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方法文章

生理学实验演示：大鼠肾小球滤过率

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DOI：

10.3791/52425

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2015年7月26日

 ,  , 
1Tactical Combat Casualty Care Research, U.S. Army Institute of Surgical Research, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University, 3Southwest National Primate Research Center, Texas Biomedical Research Institute

本文内容

摘要

本实验方案的目的是演示在大鼠中测量和计算肾小球滤过率、尿流速以及钠和钾排泄的基本原理与技术。该演示可用于帮助学生全面理解如何测量肾功能。

摘要

肾小球滤过率（GFR）以及钠（Na）和钾（K）排泄分数的测定对于评估健康和疾病状态下的肾功能至关重要。GFR 通常通过测定菊粉的肾脏清除率来获得，该值代表菊粉在肾小球被滤过但不在肾小管分泌或重吸收时的稳态清除率。钠和钾的排泄分数可通过血浆和尿液中钠和钾的浓度计算得出。菊粉清除率可在麻醉动物中进行测定，该动物股动脉、股静脉及膀胱已置入导管。本操作所用设备与试剂在科研核心设施中普遍可得，因此该方法是一种实用的肾功能评估手段。本视频旨在演示在实验教学中评估利尿药物使用前后肾功能所需的操作步骤。该技术可用于评估肾病大鼠模型中的肾功能。

引言

肾脏最重要的功能是维持细胞外水和电解质含量的稳态调节。肾脏通过精密调控细胞外液中的水、钠（Na）和钾（K），以维持正常的生理水平。肾功能紊乱可导致严重的代谢障碍，甚至危及生命。肾脏的基本功能单位是肾单位，其基本过程始于肾小球对血浆的滤过，最终以尿液的排泄结束。决定尿液中水、Na 和 K 最终浓度的其他过程还包括肾单位内的分泌和重吸收。肾小球滤过率（GFR）以及钠和钾的排泄分数测定，对于评估健康和疾病状态下的肾功能至关重要。关于肾脏功能的更深入讨论，读者可参考已发表的综述文章和教科书1-4。

肾小球滤过率（GFR）可通过测定菊粉的稳态肾脏清除率来评估，菊粉在肾小球被滤过，但在肾小管中既不被分泌也不被重吸收5。尽管该技术需要麻醉、手术准备以及终末性实验操作，但仍被视为GFR测定的金标准。使用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的菊粉后，可在实验的多个时间点通过测定少量血浆和尿液中FITC-菊粉的浓度来计算GFR。钠（Na）和钾（K）的排泄分数可通过血浆和尿液中Na与K的浓度来确定。

通过一个简短的实验课程，可以轻松地向学生展示如何测量肾功能的概念性理解，该课程设计旨在让学生积极参与实验的某些环节。本视频展示了实验前的准备、肾功能测定的演示过程，以及实验后对结果的评估。视频中演示了在麻醉大鼠上进行肾小球滤过率（GFR）测量所需的手术技术。此外，还展示了在给予利尿药物前后，肾小球滤过率以及钠（Na）和钾（K）排泄分数的示例计算方法。

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方案

在开展任何动物实验之前，必须获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）对实验方案的批准。本方案已获得密歇根州立大学 IACUC 的批准。

1. FITC-菊粉溶液的实验前制备

  1. 将 20 ml 生理盐水加热至 70 °C，缓慢搅拌加入 100 mg FITC-菊粉（终浓度为 5 mg/ml FITC-菊粉），直至菊粉完全溶解。
  2. 将溶液冷却至室温 ，加入 800 mg 牛血清白蛋白（终浓度为 40 mg/ml BSA，冻干粉末，基本无球蛋白，低内毒素，经琼脂糖凝胶电泳检测纯度≥98%）。
  3. 使用滤纸（1 号级）过滤菊粉-BSA 溶液。将滤后的溶液装入 20 ml 注射器中，并连接针头滤器（0.2 µm），用铝箔包裹以避光。

2. 麻醉与手术

  1. 将大鼠放入充满5%异氟烷的诱导室中以诱导麻醉。记录体重（250–350 g），并将大鼠置于加热的手术平台上，该平台用于在整个实验过程中维持37 °C的体温。用实验室胶带轻轻固定大鼠的四肢，将其固定在平台上。 以0.8–1.0 L/min的气流速度，使用1–2%异氟烷与医用级100% O2 维持麻醉。
  2. 将一根锥形导管（血管尖端外径，2.7F） 插入股动脉，用于血压和心率监测以及采血。
  3. 将一根导管（PE-50）插入股静脉，用于菊粉输注。使用5-0编织丝线外科缝合线将导管固定于周围组织6。
  4. 将动脉导管连接至应变仪压力换能器。使用数据采集软件记录血压和心率，并实时显示在计算机屏幕上。该技术在视频中已有详细演示6。
  5. 通过耻骨上切口暴露膀胱。在膀胱顶端剪一个小孔，插入带有热扩口端的套管（PE-190）至膀胱内，用于尿液收集。使用荷包缝合线将套管固定于膀胱。

3. 尿液和血液采集

  1. 将含FITC-菊粉的注射器置于注射泵中，设置流速为每100 g体重1 ml/hr（对于体重300 g的大鼠，流速为3 ml/hr）。将注射器连接至股静脉导管。开始菊粉输注，并给予1–2小时的平衡期。用铝箔包裹注射器以避光。
  2. 通过在预称重的收集瓶中收集10分钟尿液样本，判断尿流速是否稳定且足以用于样本分析（20 µl/min）。使用电子天平通过重量法测定尿液体积。10分钟收集期内足够的尿液体积为0.2 ml。持续收集尿液样本，直至连续两次收集结果显示尿流速达到20 µl/min或更高。
  3. 给药前样本
    1. 在20分钟时间段内收集一份尿液样本。在尿液收集期间的中点，从动脉导管采集一份血液样本（0.5 ml）。在采集血液样本前，务必彻底清除动脉导管中的生理盐水，并将血液收集至含有1 U肝素的收集管中。使用带体积刻度的收集管，以便准确采集0.5 ml 动脉血。
    2. 用肝素化生理盐水（20 U/ml）冲洗动脉导管，以清除管内残留血液（约0.1 ml）。动脉导管长度应尽可能短，以减少冲洗所需肝素化生理盐水的体积。
      注意：血液样本被稀释会导致肾小球滤过率（GFR）以及钠和钾排泄分数的计算结果不准确。
    3. 等待10分钟后，重复采集第二份给药前的尿液和血液样本。
  4. 在完成两份给药前样本采集后，通过动脉导管给予利尿药物呋塞米（10 mg/kg）。使用肝素化生理盐水冲洗动脉导管，以清除管内药物残留。注意避免通过动脉导管注入空气。记录呋塞米注射的时间。
  5. 给药后样本：在以下三个时间点，分别进行10分钟尿液收集，并在尿液收集期间的中点采集一份血液样本（0.5 ml）。
    1. 给药后样本1：呋塞米注射后5分钟采集。
    2. 给药后样本2：呋塞米注射后10分钟采集。
    3. 给药后样本3：呋塞米注射后15分钟采集。
  6. 所有样本采集完成后，按照机构规程实施安乐死，方法为开胸并摘除心脏。取出双侧肾脏。剥离包膜（去除周围膜组织），用滤纸轻压吸除多余血液，称量肾脏重量。

4. 样品分析

  1. 使用电子天平通过重量法测量所有尿液样本的体积，并记录重量。
  2. 使用台式离心机（1,800 × g）离心全血样本，以分离血浆。将血浆样本转移至已标记的小瓶中。
  3. 使用钠/钾分析仪检测尿液和血浆样本中的钠（Na）和钾（K）浓度。
  4. 血浆和尿液中FITC-菊粉的测定
    1. 用HEPES缓冲液（500 mM，pH 7.4）将给药前尿液（稀释1:200至1:400）和给药后尿液（稀释1:10）进行稀释。
    2. 在96孔板中每孔加入40 µl标准品或样本以及60 µl HEPES缓冲液（每样本一孔），加盖铝箔后混匀并孵育10分钟。
    3. 建立FITC-菊粉的标准曲线，标准品浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200、400 µg/ml （图1）。使用酶标仪检测样本和标准品的荧光强度，激发波长和发射波长分别为485 nm和538 nm。
    4. 将标准品的荧光值拟合为四参数逻辑函数回归分析。利用回归函数参数计算血浆和尿液样本中FITC-菊粉的浓度（表1）。

5. 实验后结果分析：计算

  1. 计算尿流速（UV；ml/min）：[收集的尿液体积（ml）] ÷ [收集时间（min）]
  2. 计算肾小球滤过率（GFR；ml/min）：[尿液中菊粉浓度（µg/ml） × UV（ml/min）] ÷ [血浆中菊粉浓度（µg/ml）]
  3. 计算滤过钠负荷（µmol/min）：血浆钠浓度（µmol/ml） × GFR（ml/min）
  4. 计算钠排泄率（UNaV；µmol/min）：尿钠浓度（µmol/ml） × UV（ml/min）
  5. 计算钠排泄分数（FE Na；%）：[UNaV（µmol/min）] ÷ [滤过钠负荷（µmol/min）] × 100
  6. 计算滤过钾负荷（µmol/min）：血浆钾浓度（µmol/ml） × GFR（ml/min）
  7. 计算钾排泄率（UKV；µmol/min）：尿钾浓度（µmol/ml） × UV（ml/min）
  8. 计算钾排泄分数（FE K；%）：[UKV（µmol/min）] ÷ [滤过钾负荷（µmol/min）] × 100

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结果

实验演示中使用的利尿剂是呋塞米，它能迅速抑制肾脏对钠和钾的重吸收，导致给药后数分钟内钠、钾和水的排泄量增加。根据其主要作用机制，呋塞米对肾小球滤过率（GFR）以及钠和钾的滤过负荷影响较小，但会增加尿流速以及钠和钾的排泄分数。

表3中的代表性结果表明，在麻醉大鼠中，给药前肾小球滤过率（GFR）的平均值为3.2 ml/min，钠排泄量为0.58 µmol/min（占滤过负荷的0.1%），钾排泄量为4.4 µmol/min（占滤过负荷的27%）。呋塞米给药后5分钟（给药后1），GFR以及钠和钾的滤过负荷均未受到影响。然而，钠的排泄分数增加至11.5%，钾的排泄分数增加至各自滤过负荷的63%。平均动脉压（MAP）和心率（HR）的测量结果显示，呋塞米对MAP和HR的影响极小（表2）。

在实验演示中评估的肾功能指标包括肾小球滤过率（GFR），定义为肾脏过滤血浆的速率；滤过的钠（Na）和钾（K），定义为肾脏过滤钠和钾的速率；钠和钾的排泄率，定义为肾脏排泄钠和钾的速率；以及钠...

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讨论

用于测量肾小球滤过率（GFR）的合适标记物必须满足四个条件：在肾小球处自由滤过、不与血浆蛋白结合、既不被肾小管重吸收也不被分泌。菊粉是一种果糖聚合物，符合这些标准。因此，菊粉的肾脏清除率被认为是测量GFR的金标准7。本视频展示的技术代表了传统方法，即在持续输注菊粉的同时，通过定时收集尿液来测定菊粉的肾脏清除率8,9。传统的菊粉测定曾采用蒽酮法，通过分光光度计对菊粉进行定量比色测定10,11。然而，为了便于在较小体积的尿液和血浆中检测菊粉，研究人员已将菊粉标记为放射性12-14或荧光标记物15-17。本视频中展示的实验采用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的菊粉来评估肾功能，因其避免了人体辐射暴露的风险，且FITC荧光的检测较为简便15。

本实验演示旨在为实验室技能有限的学生提供测量肾功能的理论理解。因此，实验前的FITC-菊粉溶液制备以及动物的手术准备，均由经验丰富的技术人员在演示开始前的1-2小时菊粉平衡期内完成。学生在平衡期结束时到达实验室参加演示，...

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披露

作者声明不存在竞争性经济利益。本文所包含的观点或主张均为作者的个人观点，不应被视为官方立场，亦不代表美国陆军部或国防部的观点。

致谢

实验室演示的资助来源为NIGMS基金：GM077119。感谢Joseph R. Haywood博士和Peter Cobbett博士对整合与器官系统药理学短期课程的支持。同时感谢Hannah Garver女士为实验室演示提供的技术支持。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-0 编织丝线外科缝合线Surgical Specialties CorpSP1033
96孔检测板Costar 3922
牛血清白蛋白Sigma Chemical CoA2934-25G
离心机Beckman CoulterMicroFuge 18, 357160
锥形样品管Dot Scientific Inc. #711-FTG
棉签Solon Manufacturing Co56200
数据采集软件ADInstrumentsLabChart Pro 7.0
电子天平 Denver InstrumentAPX-4001
FITC-菊粉Sigma Chemical CoF3272-1G
纱布敷料Covidien2146
加热手术台EZ-AnesthesiaEZ-212
肝素SagnetNDC 25021-402-10
HEPESSigma Chemical CoH3375
异氟烷Abbott Animal HealthIsoFlo, 5260-04-05
异氟烷蒸发器EZ-AnesthesiaEZ-190F
显微解剖镊Biomedical Research Instruments Inc.70-1020
微孔板荧光读板仪 - FluoroskanThermoScientificAscent FL, 5210460
NOVA 5+ 钠/钾分析仪NOVA BioMedical14156
带剪刀的 Olsen-Hegar 持针器Fine Science Tools12002-12
PE-190（用于膀胱导管）BD Medical427435
压力传感器 ADInstrumentsMLT1199
Pyrex 培养管Corning Inc.99445-12
大鼠股动脉锥形导管Strategic Applications Inc.RFA-01
Salix 呋塞米 5%Intervet#34-478
斜视剪Fine Science Tools14075-11
学生用外科剪刀Fine Science Tools91402-12
外科手套Kimberly-ClarkSterling Nitrile Gloves
注射泵Razel ScientificR99-E
组织镊Fine Science Tools91121-12
组织剪刀George Tiemann  Co105-420

5-0 编织丝线外科缝合线 Surgical Specialties Corp SP1033 96孔检测板 Costar  3922 牛血清白蛋白 Sigma Chemical Co A2934-25G 离心机 Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 锥形样品管 Dot Scientific Inc.  #711-FTG 棉签 Solon Manufacturing Co 56200 数据采集软件 ADInstruments LabChart Pro 7.0 电子天平  Denver Instrument APX-4001 FITC-菊粉 Sigma Chemical Co F3272-1G 纱布敷料 Covidien 2146 加热手术台 EZ-Anesthesia EZ-212 肝素 Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 异氟烷 Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 异氟烷蒸发器 EZ-Anesthesia EZ-190F 显微解剖镊 Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 微孔板荧光读板仪 - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ 钠/钾分析仪 NOVA BioMedical 14156 带剪刀的 Olsen-Hegar 持针器 Fine Science Tools 12002-12 PE-190（用于膀胱导管）BD Medical 427435 压力传感器  ADInstruments MLT1199 Pyrex 培养管 Corning Inc. 99445-12 大鼠股动脉锥形导管 Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix 呋塞米 5% Intervet #34-478 斜视剪 Fine Science Tools 14075-11 学生用外科剪刀 Fine Science Tools 91402-12 外科手套 Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves 注射泵 Razel Scientific R99-E 组织镊 Fine Science Tools 91121-12 组织剪刀 George Tiemann  Co 105-420

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