1.5.1–1.5.6和1.7）从黑暗期开始后1小时（即10:00）启动，此时动物活动和饮水行为最活跃。
   2. 每次饮水阶段结束后，测定消耗的糖精溶液体积。为便于测量，应预先确定标尺上每毫米对应的溶液体积，并将毫米读数转换为体积值。对于推荐使用的饮水管，每毫米对应0.366 ml。
   3. 在第3天和第4天，使用含2.5%乙醇（v/v）和0.066%糖精的自来水溶液填充饮水管。每次阶段结束后，测定消耗的乙醇溶液量（以每千克体重消耗的克数表示）。
   4. 从第5天起及之后，使用含5%乙醇（v/v）和0.066%糖精的自来水溶液填充饮水管。每次阶段结束后，测定消耗的乙醇溶液量（以每千克体重消耗的克数表示）。
   5. 完成妊娠前饮水阶段后，称量大鼠体重，并计算整个组别的平均乙醇摄入量及其标准差。剔除摄入量高于或低于群体均值超过1个标准差的大鼠，以降低妊娠期间自愿饮酒行为的变异性。
   6. 将剩余的大鼠分配至糖精对照组或产前乙醇暴露（PAE）组，确保两组在妊娠前的饮水水平尽可能匹配。
6. 在1–14天内，将每只雌性大鼠与一只已验证的雄性繁殖鼠配对。雌鼠在繁殖阶段不摄入乙醇。通过观察阴道栓的存在确认是否怀孕，称量雌鼠体重，并将其单独饲养。此日定义为妊娠第1天。可选操作：让雌鼠与雄鼠共处最多5天，若未发现阴道栓，则将该雌鼠从实验中剔除。
   注意：由于妊娠期间乙醇摄入从妊娠第1天的10:00开始，因此检查阴道栓应在该时间之前完成。
7. 在整个妊娠期间，每天提供4小时（10:00至14:00）的乙醇或糖精溶液。
   1. 从妊娠第1天开始，根据分组情况，向雌鼠提供含0%或5%乙醇及0.066%糖精的自来水溶液。确保糖精对照组大鼠摄入的0%乙醇溶液体积与乙醇组大鼠摄入的5%乙醇溶液的平均体积相匹配。每次饮水阶段结束后，测定消耗的乙醇溶液量（以每千克体重消耗的克数表示）或糖精摄入量。
   2. 每周称量一次孕鼠体重，以评估母体增重情况。
   3. 始终提供食物和自来水，包括在饮水阶段期间。
   4. 当仔鼠出生后，停止乙醇暴露程序。记录活产仔鼠数量及出生时体重。将出生日定义为出生后第0天。
   5. 在出生后第2–3天左右将每窝仔鼠数量调整至10只。尽量保持每窝中雄性和雌性仔鼠数量相等。若无法实现，则调整至总数10只，允许性别比例不均。
   6. 在出生后2–3天记录仔鼠体重。
   7. 大约在出生后第21–24天断奶，并将同性别且具有相同产前处理条件的仔鼠两两合笼饲养。每个实验中每窝使用的动物不得超过1–2只，以减少潜在的窝别效应。

2. 社会行为

1. 获取并准备所有必需的材料和设备。
   1. 准备用于社会交互的装置。使用顶部开放、由易于清洁和消毒的材料制成的实验箱。装置正面应覆盖一层坚固的透明塑料（约 2 mm 厚度），以便拍摄。在装置内壁和底部铺设透明塑料（约 2 mm 厚度），以方便清洁和控制气味。在后内壁放置镜子，以辅助后续分析。
      注意：本文报告的代表性数据使用了定制实验箱（长 95 cm × 宽 47 cm × 高 43 cm），顶部开放，内部侧面和底部覆盖 2 mm 厚的坚固透明塑料，并在后壁放置镜子。虽然具体尺寸和材料对社会行为的测量并非关键，但建议尺寸应足够大，以确保能够将真正的社会交互与其他行为区分开来。即，装置应足够大，使动物不会始终彼此靠近。
   2. 准备可在低光或无光条件下录像的摄像机，因为所有拍摄均在可见光谱内无或极少环境光照下进行。确保摄像机在红外光谱范围内具有高分辨率，但任何可在其原生夜间模式下或配合额外红外照明设备在黑暗条件下录像的摄像机均可满足要求。
   3. 在装置周围布置红外照明器，以改善视频录制中的装置照明。
   4. 准备实验室级木屑（白杨木屑）。
   5. 准备刷子、簸箕、二氧化氯和异丙醇（70%），用于在每次实验间隔期间清洁装置并控制气味。
2. 装置适应与社会行为
   1. 在实验的这一阶段，对至少 90 日龄的成年大鼠进行测量。
   2. 每次实验前，清除装置中的木屑，用异丙醇擦拭装置以控制实验间气味，并铺上新鲜木屑。确保木屑完全覆盖装置底部。根据需要使用适当的试剂（如二氧化氯）对装置进行清洁和消毒。
   3. 连续三天，将一只动物与其笼伴放入实验箱中 30 分钟，使动物适应装置环境。在适应期期间，关闭房间内所有灯光。
   4. 在第三次适应期结束后，将动物单独饲养于新笼中，提供新鲜垫料、食物和水，持续 24 小时，以促进其后续的社会交互动机。
   5. 在动物分离后 24 小时的次日记录社会交互行为。
      1. 从装置中清除木屑，用二氧化氯清洁和消毒，再用异丙醇擦拭以控制气味，并在实验前更换新的木屑。
      2. 放置一个或多个摄像机以记录交互过程。至少将一台摄像机置于装置前方，使装置后壁的镜子可为分析提供额外视角。
      3. 依次取出动物，并将其置于摄像机前，以便记录毛发花纹的独特特征。这些毛发特征可用于分析时区分大鼠，而无需对动物进行人工标记。
         注意：由于啮齿类动物的许多社会交互行为涉及嗅觉信号和嗅闻同伴，应尽可能避免引入外来气味。Long-Evans 大鼠通常具有可用于区分任意一对个体的毛发花纹特征。对于其他品系（例如，Sprague-Dawley 大鼠），可采用替代方法，如用无味染料标记尾巴。需注意的是，许多关注的行为是针对特定目标的（例如，针对尾基部附近的肛殖区嗅闻、针对颈背部的 playful 攻击，或针对体侧或腹部的攻击性攻击）。建议将标记位置靠近尾尖，远离这些关注的目标区域。
      4. 至少录制 12 分钟的社会交互视频。
      5. 在整个实验过程中监测动物是否发生打斗。如有可能，应通过监视器或观察窗进行观察，确保实验人员不在实验室内。
         注意：在成年大鼠的研究中，打斗行为极为罕见，但仍需全程监测动物。若出现过度打斗或动物受伤迹象，应立即终止实验。
3. 行为编码与分析。
   1. 根据以往关于 PAE^1,18 的研究，识别以下关注行为。量化以下行为的持续时间、发生频率及首次出现的潜伏期：扭打（包括压制）、拳击、从同伴上方或下方爬行穿越、肛殖区嗅闻、对同伴身体其他部位的嗅闻（身体嗅闻）、异体理毛（对同伴的理毛行为）、直立、以及在木屑中的嗅闻/挖掘行为。本文视频部分展示了每种行为的示例。
   2. 从视频中量化关注的社会行为。获取每种关注行为的发生频率、总持续时间和首次出现的潜伏期。
      注意：这些测量可通过人工完成，但建议使用计算机对数字化视频进行分析以实现量化。本文提供了一个 Matlab（www.mathworks.com）脚本作为补充材料，用于视频回放和行为量化。
   3. 在完成所有大鼠的行为编码后，使用统计软件包对所得的持续时间、频率和潜伏期数据进行分析。

结果

经过多轮繁殖，处于乙醇条件下的雌性大鼠在每次持续4小时的饮酒阶段中，平均每次摄入约2.1 g/kg的乙醇。母鼠在饮水管引入后的前15至30分钟内即消耗了4小时总量的大约一半，导致在45分钟时测得的母体血清乙醇浓度峰值约为60 mg/dl。在随后剩余的3.5小时饮酒期内，它们以较低但相对稳定的速率继续摄入5%乙醇，约为0.4 g/kg体重/小时。这种水平和模式的自愿性乙醇摄入对母体体重增长、子代出生体重、产仔数、母体护理行为、胎盘湿重、行为测试时子代体重，以及全脑、海马或小脑湿重均无显著影响。

雄性大鼠在糖精和乙醇暴露后各项行为指标的代表性均值及标准误（SEM）见表1。这些数据来自先前的实验，每种产前处理条件均包含16只雄性动物。所有动物均与同一种产前处理条件的同伴配对。在本研究采用这些实验程序的情况下，尚未观察到雌性动物社交行为中与酒精相关的显著改变¹；然而，使用其他实验程序已记录到雌性社交行为中与酒精相关的差异^15,23。使用Mac版SPSS 21版本进行的独立单变量方差分析（ANOVAs）显示，产前乙...

讨论

产前酒精暴露范式在此描述的是大鼠母体在妊娠期间自愿摄入乙醇（5% v/v）的过程。文献中存在多种用于在脑发育期间对非人类动物进行乙醇暴露的实验方案，这些方案在乙醇给药的时间、剂量、持续时间、给药途径以及所研究的物种方面各有不同。尽管本文未对各种暴露方案的优缺点进行详尽讨论，但重点强调了本方案所述的自愿饮酒法在产前酒精暴露（PAE）研究中的若干优势。此前，我们曾采用液体饮食方案——该方法在该研究领域中较为常见，即大鼠母体将5%乙醇作为主要食物来源的一部分进行摄入²⁴对照条件包括一对喂养组，其热量摄入与摄入乙醇的母鼠相匹配，以及另一组 随意摄取 可自由取用鼠粮。在此描述的自愿饮酒范式中，两组大鼠（乙醇组与糖精组）均摄取相同的鼠粮饮食，这可降低组间在营养和热量摄入方面的变异性，并最大限度减少因被迫摄入不熟悉食物来源而可能产生的应激干扰。²⁵这一自愿饮酒范式的特点还消除了对配对喂养对照组的需求，而液体饲料方法则需要此类对照组，因此带来了一些实际和伦理上的优势，包括减少实验组数量（从三组减至两组）、减少研究所用动物数量以及降低相关研究成本。自愿摄入乙醇的4小时间歇暴露模式所产生的饮酒水...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水合糖精钠盐	Sigma	S1002
190 proof 乙醇	Sigma	493538
珠状玻璃饮水管	Fisher	14-955K
天然橡胶白色 #4 单孔塞	Plasticoid	LSG4M181
1" 弯管-圆珠笔尖型	Ancare	TD-199-3"
纸质直尺	N/A	N/A	www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers
社交互动实验装置	定制	N/A	95 cm × 47 cm × 43 cm
视频摄像机	N/A	N/A	可记录低光或无光条件
红外照明器	Vitek	VT-IR1-12
Teklad 实验级 Sani-Chips 垫料	Harlan	7090A
刷子和簸箕	N/A	N/A
异丙醇	Sigma	W292907
二氧化氯（1.5 mg 片剂）	Quiplabs	N/A	按生产商推荐方法配制