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利用超声技术在大鼠中早期检测药物诱导的肾血流动力学功能障碍

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DOI：

10.3791/52409

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2016年3月11日

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1Cardiac Muscle Research Laboratory, Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Renal Division, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

本文内容

摘要

早期血流动力学功能障碍对肾脏疾病的发展至关重要，然而目前的检测方法仍存在局限性。近年来超声技术的进步为肾脏损伤的早期检测提供了一种无创且准确的选择。本研究详细阐述了一种利用药物诱导的肾毒性大鼠模型，通过超声成像逐步检测肾功能障碍的方法学流程。

摘要

肾脏通常具有维持血液动力学稳态的功能，同时也是药物毒性导致损伤的主要部位之一。据估计，药物引起的肾毒性在重症患者所有急性肾损伤（AKI）临床病例中占19-25%。历史上，AKI的检测主要依赖血清肌酐（sCr）或血尿素氮（BUN）等指标，但这些指标在肾功能障碍早期阶段对肾毒性的全面评估明显不足。目前尚无可靠的诊断方法能够准确检测AKI早期阶段的血液动力学改变，而此类改变实际上可能早于血清生物标志物水平的升高。实现早期检测有助于临床医生做出准确诊断，并为治疗策略的决策提供支持。本研究采用顺铂处理大鼠以诱导AKI，并在六天内通过高频超声成像、sCr测定以及肾脏组织病理学检查评估肾毒性。利用二维（2D）和彩色多普勒超声图像对大鼠肾毒性进行连续性血液动力学评估。组织学检查结果显示，成年大鼠成功建立了药物诱导的肾脏损伤模型。基于彩色多普勒的超声评估表明，治疗组的阻力指数（RI）和搏动指数（PI）升高；同时，肾动脉的收缩期峰值流速（mm/s）、舒张末期流速（mm/s）以及流速-时间积分（VTI, mm）均降低。重要的是，这些通过超声评估的血液动力学变化早于sCr水平的上升。因此，基于超声的RI或PI等指数可作为啮齿类动物肾功能下降的有用预测标志物。根据经历AKI的大鼠肾脏超声观察结果，我们发现这些无创性血液动力学测量方法可能成为检测早期肾功能障碍的一种准确、敏感且可靠的手段。本研究也强调了科研中动物使用相关的伦理问题的重要性。

引言

血清肌酐（sCr）作为评估肾功能的金标准指标已有二十多年的历史。近年来，许多研究报道，肾脏损伤的发生远早于sCr的变化1。然而，目前尚无可靠的方法用于检测肾脏损伤早期（包括药物引起的肾毒性）发生的血流动力学改变。

药物诱导的急性肾血流动力学功能障碍可导致肾组织损伤，并进一步发展为肾衰竭2,3。在过去几十年中，研究表明成像工具如计算机断层扫描（CAT）、功能磁共振成像（fMRI）和超声检查在血流动力学评估中具有重要作用4。在现有的成像技术中，灰阶超声联合彩色多普勒技术是最常用于建立和评估肾脏解剖状态的方法3,5,6。Sullivan et. al. 和 Bonnin et. al. 近期报道，超声检查是一种有效、强大且无创的工具，可用于分析血管收缩和缺氧应激动物模型中的血流动力学变化7,8。该技术也常用于检测动脉狭窄9,10。

高分辨率超声成像领域的最新技术进展使研究者能够利用高频（25–80 MHz）和高分辨率（< 0.03 mm 分辨率）探针， 体内11我们假设，利用这种高分辨率超声技术研究肾脏，将为无创且灵敏地早期检测肾毒性提供前所未有的机会。

顺铂用于治疗睾丸、卵巢、膀胱、头颈部以及肺癌，通常与其他药物联合使用12-14。顺铂具有明确记录的肾毒性，可导致近端小管（PT）和集合管细胞坏死，进而引起血尿素氮（BUN）和血清肌酐（sCr）升高15。本文中，我们提供了一种详细的分步方法，利用无创性肾脏超声检查，通过顺铂诱导肾毒性的大鼠模型来表征肾功能障碍。

方案

按照美国兽医协会（AVMA）指南，并使用经批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）方案，在购自查尔斯河实验室的雄性Sprague Dawley大鼠中进行所有操作。

1. 动物准备与手术操作

  1. 所有实验操作前，将动物适应环境一周。
  2. 使用异氟烷麻醉动物（诱导浓度为2-3%，维持浓度为1.0%），并在双眼涂抹眼膏，以防止干燥、刺激或角膜溃疡。
  3. 必要时使用#40刀片和脱毛膏去除动物胸部的毛发。如果从腹侧成像无法获得良好的图像数据，则可能还需去除动物背部的毛发。

2. 肾毒性大鼠模型

  1. 对于顺铂诱导的肾毒性模型，按照先前所述方案给予顺铂。 15
  2. 在顺铂给药前基线期及24小时（第0天）进行超声检查。（参见步骤3，成像方案）
  3. 将大鼠（n=6）随机分为两组。第1天，给予顺铂（10 mg/ml）（10 mg/kg体重，单次给药以诱导肾毒性），注射体积按动物体重计算（1 ml/kg体重）。 实验组腹腔注射目标物质，对照组腹腔注射生理盐水（NS）。
  4. 按照1.2步骤，在顺铂给药后的24、48、72、96、120、144小时对动物实施麻醉。
  5. 使用高分辨率超声系统（见材料与设备表）在动物麻醉稳定期进行成像。从麻醉诱导开始，直至动物完全恢复，持续监测其基本生理功能。
  6. 监测动物在成像过程中的生命体征：大鼠体温：35.9–37.5，呼吸频率：66–144次/分钟，心率：250–600次/分钟。本研究建议的最佳生命体征范围为：体温：36.5–37.0，呼吸频率：80–100次/分钟，心率：450–550次/分钟。
    注意：使用静脉输液和加热灯维持动物的正常生理状态，以尽量减少手术和麻醉的影响。必要时可在操作过程中使用机械呼吸机辅助呼吸，但在本实验中通常无需机械通气。

3. 成像方案

注意：超声设备供应商为长时间成像操作提供了加热平台。然而，在本演示实验中我们并未使用该加热平台，因为实验仅需5至15分钟。设备的温度控制由连接至生理控制开关的直肠温度计监测动物体温来实现。 

  1. 肾脏横切面图像（B模式）：
    1. 使用中心频率为21 MHz的MS 250超声设备连接至主动端口，将应用预设设置为“常规成像”。
    2. 将动物仰卧于平台上，利用轨道系统将21 MHz超声探头置于动物正中线位置，并定位腹主动脉。在此位置，探头与左侧胸骨旁线呈90度角（即横轴位）（图1A,B）。
    3. 保持动物与平台一起滑动，调整位置使探头到达肾动脉水平（可分别观察左侧或右侧肾动脉，每次成像一侧）。
    4. 通过使用微操纵器，观察右侧或左侧肾动脉。
    5. 轻微沿探头Y轴方向倾斜探头，调整其角度，以在屏幕中央获得完整的肾脏图像。
    6. 当识别出正确的解剖标志（肾盂、肾动脉），如图1C和D所示时，使用该探头所允许的最高帧率进行动态图像存储（cine store）。
  2. 肾脏横切面图像（彩色多普勒模式）：
    1. 按下键盘上的彩色多普勒键，开启彩色多普勒声窗。此模式有助于区分肾动脉与肾静脉（图1D）。（蓝色表示动脉血流，红色表示静脉血流）。
    2. 确保焦点深度（Y轴上黄色箭头所示）位于肾脏中心位置，并以动态图像存储方式记录数据。
    3. 务必以尽可能高的帧率记录数据（>200帧/秒）。
  3. 肾脏横切面图像（脉冲波或多普勒PW模式）：
    1. 在彩色多普勒模式下，点击PW键，屏幕上将出现一条黄色指示线（脉冲波多普勒取样容积）（图1F）。
    2. 使用PW角度键，将黄色指示线置于肾动脉内，并调整其角度，使其与血管内血流方向平行。
    3. 评估右肾动脉血流时，应将PW黄色指示线沿肾动脉血流方向放置（如图1D和E中蓝色所示），并确保多普勒角度不超过60度。
    4. 在此模式下，声窗将分为上下两个区域。
    5. 使用动态图像存储功能，捕获显示动脉血流在收缩峰值和舒张期流速的波形图像。

4. 成像后动物处理

  1. 从第0天到第5天，在成像后将动物置于清洁的恢复区域（垫料上铺有干净的纸巾），保持胸卧位。 请注意，对于具有攻击性的动物（例如从麻醉中恢复的动物），我们均采用“抓尾法”进行操作，且始终以极度谨慎的方式处理所有动物。
  2. 在麻醉恢复期间，使用外部热源维持动物体温 ，并使用电生理探头监测动物的生命体征，直至其完全从麻醉中恢复。
  3. 当动物恢复清醒并表现出活跃状态时，将其送回饲养设施房间。
  4. 在第6天根据机构指南对所有大鼠实施安乐死，并采集肾脏（见步骤4.7）用于组织学评估以及步骤4.5的操作。
  5. 从代谢笼上连接的收集管中收集动物尿液，进行肌酐检测以评估肾功能。
  6. 对动物肾脏进行石蜡切片，并进行苏木精-伊红（HE）染色以评估肾毒性（详见步骤4.7）。
  7. 处死动物后，经左心室用0.9% NaCl溶液灌注以放血，随后用10%中性缓冲福尔马林固定。在用0.9% NaCl溶液完成放血后，取出大鼠肾脏用于组织学评估16。
    1. 将6 mm的组织切片进行石蜡包埋，以观察肾脏形态和肾毒性。将肾脏组织在含30%蔗糖的磷酸盐缓冲液（PBS）中于4 ºC下脱水48小时。然后将切片在10%中性缓冲福尔马林中于4 ºC下固定24–48小时。
    2. 随后将肾脏组织包埋于石蜡中，并将石蜡块在室温（RT）下保存至切片前。使用石蜡切片机进一步对组织块进行切片，并将切片置于涂覆玻片上。
    3. 脱去切片中的石蜡，再水化后用苏木精染色10分钟，接着用伊红染色3分钟。将染色后的切片封片，并交由啮齿类动物病理学家进行评估。

5. 数据计算与分析

  1. 根据步骤 3.2 获得的彩色多普勒图像计算肾动脉峰值流速。选择速度时间积分（VTI）工具，描记收缩期和舒张期流速的峰值。
  2. 使用以下公式计算阻力指数（RI）和搏动指数（PI）。
    RI = （收缩期峰值流速 - 舒张末期流速）/ 收缩期峰值流速
    PI = （收缩期峰值流速 - 舒张末期流速）/ 平均流速。
  3. 对三次心动周期测量结果的 RI 和 PI 数据及其标准差进行统计分析。对于其他标准参数，请参考设备制造商提供的手册，使用其专有软件进行数据分析（见材料与设备表）。

结果

本研究中的图像均由一名操作人员采集。所有图像均使用高频超声仪采集（详见材料与设备表）。所有成像数据均由一名研究人员进行分析。结果显示，顺铂处理动物在第6天的血清肌酐（sCr）范围为0.5至2.1（正常范围＜1.1）（图2A）。然而，与生理盐水处理动物相比，组织学研究显示出一致的急性肾小管间质损伤模式。

采用高分辨率超声成像技术测量肾脏血流动力学变化，数据显示，经生理盐水（NS）处理的动物在第0天至第6天期间肾脏形态未发生改变，而顺铂处理后的动物在第6天出现小脉波形（pulsus parvus）形态。在大鼠中，阻力指数（RI）和搏动指数（PI）的正常上限分别为0.7和1.1517。利用上述指标评估肾脏血流动力学变化，结果表明，顺铂处理组动物在第6天RI和PI显著升高。

用于肾脏分析的超声设置、啮齿类动物实验、多普勒成像、肾动脉和肾盂。
图1. 大鼠肾脏影像检测的超声设备设置。 超声成像系统的示意图，显示了实验过程中动物放置平台（A）和成像探头位置（B）的设置。使用高频、高分辨率超声系统获取的大鼠肾脏样本超声图像（参见材料与设备表）。（C-F）。数据显示清晰的肾脏解剖结构以及肾血管中的血流情况，可为后续血流动力学参数的测量与分析提供充分信息。请点击此处查看该图的放大版本。

顺铂治疗效应；肌酐水平、组织学、超声、数据分析、柱状图。
图 2. 接受顺铂治疗大鼠的组织学与肾脏超声图像。 血清肌酐（sCr）和组织学检测显示，溶剂对照组大鼠肾脏组织正常，而顺铂处理组大鼠出现严重的近端小管肾损伤（黄色箭头）（A, B）。顺铂处理后 sCr 轻微升高，但仍处于正常范围内（<1.1）。在溶剂对照组和顺铂处理组大鼠中，于第 0、3 和 6 天采用彩色多普勒模式获取的右肾超声图像（C）；通过彩色多普勒超声评估，血流动力学参数阻力指数（RI）和搏动指数（PI）显著升高（D, E）。RI 的正常上限为 0.7，PI 为 1.15。重要的是，上述数据显示这些血流动力学变化早于 sCr 的升高。脉搏波速度测量显示，顺铂处理后脉搏缓慢而微弱（pulsus parvus 征象，黄色圆圈），与组织学检测结果一致。该现象提示肾动脉狭窄、阻塞及进一步的肾功能障碍。组织学数据表明成功建立了药物诱导的近端小管肾损伤模型，而彩色多普勒超声评估显示 RI、PI 和脉搏波速度均发生显著变化。N=3，*，p<0.05。 请点击此处查看本图的放大版本。

药物诱导的急性肾损伤的肾血流动力学参数图表，包含PI、RI、VTI、速度、血流量变化。
表 1. 药物诱导的急性肾损伤的肾血流动力学参数

讨论

在过去十年中，超声技术取得了许多进展，包括高频机械探头的开发，这些探头能够提供高质量、高灵敏度和高准确性的超声数据。这些探头在5至12毫米的穿透深度下可实现约50 µm的轴向分辨率，并具有高帧率（大于200帧/秒），因此可作为研究大鼠和小鼠等小型动物的有力工具18,19。此外，该技术还允许在轻度镇静或清醒动物、且生命体征处于生理水平的状态下采集超声图像。另外，这种非侵入性成像方式还提供了在不处死动物的情况下，对疾病进展过程中的结构和功能变化进行纵向评估的机会19。

1959年，Rusell和Brush博士首次提出了三项“R”原则（替代、减少和优化），以提高人们对科研中动物使用伦理问题的认识。本方案首次表明，在肾毒性研究中，无创性小动物超声成像技术能够在最小化疼痛、痛苦或应激的情况下使用最少数量的动物。因此，该技术是一种有望有效满足实验动物三项“R”原则的手段。

许多超声研究主要集中在心脏应用方面；对肾功能的评估通常源自心脏状态的测量，而非对肾脏的直接研究20-25。我们建立了一种成像方法，用于实时可视化肾脏的解剖和功能变化。我们采用了一组预先选定的互补性声窗，结合专用于肾脏成像的灰阶/B模式和彩色多普勒超声技术。我们利用阻力指数（RI）和搏动指数（PI）来评估这些指数与顺铂诱导毒性模型中肾功能变化之间的关系。

然而，所提出的成像方法存在一些挑战和局限性，如下所述：1）麻醉剂的适当选择以及麻醉深度对于维持心脏和呼吸的稳定性至关重要。生理现象的不一致（包括呼吸频率和心率的波动）会影响肾动脉血流、成像质量以及肾功能评估。我们将使用经IACUC批准的注射用麻醉剂戊巴比妥钠（50 mg/kg体重，腹腔注射）作为备用麻醉剂，以确保在成像及肾功能评估期间维持正常的生理功能；2）脱毛是关键步骤，因为胸部毛发的存在会影响超声图像的质量；3）尽管对于经过训练的操作者而言，肾脏超声检查相对简单，但对于一般操作者而言，必须根据每只动物独特的解剖结构调整技术，并进行细微的操作调整；4）如果大鼠体型较大（超过350克），可能需要使用较低频率的探头（低于本研究中使用的21 MHz）以获得最佳成像效果。在开展本成像系统操作前，接受相关培训课程可能是明智之举。

采用所提出的超声方法及衍生方案检测药物诱导的肾毒性，其创新之处在于能够早期、可靠地检测到肾脏损伤时的血流动力学变化。结果表明，肾内血管血流动力学的改变实际上早于血清肌酐（sCr）的升高。本研究以组织学分析这一传统金标准作为对照，验证了小动物超声成像是一种无创、敏感且可重复的技术，对实验动物的使用需求极低。因此，该方法是利用大鼠模型进行药物诱导肾毒性早期检测的有效工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Fred Roberts 提供出色的技术支持。感谢布莱根妇女医院心血管生理学核心实验室为本研究提供仪器设备和资金支持。本研究部分得到了美国国家心肺血液研究所（NHLBI）基金 HL093148、HL086967 以及（SUNDRY）部门基金的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
脱毛膏Miltex, Inc.Surgi-Prep成像前24小时使用
cis-二胺铂(II)二氯化物Sigma479306用于在小型动物中诱导急性肾损伤
异氟烷Baxter International Inc.NDC 10019-773-40诱导剂量为2-3%，维持剂量为1-1.5%；心率应维持在每分钟500次以上
高频超声设备FUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100
高频机械换能器FUJIFILM VisualSonics, Inc.MS250, MS550D, MS400

参考文献

  1. Bonventre, J. V. Diagnosis of acute kidney injury: from classic parameters to new biomarkers. Contrib Nephrol. 156, 213-219 (2007).
  2. Lerman, L. O., Textor, S. C., Grande, J. P. Mechanisms of tissue injury in renal artery stenosis: ischemia and beyond. Progress in cardiovascular diseases. 52 (3), 196-203 (2009).
  3. Karas, M. G., Kizer, J. R. Echocardiographic assessment of the right ventricle and associated hemodynamics. Progress in cardiovascular diseases. 55 (2), 144-160 (2012).
  4. Milman, Z., et al. Hemodynamic response magnetic resonance imaging: application for renal hemodynamic characterization. Nephrol Dial Transplant. 28, 1150-1156 (2013).
  5. Anavekar, N. S., et al. Usefulness of right ventricular fractional area change to predict death, heart failure, and stroke following myocardial infarction (from the VALIANT ECHO Study). Am J Cardiol. 101 (5), 607-612 (2008).
  6. Lindqvist, P., Calcutteea, A., Henein, M. Echocardiography in the assessment of right heart function. Eur J Echocardiogr. 9 (2), 225-234 (2008).
  7. Sullivan, J. C., et al. Novel use of ultrasound to examine regional blood flow in the mouse kidney. American journal of physiology. Renal physiology. 297, F228-F235 (2009).
  8. Bonnin, P., Sabaa, N., Flamant, M., Debbabi, H., Tharaux, P. L. Ultrasound imaging of renal vaso-occlusive events in transgenic sickle mice exposed to hypoxic stress. Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1076-1084 (2008).
  9. Desberg, A. L., et al. Renal artery stenosis: evaluation with color Doppler flow imaging. Radiology. 177 (3), 749-753 (1990).
  10. Ciccone, M. M., et al. The clinical role of contrast-enhanced ultrasound in the evaluation of renal artery stenosis and diagnostic superiority as compared to traditional echo-color-Doppler flow imaging. International angiology : a journal of the International Union of Angiology. 30 (2), 135-139 (2011).
  11. Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
  12. Boulikas, T., Vougiouka, M. Recent clinical trials using cisplatin, carboplatin and their combination chemotherapy drugs (review). Oncology reports. 11 (3), 559-595 (2004).
  13. Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of acute kidney injury. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48, 463-493 (2008).
  14. Hye Khan, M. A., Abdul Sattar, M., Abdullah, N. A., Johns, E. J. Cisplatin-induced nephrotoxicity causes altered renal hemodynamics in Wistar Kyoto and spontaneously hypertensive rats: role of augmented renal alpha-adrenergic responsiveness. Exp Toxicol Pathol. 59, 253-260 (2007).
  15. Vaidya, V. S., Bonventre, J. V. Mechanistic biomarkers for cytotoxic acute kidney injury. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (5), 697-713 (2006).
  16. Lu, T. S., Chen, H. W., Huang, M. H., Wang, S. J., Yang, R. C. Heat shock treatment protects osmotic stress-induced dysfunction of the blood-brain barrier through preservation of tight junction proteins. Cell stress, & chaperones. 9 (4), 369-377 (2004).
  17. Kaya, M. Hemodynamics - New Diagnostic and Therapeutic Approaches. , InTech. 1-30 (2012).
  18. Bjornerheim, R., Grogaard, H. K., Kjekshus, H., Attramadal, H., Smiseth, O. A. High frame rate Doppler echocardiography in the rat: an evaluation of the method. European journal of echocardiography : the journal of the Working Group on Echocardiography of the European Society of Cardiology. 2 (2), 78-87 (2001).
  19. Zhang, L., et al. A high-frequency, high frame rate duplex ultrasound linear array imaging system for small animal imaging. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency. 57, 1548-1557 (2010).
  20. Frea, S., et al. Echocardiographic evaluation of right ventricular stroke work index in advanced heart failure: a new index? J Card Fail. 18 (12), 886-893 (2012).
  21. Marwick, T. H., Raman, S. V., Carrio, I., Bax, J. J. Recent developments in heart failure imaging. JACC Cardiovasc Imaging. 3 (4), 429-439 (2010).
  22. Pokreisz, P. Pressure overload-induced right ventricular dysfunction and remodelling in experimental pulmonary hypertension: the right heart revisited. Eur Heart J supplements. 9 (Supplement H), H75-H84 (2007).
  23. Senechal, M., et al. A simple Doppler echocardiography method to evaluate pulmonary capillary wedge pressure in patients with atrial fibrillation. Echocardiography. 25 (1), 57-63 (2008).
  24. Souders, C. A., Borg, T. K., Banerjee, I., Baudino, T. A. Pressure overload induces early morphological changes in the heart. Am J Pathol. 181 (4), 1226-1235 (2012).
  25. Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).

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