大鼠使用超声技术药物引起的肾血流动力学障碍的早期检测

摘要

早期血流动力学功能障碍对肾脏疾病的发展至关重要。然而，检测方法有限。超声检查的最新进展为肾损伤的早期检测提供了一种无创、准确的选择。本研究概述了一种使用药物诱导的肾毒性大鼠模型检测肾功能障碍的分步超声方法。

摘要

肾功能正常，以保持血流动力学稳态和是由药物毒性损害的主要部位。药物引起的肾毒性估计危重病人导致的急性肾损伤（AKI）的所有临床病例19- 25％。 AKI检测历来依靠指标，如血清肌酐（SCR）或血液尿素氮（BUN），这是在肾功能不全的早期肾毒性的全面评估明显不足。目前，对在AKI的早期阶段正确地检测血流动力学改变，而这种改变可能实际上先于血清生物标记物水平的上升不健壮的诊断方法。这种早期发现可以帮助医生作出准确的诊断，并有助于在决策制定治疗策略。大鼠用顺铂治疗诱导AKI。肾毒性进行了评估，使用高频超声，可控硅测量六天后的组织病理学肾。使用二维和彩色多普勒血流图像评价被用来研究连续大鼠肾毒性，使用超声检查。我们的数据通过组织学检查显示，成年大鼠成功的药物性肾损伤。彩色多普勒基于AKI的超声评估显示，阻力指数（RI）和搏动指数（PI）治疗组均增加;和峰收缩速度（毫米/秒），舒张末期速度（毫米/秒）和速度 - 时间积分（VTI，毫米）在肾动脉在同一组降低。重要的是，通过超声检查评估这些血流动力学改变之前血肌酐水平的上升。因此，基于超声指数如RI或PI可在啮齿类动物肾功能下降的有用的预测指标。从在接受AKI大鼠肾脏我们基于超声观测，我们发现，这些无创血流动力学测量可以考虑在检测早期肾功能不全的准确，灵敏，可靠的方法。 ŧ他的研究还强调与研究动物的使用相关的伦理问题的重要性。

引言

血肌酐（SCR）一直是黄金标准指标来评估超过二十年的肾功能。最近，许多研究报告说，出现肾损伤比SCR中¹的变化要早得多。不过，也有用于检测在肾损伤包括药物引起的肾毒性的进程的初期出现血流动力学改变不稳健的方法。

药物引起的急性肾功能不全的血流动力学导致的肾组织的损伤，并进一步发展为肾功能衰竭^2,3。在过去的几十年里，研究表明，成像工具，如计算机断层扫描（CAT），功能性磁共振成像（fMRI）技术，并发挥超声血流动力学评估⁴的作用。在当前的成像工具，灰阶超声加上彩色多普勒技术，是最常用的建立和评估肾^3,5,6-解剖状态。 Sullivan 等。人与BonniN 等。人最近报道说，超声是在血管收缩和缺氧应激动物模型^7,8分析血流动力学改变一个有效的，强大的，非侵入性的工具。这种技术也通常用于检测动脉狭窄^9,10。

在高分辨率超声成像领域最新的技术进步已经允许研究者使用高频率（25-80兆赫）和高分辨率（<0.03毫米分辨率）探针来解决心血管毒性，体内 ^11。我们推测，使用这种高分辨率的超声研究肾脏将为早期发现肾毒性的非侵入性和灵敏的方法了前所未有的机遇。

顺铂是用于治疗睾丸癌，卵巢癌，膀胱癌，头，肺，颈部癌症的组合与其他药物^12-14。顺铂已充分证明肾毒性是由于磷细胞坏死roximal小管（PT）和收集管导致上升的血液尿素氮（BUN）和SCR ^15。在此，我们提供了使用非侵入性的肾脏超声表征使用药物（顺铂）的大鼠模型肾功能不全的详细的一步一步的方法诱导的肾毒性。

方案

执行从查尔斯河实验室按照美国兽医协会（AVMA）的指引购买，使用批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议雄性SD大鼠的所有程序。

1.动物的制备和外科手术

1. 任何实验步骤之前适应所有动物一个星期。
2. 使用异氟醚麻醉的动物（2-3％诱导和1.0％维持），并应用眼膏双眼，防止干燥，发炎或溃疡。
3. 使用＃40刀片，并根据需要脱毛霜动物的胸部取出头发。它可能不得不删除头发形式动物的回来，如果我们不能有从腹侧成像获得了良好的图像数据。

2.肾毒性大鼠模型

1. 顺铂肾毒性模型，管理顺铂，使用协议š如前所述^。15
2. 在基线，24小时前给予顺铂（0天）进行超声检查。 （请参阅步骤3中，成像协议）
3. 随机鼠（n = 6）分为两组。第1天，给予顺铂动物的体重计算（10毫克/毫升）（10毫克/千克体重，单剂量肾毒性感应），注射量（1毫升/ kg体重）），腹膜内研究组和生理盐水（ NS）对照组。
4. 麻醉动物如步骤1.2在24，48，72，96，120，顺铂给药后144小时。
5. 根据动物的麻醉平稳阶段使用高分辨率超声系统（参见材料和设备表）采取的图像。继续通过完全恢复从麻醉诱导成像期间监测动物的基本生理功能。
6. 在成像过程监控动物的生命体征：鼠温度：35.9-37.5，呼吸频率：66-144 /分钟，心脏率：250-600 /分钟。最佳生命体征在我们的研究中提出的阅读是：温度：36.5-37.0，呼吸频率：80-100 /分钟，心脏率：450〜550 /分钟。
   注意：使用静脉输液，并加热灯维持动物的正常生理条件，以减少外科手术和麻醉的效果。如有必要，在手术过程中协助机械通气机呼吸。然而，机械通气很少需要在该实验。

3.成像协议

注：超声机供应商提供长期成像过程加热平台。但是，我们不要用加热的平台，在我们的实验证明，因为它只需要5到15分钟。其控制对与连接到所述生理控制开关直肠温度计监测体温。

1. 肾脏（B模式）的横向图像：
   1. 使用MS 250超声与21兆赫的中心频率连接编到有源端口，应用预设设置为“通用影像”。
   2. 与平台上的动物仰卧，定位在动物使用的导轨系统的21兆赫超声波探头，中线和隔离主动脉。在这个位置上，探针角度为90度到左侧胸骨旁线（横轴）（ 图1A，B）。
   3. 从该位置滑动与动物的平台，使得探针现在是在肾动脉的水平（左或右，可以形象一次一个）。
   4. 通过使用显微操作，查看的右侧或左侧肾动脉。
   5. 由沿着探针的y轴稍微倾斜，以获得在屏幕的中心的完整肾视图调整探头角度。
   6. 一旦适当地标（肾盂，肾动脉）， 如图1C和D，电影商店使用允许与所使用的探针的最高帧速率的图像示出被识别。
2. 肾（彩色多普勒视图）的横向图像：
   1. 使用键盘上的彩色多普勒键，打开彩色多普勒声窗。这有助于隔离肾动脉和肾静脉（ 图1D）。 （蓝色代表动脉血流;而红色表示静脉血流）。
   2. 确保焦点深度（在Y轴上以和黄色箭头指示）位于肾脏的中心。录制电影存储中的数据。
   3. 确保记录在尽可能高的帧速率可能的（> 200帧/秒）的数据。
3. 肾（脉冲波或PW视图）的横向图像：
   1. 点击PW关键，而在彩色多普勒模式，调出屏幕（ 图1F）上的黄色指示线（脉冲多普勒取样容积）。
   2. 放置在肾动脉黄线，在该通过PW角度键平行通过容器的流动的方向性的角度。
   3. 对于在右肾动脉流动评估，将PW黄色指示线沿流动方向的肾动脉（这在图1（D）蓝色和E示出）确保了多普勒角为60度以下。
   4. 在这种模式下，accoustic窗口分割成上部和下部。
   5. 使用电影存储捕捉到的指示在峰值收缩和舒张动脉流动的速度的波形图像。

4.动物处理成像后

1. 从第0天至第5天，将动物到一个干净的恢复区（带床上用品干净的纸巾）在成像后胸骨斜卧位。请注意，我们处理极为谨慎所有动物与攻击性的动物，如动物的“尾巴控股”的方法，从麻醉中恢复。
2. 在麻醉恢复，保持动物的体温与外部老天ŧ源和显示器动物与电探针生命体征，直到动物从麻醉中完全恢复。
3. 返回恢复动物设施住房房间时，他们是警觉和活跃。
4. 根据6日和收获肾脏机构准则安乐死所有动物（见步骤4.7）进行组织学评估，以及步4.5。
5. 收集附着在代谢笼肌酐测试，以检查肾功能收集管动物的尿。
6. 执行动物肾脏的石蜡切片，并进行HE（苏木和曙红）染色检查肾毒性（见步骤4.7查看详细）。
7. 牺牲动物和用0.9％NaCl溶液，接着用10％缓冲的福尔马林固定通过左心室抽血。用0.9％NaCl溶液放血后，取出大鼠肾脏组织学评估^16。
   1. 石蜡嵌入6毫米切片观察肾吗啉术和肾毒性。在4ºC脱水30％蔗糖肾组织在磷酸盐缓冲盐水（PBS）48小时。然后于4ºC固定在10％缓冲福尔马林区段24-48小时。
   2. 接着，嵌入石蜡肾组织，并在室温的组织石蜡块存储直到切片。进一步部使用石蜡切片机将组织块，并放置在一被涂覆载玻片的章节。
   3. Deparrafinize部分和再水化并用苏木染色10分钟，随后曙红3分钟。安装在一个幻灯片上的部分，并让他们通过一种啮齿动物病理学家进行评估。

5.数据计算与分析

1. 计算从3.2步获得的彩色多普勒超声图像肾动脉峰值速度。选择速度时间积分（VTI）工具跟踪收缩和舒张速度的峰值。
2. 使用方程计算阻力指数（RI）和搏动指数（PI）下面纳秒。
   RI =（收缩期峰值速度，舒张末期速度）/收缩期峰值速度
   PI =（收缩期峰值速度，舒张末期速度）/平均血流速度。
3. 执行的RI和PI结果与平均三个周期的测量标准偏差的统计分析。对于其他的标准参数，请参考手册从制造商使用专用软件进行数据分析（见材料和​​设备表）。

结果

在本研究中提出的图像是由一个操作员。使用高频超声机（请参阅材料和设备表）收集的所有图像。所有成像数据是由一个单一的研究者进行分析。结果表明，顺铂处理的动物有sCr的范围从0.5到在第6天（ 图2A）2.1（正常范围<1.1）。然而，组织学研究时相比生理盐水处理的动物表现出急性肾小管间质性损伤的一致的模式。

采用高分辨率的超声成像测量肾血流动力学改变，数据显示，没有与NS0天6日间治疗的动物形态的变化，而在动物在治疗Cisplain六年后一天被检测奇脉哲水蚤的形态。正常的RI和PI的上限为0.7和1.15，分别在大鼠^17。使用上述指标来评估血液动力学肾脏的变化，这表明，有在顺铂处理的动物在第6天的RI和PI的显著增加。

图1.大鼠探测肾脏图像超声装置的设置。动物阶段（A）和成像探头位置（B）的大鼠肾超声成像的操作期间的设定的成像系统的图解说明。采用高频，高分辨率超声系统（请参阅材料andand设备表）从大鼠肾得到的样品超声图像。 （CF）。这些数据表明在肾血管有足够的信息来进一步血流动力学参数测量和分析，明确肾脏解剖结构和血液流动。09fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2. 组织学和肾下顺铂治疗的大鼠的超声图像。血肌酐（SCR）和组织学研究提出车辆处理的大鼠和严重近端肾小管肾损伤（黄色箭头）正常肾组织中顺铂治疗的大鼠（A，B）。 sCr的顺铂治疗后略有增加，但仍维持在正常范围（<1.1）之内。车辆和顺铂处理的大鼠（C）的彩色多普勒模式大鼠的右肾的超声图像在第0天，第3，和6;血流动力学参数，RI和PI分别显著上升，由彩色多普勒超声（D，E）进行评估。正常的RI的上限为PI 0.7和1.15。更重要的，T他上面的数据显示这些血流动力学改变之前SCR的上升。脉搏波速度测量表明顺铂治疗后缓慢和微弱的脉冲（奇脉水蚤标志，黄色圆圈）与组织学研究成果相关。这种现象说明肾动脉狭窄，阻塞，进一步肾功能不全。组织学数据显示，成功的药物诱导肾小管肾损伤和超声评估表明使用彩色多普勒技术在RI，PI和脉搏波速度显著的变化。 N = 3，* P <0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

对于药物引起的AKI 表1. 肾血流动力学参数

讨论

在过去的十年中，许多进步都发生在超声技术，包括高频机械探头，它提供高品质，灵敏度和准确度超声数据的发展。这些探针可在5到12毫米和高帧速率（大于200帧/秒）的穿透深度为大约50微米轴向分辨率，因此，它可以作为一个强大的工具来研究小动物如大鼠和小鼠^{18 19。}另外，它也允许收集关于轻度镇静或清醒动物的超声图像与在生理水平的生命体征。此外，这种非侵入性的方式也提供了机会，以在不牺牲动物¹⁹执行的疾病进展过程中的结构和功能的改变纵向评估。

1959年，博士。 Rusell和刷最初描述的三个“R”规则（替换，减少和细化），以提高AWAR在研究中使用动物伦理问题eness。该协议显示了首次非侵入性的小动物超声可以利用下Nephorotoxicity研究最少痛苦，折磨或痛苦最小数量的动物。因此，它是为满足实验动物的三个“R'规则的潜在有效方式。

许多超声研究都集中在心脏应用;肾功能评估，往往是从心的状态而不是肾脏^20-25的直接研究测量得出。我们已经建立了一个成像方法，以可视化的肾脏实时解剖和功能的变化。我们使用了预先选择的一组互补的声学窗，灰阶/ B模式和彩色多普勒，特异于肾视图。我们所使用的RI和PI指数来评估这些指数与肾功能中的顺铂诱导的毒性模型中的变化之间的关系。

但是，也有一些挑战和限制所提出的成像方法如下：1）麻醉剂的适当选择和麻醉的程度是心脏和呼吸稳定性是至关重要的。不一致的生理现象（包括呼吸和心脏的波动）影响肾动脉血流，成像和肾功能评估的质量。我们将使用IACUC批准注射麻醉剂，戊巴比妥（50毫克/公斤体重，IP），如我们的备份麻醉剂，以确保在成像和肾功能的评估在适当的正常生理功能; 2）脱毛是关键的一步，为胸毛存在影响了超声图像的质量; 3）当肾脏超声检查是受过训练的操作相对简单;对于一般的操作者，这是至关重要的，以适应技术动物个体的独特解剖学和作出轻微的操作; 4）如大鼠的尺寸是相当大的（大于350克），较低的频率探针（小于在这项研究中21兆赫使用）可能需要最佳成像。这可能是谨慎的成像系统的操作建议之前采取的培训课程。

在使用超声提出的方法和衍生协议检测药物肾毒性的新颖之处在于对肾损伤的情况下，血流动力学改变其早期强大的检测。结果表明，事实上，肾内血管血液动力学变化先上升血肌酐。这些数据是使用组织学分析对常规金标准基准，并证明小动物超声是一种无创，敏感和可重复的方式，其具有动物使用的最低限度的要求。因此，这是早期发现使用大鼠模型药物引起的肾毒性的有效工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脱毛膏	Miltex， Inc.	Surgi-Prep	在成像前 24 小时应用
顺式-二胺铂 （II） 二氯化物	Sigma	479306	诱导小动物急性肾损伤。
Isoflurane	Baxter International Inc. 公司	NDC 10019-773-40	2-3% 用于诱导，1-1.5 % 用于维持;心跳将保持在每分钟 500 次以上高频
超声	FUJIFILM VisualSonics， Inc.	Vevo 2100
高频机械传感器	FUJIFILM VisualSonics， Inc.	MS250、MS550D、MS400