本文介绍了一种高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测方法，用于定量干燥血斑中的免疫抑制剂他克莫司，该方法采用简单的手工蛋白质沉淀步骤及在线柱提取技术。
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摘要
摘要
钙调磷酸酶抑制剂他克莫司是美国实体器官移植后大多数免疫抑制治疗方案的核心药物。他克莫司属于治疗窗狭窄的药物，因此需要根据其全血谷浓度进行治疗药物监测和剂量调整。为了便于在家庭环境中进行治疗药物监测和依从性评估，干血斑采集是一种具有吸引力的方法。患者可在家中通过指尖采血，将一滴血液滴在滤纸上。血液干燥后，将滤纸邮寄至分析实验室，通过高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）对他克莫司进行定量分析，结合简单的手工蛋白沉淀步骤及在线柱萃取技术完成检测。
进行他克莫司分析时，从血斑的饱和中心区域打取一个6 mm的圆片。使用弹道式匀浆器对血斑进行匀浆，然后加入含内标物D2,13C-他克莫司的甲醇/0.2 M ZnSO4沉淀蛋白质。涡旋混匀后离心，取100 µl上清液注入在线萃取柱，并以0.1%甲酸/乙腈（7:3, v:v）以5 ml/min流速冲洗1分钟。随后启动切换阀，将分析物反向冲洗至分析柱（并采用0.1%甲酸/乙腈梯度进行分离）。他克莫司采用串联质谱仪在正离子多反应监测模式（MRM）下进行定量。
该检测在1至50 ng/ml范围内呈线性。经过20天评估，批间变异率（3.6%–6.1%）和准确度（91.7%–101.6%）均符合接受标准。平均提取回收率为95.5%。无显著的残留效应、基质干扰或基质效应。他克莫司在室温及+4 °C条件下，于干血斑中可稳定保存1周。提取后的样品在自动进样器中于+4 °C条件下至少可稳定72小时。
引言
他克莫司是一种强效的免疫抑制剂1-7 具有大环内酯结构8 (图1）。由于 顺式-转 其形成的C-N键具有异构化特性，因此在溶液中生成两种旋转异构体9 可通过反相高效液相色谱法（HPLC）分离。他克莫司具有脂溶性，可溶于醇类（甲醇：653 g/L，乙醇：355 g/L）、卤代烃（氯仿：573 g/L）和醚类。在脂肪烃（己烷：0.1 g/L）和水（pH 3：0.0047 g/L）中微溶。9该分子不含任何发色团，其紫外吸收最大值为192 nm。他克莫司的作用机制是 通过 抑制钙调磷酸酶。其作用机制已在参考文献中综述10,11目前在美国超过80%的实体器官移植患者中使用12.
他克莫司的治疗指数被认为较窄13。此外，他克莫司剂量与血药浓度之间的相关性较差，且药代动力学存在个体差异14,15。因此，在移植患者中通过治疗药物监测来指导他克莫司的给药已成为常规临床实践16-20。其目标是将他克莫司的血药浓度维持在预先设定的治疗范围内。血药浓度低于治疗范围可能导致急性和慢性同种异体免疫反应活性增强，而高于治疗窗的浓度则会增加过度免疫抑制、癌症以及毒性反应（如肾毒性、神经毒性、高血压和糖尿病）的风险。他克莫司药代....
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方案
来自健康个体的去标识化血液样本取自科罗拉多大学医院（科罗拉多州奥罗拉市）。科罗拉多多机构审查委员会（COMIRB，科罗拉多州奥罗拉市）认为，使用去标识化的血库样本进行验证研究以及校准品和质控样品的制备属于“豁免”范畴。
1. 参照物与溶液的制备
- 购买他克莫司和内标D2,13从材料列表中列出的供应商处获取C-tacrolimus。
- 在纯甲醇中配制他克莫司浓度为 1 mg/ml、D 浓度为 10 µg/ml 的储备液2,13C-他克莫司。根据三次独立称重配制标准品储备液。分装储备液，于-70 °C或更低温度保存。
- 使用甲醇 / 0.2 M ZnSO₄ 溶液沉淀蛋白质并提取他克莫司4 在水中的比例为7:3（v:v）。该溶液还含有内标物D2,13C-他克莫司浓度为2.5 ng/ml，用于除空白样品外所有样品的提取（详见1.3.3）。
- 每次提取当天新鲜配制该蛋白质沉淀溶液，并将溶液的有效期设定为12小时。
- 标准曲线和质量控制（QC）样品的制备
- 使用纯甲醇对储备液进行适当稀释，配制他克莫司的储备溶液。
- 为制备校准品和质控样品，....
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结果
空白样本、在定量下限添加的加标样本以及患者样本的代表性离子色谱图如图3所示。
标准曲线
检测下限为 0.5 ng/ml，定量下限为 1.0 ng/ml。选择 50 ng/ml 作为最高校准点，因为在正常情况下，临床中不太可能达到更高的浓度。
在每次验证当天，均使用人EDTA全血新鲜配制校准曲线，将血液滴于滤纸片上，干燥后用甲醇/0.2 M ZnSO4 (70:30 v/v)溶液加入内标物（内标终浓度为2.5 ng/ml）进行提取。第1天的验证分析包含校准品（n = 6）和质控样本（n = 6），第2至20天的分析包含校准品（n = 2）和每个质控水平的样本（n = 4）。校准品浓度分别为1、2.5、5、10、25和50 ng/ml。典型的校准曲线如图4所示。在校准品工作范围内，至少有2/3的校准点（非零校准点不少于6个）的平均准确度达到标称值的85%至115%，即视为可接受。平均相关.......
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讨论
尽管如前所述，基于干血斑进行他克莫司治疗药物监测和用药依从性监测具有吸引力，但其分析过程面临的挑战超出了通常在他克莫司静脉血EDTA全血样本的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析中所遇到的问题。这些挑战包括但不限于：基质为毛细血管全血，已渗入本研究所用滤纸材料的棉绒纤维中，且血样体积较小（20 µl）。然而，在中心实验室进行高通量分析时，仍需要一种快速且可靠的提取方法，以获得无基质干扰和基质效应的样本，并结合一种稳健、特异且高灵敏度的LC-MS/MS检测方法。该检测方法的可靠性至关重要，因为在滤纸片打孔后通常所剩材料极少，一旦提取或LC-MS/MS分析失败，往往无法进行重复分析。
本研究中使用的滤纸卡（制造商详细信息请参见材料清单）被选用是因为其为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的II类医疗器械，并符合NCCLS指南LA4-A5的要求。44 并在欧洲获得CE认证。若完全填满，Whatman 903滤纸卡上的一个圆圈可容纳 ≈50 µ全血46然而，不同患者采集的血滴体积存在差异，因此掌握正确的采样技术至关重要.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国食品药品监督管理局（FDA）合同 HHSF223201310224C 以及美国国立卫生研究院/食品药品监督管理局资助项目 1U01FD004573-01 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 他克莫司 | 美国药典委员会 | 1642802 | |
| D2,13C-他克莫司 | 多伦多研究化学品公司 | F370002 | |
| 红细胞 | 科罗拉多大学医院 | W20091305500 V | |
| 血浆 | 科罗拉多大学医院 | W2017130556300Q | |
| 丙酮 CHROMASOLV，HPLC，≥99.9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| 乙腈 Optima LC/MS，UHPLC-UV | 赛默飞世尔科技 | A955-4 | |
| 异丙醇 99.9%，HPLC | 菲舍尔科技 | BP2632-4 | |
| 甲醇 Optima LC/MS | 赛默飞世尔科技 | A452-4 | |
| 水 Optima LC/MS，UHPLC-UV | 赛默飞世尔科技 | W6-4 | |
| 甲酸 | 赛默飞世尔科技 | A118P-500 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 硫酸锌 | 赛默飞世尔科技 | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 µl 移液器，VoluMate LIQUISYSTEMS | 梅特勒-托利多 | 17008649 | |
| 1.5 ml Eppendorf 管 | 赛默飞世尔科技 | 02-682-550 | |
| 10 – 100 µl 移液器，VoluMate LIQUISYSTEMS | 梅特勒-托利多 | 17008651 | |
| 10 μl 带滤芯移液器吸头，无菌 | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 µl 移液器，VoluMate LIQUISYSTEMS | 梅特勒-托利多 | 17008653 | |
| 100 μl 带滤芯移液器吸头，无菌 | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μl 带滤芯移液器吸头，无菌 | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 µl 移液器，VoluMate LIQUISYSTEMS | 梅特勒-托利多 | 17008650 | |
| 2 ml Eppendorf 管 | 赛默飞世尔科技 | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µl 移液器，VoluMate LIQUISYSTEMS | 梅特勒-托利多 | 17008652 | |
| 20 μl 带滤芯移液器吸头，无菌 | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μl 带滤芯移液器吸头 | Multimax | 2938T | |
| 200 μl 带滤芯移液器吸头，无菌 | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Falcon 管 | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μl HPLC 小瓶插入件 | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| PR2002 天平 | 梅特勒-托利多 | 1117050723 | |
| AX205 Delta Range 天平 | 梅特勒-托利多 | 1119343379 | |
| Bullet Blender 匀浆仪 | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge Biofuge Fresco 离心机 | Heraeus | 290395 | |
| 一次性擦拭巾 | PDI | Q55172 | |
| 玻璃小瓶，4 ml | 赛默飞世尔科技 | 14-955-334 | |
| 玻璃小瓶，20 ml | 赛默飞世尔科技 | B7800-20 | |
| 丁腈手套 | Titan Brand Gloves | 44-100S | |
| HPLC 小瓶，9 mm，2 ml，透明 | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| HPLC 小瓶瓶盖 | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| 针头，18 G 1.5 | Precision Glide | 305196 | |
| Eppendorf 管架 | 赛默飞世尔科技 | 03-448-11 | |
| HPLC 小瓶架 | 赛默飞世尔科技 | 05-541-29 | |
| 钢珠 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B | |
| 冰箱/冷冻柜用储存盒 | 赛默飞世尔科技 | 03-395-464 | |
| 标准多管涡旋混合器 | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| Whatman 滤纸，903 蛋白质保存纸，美国规格，100/包 | GE Whatman | 2016-05 | |
| 自动进样器 | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 | |
| 二元泵，Agilent 1260 Infinity | 安捷伦科技 | 1260 G1312B | |
| 二元泵，Agilent 1290 Infinity | 安捷伦科技 | 1290 G4220A | |
| Agilent 1260 微型真空脱气装置 | 安捷伦科技 | 1260 G13798 | |
| 柱温箱， Agilent 1290，带两位切换阀 | 安捷伦科技 | 1290 G1216C | |
| 带集成六通切换阀的恒温柱温箱 | 安捷伦科技 | 1290 G1316C | |
| HPLC 保护柱柱芯，Zorbax XDB C8（5 µm 粒径），4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 | |
| HPLC 分析柱，Zorbax Eclipse-XDB-C8（5 µm 粒径），4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 | |
| 串联质谱仪 | |||
| API5000 MS/MS 配 TurboIonspray 离子源 | AB Sciex | 4364257 | |
| 质谱分析软件 | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
参考文献
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S.
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