流感病毒在鸡胚中的增殖

摘要

可孵化的鸡胚被广泛用于大量生产人流感A病毒，因其提供了一种便捷且经济高效的方法，可获得高产量的病毒。

摘要

流感感染每年在美国导致约36,000人死亡和超过200,000例住院。由于病毒不断发生突变和基因重配，新的流感病毒株持续出现，这使病毒的控制变得复杂，并需要持续开发新的药物和疫苗。在实验室中研究流感需要一种可靠且成本效益高的病毒扩增方法。本文提供了一种在受精鸡胚中高效扩增甲型流感病毒的全面方案，该方法可稳定获得高滴度的病毒储备液。简要而言，将无特定病原体（SPF）级别的受精鸡胚置于37 °C、55–60%湿度条件下孵育10–11天。在此期间，可通过照蛋仪方便地监测胚胎发育情况。通过注射器将病毒原液注入尿囊腔进行接种。接种后，在37 °C继续孵育2天，随后将鸡蛋在4 °C下冷藏至少4小时。然后小心打开气室上方的蛋壳和绒毛尿囊膜，收集含有病毒的尿囊液。通过离心去除杂质后，将尿囊液分装并转移至-80 °C长期保存。本方法每个鸡蛋可获得大量病毒液（每枚蛋5–10 mL），且通常能实现高病毒滴度，因此我们优先采用鸡胚法进行病毒制备，尤其适用于需要大量相同病毒储备液的高剂量 in vitro 研究。

引言

甲型流感病毒仍然是人类健康的重大威胁。它是一种可能带来严重后果的呼吸道疾病，全球疾病负担巨大，每年在全球范围内导致多达50万人死亡 ¹流感病毒属于正粘病毒科，其基因组包含8个负链单股RNA片段。 ^1,2. 高突变性（即，病毒基因组的抗原“漂移”导致无法产生长期免疫力。此外，流感病毒对抗病毒药物的耐药性日益增强 ³.

2009年H1N1流感大流行凸显了与流感疾病相关的所有挑战性问题（大流行毒株、抗病毒药物耐药性、疫苗生产延迟）。世界卫生组织每年都会确定疫苗配方，以应对最可能流行的致病性流感毒株（分别为H1N1、H3N2和乙型流感病毒各一种）⁴。由于该方法基于对流感毒株的预测，有时会出现致病毒株识别错误，导致疫苗效力显著下降。此外，新型流感毒株的出现可能绕过这些预防措施，引发大流行疾病²。

通用流感疫苗的研制一直难以实现⁵。因此，必须继续深入研究肺损伤的发病机制。为了促进实验室研究，目前已开发出多种病毒分离与扩增方法⁶。人流感病毒可在多种哺乳动物细胞基质中扩增，但大量制备高滴度病毒的最佳方法仍是在鸡胚中进行。以下方案描述了从现有病毒储备株中进行甲型流感病毒扩增与保存的技术。

方案

注意：一般说明：所有涉及卵操作的步骤均需在无菌条件下进行，并相应地采用无菌技术。使用前用70%乙醇对所有设备进行预清洁。通常，流感病毒的接种与收获应在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。然而，若本方案用于扩增致病性更强的流感病毒（例如，大流行及大流行前毒株、对家禽和牲畜具有威胁的毒株、高致病性禽流感毒株、1918年H1N1毒株），需要更高的生物安全等级，某些情况下还需采取生物安保措施并获得相应授权。所有涉及流感病毒的研究均应获得当地机构生物安全委员会的批准。

1. 接种用鸡蛋的准备

1. 从合适的供应商处获取无特定病原体（SPF）的新鲜受精禽蛋。通常使用鸡卵。卵应在到达后立即使用。
2. 卵到达后，将其放入带有自动转蛋器的加湿孵化箱中，以定期旋转卵。若无自动转蛋器，需每天手动旋转卵至少2–3次（务必佩戴手套，并尽可能保持无菌操作）。
3. 在37 °C、55–60%湿度条件下孵化10–11天。

2. 鸡蛋照检

1. 使用验蛋灯在暗室中将鸡蛋置于明亮光源下照射，孵化约7至8天后通过照蛋检查鸡蛋是否未受精。
   1. 用70%乙醇擦拭验蛋灯。频繁更换手套，并用70%乙醇进行消毒，以尽量降低病原体污染的风险。
   2. 将鸡蛋从孵化箱中取出，放入空的蛋托中。
   3. 关闭房间内的灯光。
   4. 依次将每个鸡蛋的钝端紧贴验蛋灯。
   5. 观察鸡蛋，判断其是否受精。
      注意：应能清晰看到通向豆状胚胎的细小血管。未受精的鸡蛋则仅可见一个小血点和明显的蛋黄。
2. 丢弃未受精的鸡蛋，并将存活的鸡蛋放回孵化箱。鸡蛋在孵化箱外放置时间不得超过30分钟。若无法确认鸡蛋状态，应做好标记，稍后再次观察。

3. 病毒接种物的制备

1. 将流感病毒原液用含有10 mM HEPES（pH 7.4）的无菌PBS稀释至约10³ – 10⁴ pfu/ml。关键步骤：病毒原液需在使用前立即稀释，并始终将稀释后的病毒置于冰上。

4. 通过尿囊途径接种流感病毒

1. 在接种病毒当天（第10或11天），再次照蛋并剔除所有已死亡的胚胎。通过观察蛋内是否有活动来区分存活的胚胎。
2. 从培养箱中取出三个鸡蛋，并将其放置在独立的蛋架上，气室朝上。
3. 用永久性记号笔标记鸡蛋气室的位置。
4. 用70%乙醇清洗气室上方的蛋壳表面。
5. 将气室朝上的鸡蛋放入蛋托中，然后置于生物安全柜（BSL-2）内。
6. 使用无菌18G针头在每个鸡蛋气室上方的蛋壳上扎一个小孔。注意不要将针头插入过深，以免刺伤胚胎或卵黄。
7. 用无菌1 ml注射器吸取稀释后的流感病毒，并安装22G针头。
8. 将带针头的注射器以45°角小心插入尿囊腔。
9. 注入0.2 ml稀释后的流感病毒。
10. 对另外两个鸡蛋重复上述注射操作，然后丢弃注射器和针头。
11. 用热熔胶枪（或熔化的石蜡）滴一滴胶封闭小孔。注意避免胶液渗入蛋内。
12. 将鸡蛋重新放回孵化箱，保持气室朝上。
13. 重复步骤4.2–4.12，直至所有鸡蛋均完成接种。

5. 孵育时间

1. 将感染的鸡蛋在37 °C、约60%湿度条件下孵育，期间不进行翻动。
2. 根据流感病毒类型选择最佳孵育时间：甲型流感病毒孵育48小时；乙型和丙型流感病毒孵育72小时。

6. 流感病毒收获

1. 孵育结束后，将鸡蛋置于 4 °C 冷却至少 4 小时（或过夜），以杀死胚胎并收缩血管，从而降低血液污染感染性尿囊液的风险。此步骤可防止红细胞吸附病毒，避免降低病毒产量。也可将鸡蛋在 -20 °C 冷冻 30 分钟，但此方法会增加血液污染的风险。
2. 待鸡蛋充分冷却后，将其转移至生物安全柜中。将鸡蛋放入固定架，使气室朝上。用 70% 乙醇擦拭蛋壳表面进行消毒。
3. 使用无菌剪刀在气室上方剪开蛋壳。小心去除气室周围的蛋壳，注意不要破坏绒毛尿囊膜。
4. 用无菌钝头镊子轻轻撕开绒毛尿囊膜。用小刮勺或小勺轻轻移开胚胎和卵黄囊，注意避免刺破卵黄。
5. 使用 1 ml Eppendorf 移液器小心吸取尿囊液。必要时可将鸡蛋稍倾斜，以尽可能收集更多液体。
6. 将所有鸡蛋的尿囊液合并至一个 50 ml 塑料锥形管中。病毒收获过程中，始终将管子置于冰上。每枚鸡蛋可收获 5–10 ml 淡黄色液体。
7. 将含有病毒的尿囊液在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 10 分钟，以沉淀杂质。将上清液转移至另一个预冷的 50 ml 管中，并始终保持在冰上。将废弃鸡蛋放入 BSL-2 级生物废物容器中处理。

7. 储存

1. 立即分装澄清的尿囊液（例如， 50、100 或 500 μl 分装后，于液氮中速冻。将冻存的病毒原液转移至 -80 °C 冰箱中长期保存。

结果

已开发出多种方法用于测定流感病毒滴度。选择合适方法时需考虑的一个因素是，某些方法测定的是病毒总颗粒数，而不论其是否具有活性（例如，血凝素测定法），而另一些方法则基于感染性，用于评估具有活性的病毒颗粒（例如，蚀斑测定法）⁶。本实验中，通过蚀斑测定法（图1）和血凝试验（图2）测定了接种小鼠适应性流感病毒（A/PR/8/34）后收集的鸡胚尿囊液中的病毒滴度。

流感病毒感染会在细胞单层上引起细胞病变效应，导致形成空斑（细胞裂解的圆形区域）。通过结晶紫染色可视化空斑，在病毒10^-12 稀释度的孔中计数到65个空斑（图1）。由于在细胞上接种了500 µL稀释后的病毒原液，最终滴度为1.3 × 10¹⁴ PFU/mL。

血凝试验是一种基于流感病毒与红细胞表面结合能力来滴定病毒的方法。病毒悬液会使红细胞发生凝集，从而阻止红细胞从悬液中沉降下来...

讨论

流感在全球范围内造成了巨大的疾病负担，目前仍在持续开展关于肺损伤发病机制的研究⁷。为了促进对这种致命疾病的研究，已开发出多种方法用于扩增流感病毒⁶。本文介绍一种在鸡胚中制备流感病毒的技术。该方法的优势在于具有高度可重复性，并能产生大量高滴度的流感病毒储备液，这通常是体外（in vitro）研究所需的。

大多数实验室均可以较低的启动成本快速、简便地建立本实验方案。尽管我们建议投资购买带有自动翻蛋功能的孵卵器，但本方案也可在无此类设备的情况下完成，只是操作会更加繁琐。我们还建议通过商业性科研供应商购买受精卵，以确保卵的均一性和无菌性。根据美国卫生与公共服务部（PHS）《实验动物人道照护与使用政策》中实验室动物福利办公室（OLAW）的解释，对于活体禽类胚胎卵的研究使用，PHS 政策仅在孵化后适用。因此，大多数机构不要求本方案获得实验动物管理与使用委员会（IACUC）的批准。然而，不同机构的政策存在差异，在启动本方案前必须获得机构生物安全委员会的批准。

处理病毒时，从感染的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS）	Cellgro	21-040-CV
无特定病原体（SPF）受精鸡胚	VALO BioMedia
加湿型孵蛋器	FARM iNNOVATORS	Model 2100
自动翻蛋器	FARM iNNOVATORS	Model 3200
照蛋仪	FARM iNNOVATORS	Model 3300
1 ml 注射器	BD Bioscience	309659
18G 针头	BD Bioscience	305196
20G / 22G 针头	BD Bioscience	305176 / 305156
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
乙醇>99.5%	Sigma-Aldrich	459844	用水稀释至 70%
热熔胶枪 "Ad tech Hi Temp Project Pro"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	Model 1105
胶棒 "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	220-34ZIP30
MDCK 细胞	ATCC	CRL-2935
洗涤混合火鸡红细胞，10%	Lampire Biological Laboratories	724908