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方法文章

使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测干血斑中的免疫抑制剂他克莫司

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DOI：

10.3791/52424

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2015年11月8日

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1iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, 2Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, 4Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

本文内容

摘要

本文介绍了一种高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测方法，用于定量干燥血斑中的免疫抑制剂他克莫司，该方法采用简单的手工蛋白质沉淀步骤及在线柱提取技术。

摘要

钙调磷酸酶抑制剂他克莫司是美国实体器官移植后大多数免疫抑制治疗方案的核心药物。他克莫司属于治疗窗狭窄的药物，因此需要根据其全血谷浓度进行治疗药物监测和剂量调整。为了便于在家庭环境中进行治疗药物监测和依从性评估，干血斑采集是一种具有吸引力的方法。患者可在家中通过指尖采血，将一滴血液滴在滤纸上。血液干燥后，将滤纸邮寄至分析实验室，通过高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）对他克莫司进行定量分析，结合简单的手工蛋白沉淀步骤及在线柱萃取技术完成检测。

进行他克莫司分析时，从血斑的饱和中心区域打取一个6 mm的圆片。使用弹道式匀浆器对血斑进行匀浆，然后加入含内标物D2,13C-他克莫司的甲醇/0.2 M ZnSO4沉淀蛋白质。涡旋混匀后离心，取100 µl上清液注入在线萃取柱，并以0.1%甲酸/乙腈（7:3, v:v）以5 ml/min流速冲洗1分钟。随后启动切换阀，将分析物反向冲洗至分析柱（并采用0.1%甲酸/乙腈梯度进行分离）。他克莫司采用串联质谱仪在正离子多反应监测模式（MRM）下进行定量。

该检测在1至50 ng/ml范围内呈线性。经过20天评估，批间变异率（3.6%–6.1%）和准确度（91.7%–101.6%）均符合接受标准。平均提取回收率为95.5%。无显著的残留效应、基质干扰或基质效应。他克莫司在室温及+4 °C条件下，于干血斑中可稳定保存1周。提取后的样品在自动进样器中于+4 °C条件下至少可稳定72小时。

引言

他克莫司是一种强效的免疫抑制剂1-7 具有大环内酯结构8 (图1）。由于 顺式-转 其形成的C-N键具有异构化特性，因此在溶液中生成两种旋转异构体9 可通过反相高效液相色谱法（HPLC）分离。他克莫司具有脂溶性，可溶于醇类（甲醇：653 g/L，乙醇：355 g/L）、卤代烃（氯仿：573 g/L）和醚类。在脂肪烃（己烷：0.1 g/L）和水（pH 3：0.0047 g/L）中微溶。9该分子不含任何发色团，其紫外吸收最大值为192 nm。他克莫司的作用机制是 通过 抑制钙调磷酸酶。其作用机制已在参考文献中综述10,11目前在美国超过80%的实体器官移植患者中使用12.

他克莫司的治疗指数被认为较窄13。此外，他克莫司剂量与血药浓度之间的相关性较差，且药代动力学存在个体差异14,15。因此，在移植患者中通过治疗药物监测来指导他克莫司的给药已成为常规临床实践16-20。其目标是将他克莫司的血药浓度维持在预先设定的治疗范围内。血药浓度低于治疗范围可能导致急性和慢性同种异体免疫反应活性增强，而高于治疗窗的浓度则会增加过度免疫抑制、癌症以及毒性反应（如肾毒性、神经毒性、高血压和糖尿病）的风险。他克莫司药代动力学在个体内高度变异，可能对移植器官及患者的存活均产生不利影响21,22。尽管他克莫司药代动力学的个体间差异主要由CYP3A5多态性引起，但个体内变异的原因包括但不限于药物-药物、疾病-药物以及食物-药物相互作用14,15。此外，未能依从免疫抑制治疗方案也是导致个体内变异的重要因素，并且是移植物丢失的主要原因之一23,24。

这些考虑表明，频繁在家进行他克莫司全血浓度的治疗药物监测和依从性监测可能有助于确保患者始终处于理想的治疗窗内。然而，按照当前临床实践15进行更频繁的治疗药物监测在操作流程和成本上均难以实现。其中一个原因是患者必须前往采血人员处采集所需的静脉血样本。近年来，干血斑（dried blood spots）作为一种有吸引力的方法逐渐兴起25-28。患者仅需进行简单的指尖采血，将一滴血液滴在专用的滤纸卡上，待血斑干燥后，即可将其邮寄至中心实验室，用于检测他克莫司以及患者当前可能服用的其他免疫抑制剂。这一方法得以实现，得益于高灵敏度和高特异性的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测技术的发展，该技术可在极小体积的血液样本（如干血斑，通常仅需20 µl血液）中准确定量他克莫司及其他免疫抑制剂25,29-43。另一优势在于，诸如干血斑这类微创、低血量的采样策略，极大地方便了对婴幼儿进行治疗药物监测和药代动力学研究28。

他克莫司通常在静脉 EDTA 全血中进行检测15。原因在于他克莫司广泛分布于血细胞中，且临床研究报道，与血浆相比，全血中的他克莫司谷浓度与临床事件的相关性更佳15,18。相比之下，干血斑中他克莫司的分析基于与滤纸基质混合的毛细血管全血，这在药物溶解及可能对 LC-MS/MS 分析造成干扰方面带来了挑战。本文介绍一种已建立并经过验证的检测方法，该方法采用弹珠式匀浆器对干血斑进行均质化处理，结合高流速在线色谱柱样品净化程序，并通过 LC-MS/MS 进行分析。截至目前，该方法已成功用于临床试验中五千多个干血斑样本的他克莫司定量，以监测患者用药依从性。

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方案

来自健康个体的去标识化血液样本取自科罗拉多大学医院（科罗拉多州奥罗拉市）。科罗拉多多机构审查委员会（COMIRB，科罗拉多州奥罗拉市）认为，使用去标识化的血库样本进行验证研究以及校准品和质控样品的制备属于“豁免”范畴。

1. 参照物与溶液的制备

  1. 购买他克莫司和内标D2,13从材料列表中列出的供应商处获取C-tacrolimus。
    1. 在纯甲醇中配制他克莫司浓度为 1 mg/ml、D 浓度为 10 µg/ml 的储备液2,13C-他克莫司。根据三次独立称重配制标准品储备液。分装储备液，于-70 °C或更低温度保存。
  2. 使用甲醇 / 0.2 M ZnSO₄ 溶液沉淀蛋白质并提取他克莫司4 在水中的比例为7:3（v:v）。该溶液还含有内标物D2,13C-他克莫司浓度为2.5 ng/ml，用于除空白样品外所有样品的提取（详见1.3.3）。
    1. 每次提取当天新鲜配制该蛋白质沉淀溶液，并将溶液的有效期设定为12小时。
  3. 标准曲线和质量控制（QC）样品的制备
    1. 使用纯甲醇对储备液进行适当稀释，配制他克莫司的储备溶液。
    2. 为制备校准品和质控样品，将20 µl适当稀释的储备液加入EDTA全血中，在37 °C水浴中轻轻振荡孵育20分钟，使他克莫司均匀分布于血细胞成分中，随后分装至1.5 ml带锥形底和压盖的聚丙烯管中。确保有机溶剂的相对体积不超过5%。
    3. 使用移液器将50 µl加标全血滴加到滤纸片每个圆圈的中央。
    4. 将滤纸上的血斑在室温下干燥3小时。
    5. 在人EDTA全血中配制他克莫司校准品，他克莫司浓度分别为1、2.5、5、10、25和50 ng/ml。使用含内标物D的蛋白沉淀液，以与校准品相同的方式制备空白样品用于提取2,13C-他克莫司（“零样本”）
    6. 在人EDTA全血中配制浓度为0、2、4、20、40 ng/ml的质控样品，并制备一个空白样品。与含有内标D的沉淀提取质控样品不同2,13C-他克莫司，使用不含内标物D的蛋白沉淀溶液提取该空白样品2,13C-他克莫司（“空白样品”）。
  4. 临床样本的采集
    1. 按照所述方法采集干血斑43,44.

2. 他克莫司干血斑样本的提取

  1. 目视检查干血斑，以确保样本质量和体积符合要求45。
  2. 使用6 mm打孔器在滤纸卡上打取血斑中心部位。
    注意：可通过称重监测打孔质量。一个饱和浸润的滤纸圆片平均重量为5.02 mg ± 0.09 mg（范围：4.83–5.14 mg，n=12）。
  3. 将滤纸圆片放入带有锥形底部和压盖的1.5 ml聚丙烯管中。
  4. 向每根试管中加入20–30颗研磨珠。
  5. 向每根试管中加入500 µl蛋白沉淀溶液（甲醇: 0.2 M ZnSO4，7:3，v:v，含2.5 ng/ml内标）。提取空白样品时，使用不含内标的蛋白沉淀溶液。
  6. 在研磨仪中以最大速度（设定为“10”）均质化1分钟。
  7. 在室温下，将样品置于多管涡旋振荡器上以最大速度（设定为“10”）振荡10分钟。
  8. 在16,000 × g、4 °C条件下离心10分钟。
  9. 将上清液转移至配有300 µl内插管的玻璃HPLC小瓶中。使用预切口聚四氟乙烯（Teflon）密封垫。
    注意：提取后的样品可在-20 °C或更低温度下保存，直至进行LC-MS/MS分析。

3. 液相色谱-串联质谱分析

  1. 将100 µl提取样品的上清液加载至C8固相萃取柱，以水:乙腈（含0.1%甲酸）按7:3比例配制的溶液为洗涤液，在5 ml/min流速下冲洗1分钟。切换阀的连接方式如图所示 图2 提取泵运行的梯度 表1.
  2. 此后，启动切换阀，使分析物从预柱反向冲洗至分析柱。
  3. 将色谱柱温箱设置为 65 °C。
  4. 使用分析柱的洗脱流速和梯度进行分析物洗脱，具体参数如图所示 表1.
  5. 将分析柱连接至串联质谱仪 通过 涡轮电喷雾离子源。根据以下要求调节质谱仪的关键参数： 表2.
  6. 检测阳离子（[M+Na]）+) 在多反应监测模式（MRM）中进行。采用以下离子跃迁进行定量：他克莫司：m/z（质荷比）= 826.6 → 616.2 和 D2,13C-他克莫司：m/z = 829.6 → 619.2。
    注意：总运行时间为 4.6 min。

4. 定量分析

  1. 每次运行时，根据1.3.5步骤中制备的校准品生成校准曲线，并将其纳入每次分析运行中。
    1. 通过绘制标称浓度生成校准曲线 与 分析物的响应因子（分析物峰面积 / 内标峰面积），使用质谱仪软件计算。
    2. 使用二次拟合结合1/X加权法对校准品进行拟合。
  2. 在干燥血斑中定量他克莫司时，对提取的多反应监测（MRM）色谱图中他克莫司及其内标物的色谱峰进行积分。计算他克莫司的响应因子（分析物峰面积 / 内标物峰面积），并使用质谱软件与标准曲线进行比较。

5. 验证程序

  1. 检测下限（LLOD）与定量下限（LLOQ）。
    1. 将信噪比达到4:1的最低他克莫司浓度视为检测下限（LLOD）。将校准曲线中准确度在标称浓度±20%以内、精密度（变异系数）优于或等于20%的最低浓度定义为定量下限（LLOQ）。
  2. 日内与日间准确度和精密度。
    1. 在四个浓度水平（2 ng/ml [QC1]、4 ng/ml [QC2]、20 ng/ml [QC3] 和 40 ng/ml [QC4]）下测试准确度和精密度。
    2. 在每次验证当天，使用人EDTA全血制备质控（QC）样品，干燥于滤纸卡上，按前述方法进行提取和分析。
    3. 每个QC浓度水平使用6个样品测定日内准确度和精密度。
    4. 在20天内评估日间准确度和精密度，每天每个QC浓度水平测定4个样品。
    5. 每天与QC样品同时分析两条校准曲线。
    6. 计算每个浓度水平的6个样品的准确度（占标称浓度的百分比，请参见5.2.2）。精密度以变异系数（CV%）表示。
    7. 若日内准确度处于标称浓度的85%至115%范围内，则视为可接受；若日内精密度的变异系数（CV）优于或等于15%，则视为可接受。
    8. 日间准确度和精密度按20天验证期间各QC浓度水平的测定结果取均值计算。
    9. 若平均日间准确度处于标称浓度的85%至115%范围内，则视为可接受；若日间精密度的变异系数（CV）优于或等于15%，则视为可接受。
  3. 排除基质干扰。
    1. 为排除可能由基质信号引起的干扰，分析8个不同个体（建议4名男性和4名女性）的空白干血斑样品。
    2. 目视检查离子色谱图。若在该克莫司的保留时间窗口内检测到峰，则积分并将其峰面积与在定量下限（LLOQ）浓度下添加他克莫司的空白样品中他克莫司峰的峰面积进行比较。空白样品中检测到的峰面积不应超过LLOQ浓度下他克莫司峰面积的15%。
  4. 离子抑制/离子增强效应。
    1. 采用文献45所述的柱后灌注方法，评估共洗脱基质成分可能引起的离子抑制或离子增强干扰。
    2. 将他克莫司以10 µg/ml的浓度溶解于0.1%甲酸:甲醇（30:70, v/v）中，以10 µl/min的流速进行柱后灌注。
      1. 通过T型接头将注射泵连接在分析柱与质谱仪电喷雾离子源之间。
      2. 注入经提取的空白样品（n = 8，来自不同个体）后，监测他克莫司及其内标物的MRM离子对信号强度（m/z = 826.6 → 616.2 和 m/z = 829.6 → 619.2）。
        注：若无离子抑制或增强效应，分析物的持续信号在注入空白基质后应不受影响；若存在离子抑制，信号会出现下降；若存在离子增强，则会出现信号峰。
  5. 残留效应（carry-over）。
    1. 通过在最高浓度校准品（50 ng/ml，n = 6）之后分析经提取的空白样品，评估可能的残留效应。
    2. 目视检查离子色谱图。若在该克莫司的保留时间窗口内检测到峰，则积分并将其峰面积与在定量下限（LLOQ）浓度下添加他克莫司的空白样品中他克莫司峰的峰面积进行比较。空白样品中检测到的峰面积不应超过LLOQ浓度下他克莫司峰面积的15%。
  6. 提取回收率。
    1. 通过比较四个浓度水平的QC样品（每浓度n = 6）提取后分析物的信号强度，与提取后在空白干血斑中添加相应量他克莫司的样品信号强度，计算回收率。
    2. 制备四组QC样品（浓度水平：2、4、20、40 ng/ml）。
    3. 另制备四组相应的“回收率测试样品”：将50 µl空白EDTA全血滴加至滤纸卡上，干燥2小时。
    4. 随后，对QC样品和空白“回收率测试样品”，均用剪刀剪下滤纸卡上的整个血斑，将所得圆片放入带锥形底和压盖的聚丙烯管中。
    5. 对所有样品进行提取。
    6. 将上清液（400 µl）转移至玻璃HPLC小瓶中。
    7. 向空白“提取后回收率测试样品”的上清液中加入他克莫司储备液，使其浓度分别达到2、4、20和40 ng/ml（向400 µl上清液中分别加入4 µl浓度为200、400、2,000、4,000 ng/ml的他克莫司储备液）。
    8. 经LC-MS/MS分析后，比较相同浓度的QC样品与“回收率测试样品”的信号强度（回收率% = 提取前加标样品信号 / 提取后加标样品信号 × 100）。
  7. 稀释可靠性。
    1. 使用在500、250和100 ng/ml浓度下添加分析物的样品建立稀释可靠性。
    2. 提取后，使用蛋白沉淀溶液对样品进行1:10稀释（每浓度水平n = 3）。
    3. 计算实测浓度与标称浓度的偏差。若结果在标称浓度的85%–115%范围内，则视为可接受。
  8. 稳定性。
    1. 在四个浓度水平下使用QC样品（每浓度n = 4），在不同时间点和不同储存条件下进行稳定性考察。
    2. 将储存后的测定结果与标称值进行比较。若结果在标称值的85%–115%范围内，则视为可接受。
    3. 建立样品在室温下稳定1周、4 °C下稳定1周、-20 °C下稳定1个月、-80 °C下稳定1个月的稳定性数据。
    4. 考察在-20 °C条件下经历三个冻融循环的稳定性。通过将提取后的样品置于设定为4 °C的恒温自动进样器中，测试提取后样品及自动进样器中的稳定性，并在72小时后进样分析。

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结果

空白样本、在定量下限添加的加标样本以及患者样本的代表性离子色谱图如图3所示。

标准曲线

检测下限为 0.5 ng/ml，定量下限为 1.0 ng/ml。选择 50 ng/ml 作为最高校准点，因为在正常情况下，临床中不太可能达到更高的浓度。

在每次验证当天，均使用人EDTA全血新鲜配制校准曲线，将血液滴于滤纸片上，干燥后用甲醇/0.2 M ZnSO4 (70:30 v/v)溶液加入内标物（内标终浓度为2.5 ng/ml）进行提取。第1天的验证分析包含校准品（n = 6）和质控样本（n = 6），第2至20天的分析包含校准品（n = 2）和每个质控水平的样本（n = 4）。校准品浓度分别为1、2.5、5、10、25和50 ng/ml。典型的校准曲线如图4所示。在校准品工作范围内，至少有2/3的校准点（非零校准点不少于6个）的平均准确度达到标称值的85%至115%，即视为可接受。平均相关...

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讨论

尽管如前所述，基于干血斑进行他克莫司治疗药物监测和用药依从性监测具有吸引力，但其分析过程面临的挑战超出了通常在他克莫司静脉血EDTA全血样本的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析中所遇到的问题。这些挑战包括但不限于：基质为毛细血管全血，已渗入本研究所用滤纸材料的棉绒纤维中，且血样体积较小（20 µl）。然而，在中心实验室进行高通量分析时，仍需要一种快速且可靠的提取方法，以获得无基质干扰和基质效应的样本，并结合一种稳健、特异且高灵敏度的LC-MS/MS检测方法。该检测方法的可靠性至关重要，因为在滤纸片打孔后通常所剩材料极少，一旦提取或LC-MS/MS分析失败，往往无法进行重复分析。

本研究中使用的滤纸卡（制造商详细信息请参见材料清单）被选用是因为其为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的II类医疗器械，并符合NCCLS指南LA4-A5的要求。44 并在欧洲获得CE认证。若完全填满，Whatman 903滤纸卡上的一个圆圈可容纳 ≈50 µ全血46然而，不同患者采集的血滴体积存在差异，因此掌握正确的采样技术至关重要...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国食品药品监督管理局（FDA）合同 HHSF223201310224C 以及美国国立卫生研究院/食品药品监督管理局资助项目 1U01FD004573-01 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
他克莫司美国药典委员会1642802
D2,13C-他克莫司多伦多研究化学品公司F370002
红细胞科罗拉多大学医院W20091305500 V
血浆科罗拉多大学医院W2017130556300Q
丙酮 CHROMASOLV，HPLC，≥99.9%Sigma-Aldrich439126-4 L
乙腈 Optima LC/MS，UHPLC-UV赛默飞世尔科技A955-4
异丙醇 99.9%，HPLC菲舍尔科技BP2632-4
甲醇 Optima LC/MS赛默飞世尔科技A452-4
水 Optima LC/MS，UHPLC-UV赛默飞世尔科技W6-4
甲酸赛默飞世尔科技A118P-500
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD8537
硫酸锌赛默飞世尔科技Z68-500
0.5 – 10 µl 移液器，VoluMate LIQUISYSTEMS梅特勒-托利多17008649
1.5 ml Eppendorf 管赛默飞世尔科技02-682-550
10 – 100 µl 移液器，VoluMate LIQUISYSTEMS梅特勒-托利多17008651
10 μl 带滤芯移液器吸头，无菌NeptuneBT 10XLS3
100 – 1,000 µl 移液器，VoluMate LIQUISYSTEMS梅特勒-托利多17008653
100 μl 带滤芯移液器吸头，无菌NeptuneBT 100
1,000 μl 带滤芯移液器吸头，无菌Multimax2940
2 – 20 µl 移液器，VoluMate LIQUISYSTEMS梅特勒-托利多17008650
2 ml Eppendorf 管赛默飞世尔科技02-681-258
20 – 200 µl 移液器，VoluMate LIQUISYSTEMS梅特勒-托利多17008652
20 μl 带滤芯移液器吸头，无菌GeneMateP-1237-20
200 μl 带滤芯移液器吸头Multimax2938T
200 μl 带滤芯移液器吸头，无菌Multimax2936J
50 ml Falcon 管BD Falcon352070
300 μl HPLC 小瓶插入件PhenomenexARO-9973-13
PR2002 天平梅特勒-托利多1117050723
AX205 Delta Range 天平梅特勒-托利多1119343379
Bullet Blender 匀浆仪Next AdvanceBBX24
Centrifuge Biofuge Fresco 离心机Heraeus290395
一次性擦拭巾PDIQ55172
玻璃小瓶，4 ml赛默飞世尔科技14-955-334
玻璃小瓶，20 ml赛默飞世尔科技B7800-20
丁腈手套Titan Brand Gloves44-100S
HPLC 小瓶，9 mm，2 ml，透明PhenomenexARO- 9921-13
HPLC 小瓶瓶盖PhenomenexARO- 8952-13-B
针头，18 G 1.5Precision Glide305196
Eppendorf 管架赛默飞世尔科技03-448-11
HPLC 小瓶架赛默飞世尔科技05-541-29
钢珠 0.9 – 2 mmNext AdvanceSSB14B
冰箱/冷冻柜用储存盒赛默飞世尔科技03-395-464
标准多管涡旋混合器VWR Scientific Products658816-115
Whatman 滤纸，903 蛋白质保存纸，美国规格，100/包GE Whatman 2016-05
自动进样器CTC PAL PAL.HTCABIx1
二元泵，Agilent 1260 Infinity安捷伦科技1260 G1312B
二元泵，Agilent 1290 Infinity安捷伦科技1290 G4220A
Agilent 1260 微型真空脱气装置安捷伦科技1260 G13798
柱温箱，  Agilent 1290，带两位切换阀 安捷伦科技1290 G1216C
带集成六通切换阀的恒温柱温箱安捷伦科技1290 G1316C
HPLC 保护柱柱芯，Zorbax XDB C8（5 µm 粒径），4.6 · 12.5 mmPhenomenex820950-926
HPLC 分析柱，Zorbax Eclipse-XDB-C8（5 µm 粒径），4.6 · 150 mmPhenomenex993967-906
串联质谱仪
API5000 MS/MS 配 TurboIonspray 离子源AB Sciex4364257
质谱分析软件AB SciexAnalyst 1.5.1

参考文献

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使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测干血斑中的免疫抑制剂他克莫司
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