方法文章

直接可视化小鼠背侧耳蜗核以实现听觉通路的光遗传学刺激

DOI：

10.3791/52426

⸱

2015年1月20日

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1Department of Otology and Laryngology, Harvard Medical School, 2Department of Communication Sciences and Disorders, Worcester State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本实验方案的目的是概述一种手术方法，以在小鼠模型中直接进入背侧耳蜗核。

摘要

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关于利用病毒介导的基因转移来阻止或逆转听力损失的研究，主要集中于外周听觉系统。针对中枢听觉系统进行基因转移的研究较少。位于脑干的耳蜗腹后核（DCN）包含听觉通路中的二级神经元，是实施基因转移的潜在靶点。本方案展示了一种通过颅后窝入路直接且充分暴露小鼠DCN的技术。该方法适用于急性实验或存活手术。在直接观察到DCN后，可开展多种实验，包括将视蛋白注入耳蜗核，并通过连接蓝光激光器的光纤进行后续光刺激。 其他神经生理学实验，例如电刺激和神经示踪剂注射，也可行之有效。 该方法所能实现的视野暴露程度与刺激持续时间，使其适用于广泛的实验研究。

引言

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利用病毒介导的基因转移来逆转听力损失的研究，主要集中于外周听觉系统。1 针对耳蜗，研究人员已探索了多种递送途径，包括渗透压微型泵灌注2、用载体-转基因复合物浸泡的明胶海绵（Gelfoam®）2 或明胶海绵3、直接显微注射4；多种基因转移载体，包括腺相关病毒载体5,6、慢病毒载体7 和阳离子脂质体2；以及基因转移载体在靶组织以外的扩散情况2。最近，已在小鼠耳蜗中引入腺相关病毒（AAV）-1，以治疗因囊泡型谷氨酸转运蛋白-3 缺失所致的耳聋。8 此外，光遗传学在外周听觉系统中的应用也已有近期报道。9

然而，目前仅有少数研究探讨了向中枢听觉系统进行基因转移的方法。脑干的耳蜗背核（DCN）包含听觉通路中的二级神经元。尽管耳蜗核（CN）内的基因转移技术可用于多种研究，但将视蛋白（即光敏感蛋白）基因转移到DCN也可用于实现基于光遗传学的实验技术。通过病毒介导的基因转移将一种视蛋白（如通道视紫红质-2（ChR2））递送至DCN后，DCN的神经元将对光刺激产生敏感性。此前，光遗传学基因转移已在多个脑干区域中尝试应用，包括大鼠的后桥顶核、小鼠的蓝斑核、猴子的上丘以及小鼠的腹侧被盖区。10-14

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方案

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注：所有实验操作均遵循马萨诸塞州眼耳医院和哈佛医学院动物护理与使用委员会的规定，该委员会遵循国家动物护理指南，包括《实验室动物人道护理与使用公共服务政策》、ILAR 指南以及《动物福利法》。 下文列出的实验步骤详述了左侧耳蜗核（DCN）的暴露过程。进行可存活手术时，须使用无菌 器械。

1. 初次开颅及背侧耳蜗核暴露

  1. 麻醉
    1. 通过腹腔注射给予8–12周龄、体重18–24 g的小鼠赛拉嗪（20 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）进行麻醉。通过监测心率、呼吸频率以及脚趾夹捏回缩反射来确认麻醉效果。在麻醉期间，于眼睛上涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。当小鼠进入充分麻醉状态后，剃除覆盖头皮区域的毛发，以便无遮挡地暴露手术部位。
  2. 手术体位固定
    1. 将小鼠稳妥地置于小型动物立体定位仪中，并用鼻夹固定。
    2. 确保鼻夹松紧适度，既能保证小鼠呼吸通畅，又能完全固定头部。若头部固定不牢，在开颅手术过程中动物可能从头夹中脱落。
    3. 以标准方式放置听觉脑干植入电极， 以便监测心率。呼吸频率应通过直接观察进行监测。需注意，正常心率和呼吸频率会因小鼠年龄不同而有所差异。
    4. 放置体温探针，并将小鼠置于恒温加热毯上以维持正常体温。
  3. 头皮切口及颅骨顶间骨与枕骨的暴露
    1. 在显微镜下，沿....

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结果

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小脑部分抽吸法显示可进入耳蜗核

去除覆盖颅骨的皮肤和肌肉后，颅骨表面的解剖标志（如冠状缝和人字缝）可显示开颅部位的大致位置。使用咬骨钳进行开颅后，可观察到小脑。小心吸除小脑的一小部分后，即可观察到脑神经（CN），随后可对其进行注射（图1）。

利用蓝光激光刺激暴露耳蜗核次级区域

在初次暴露DCN、进行视蛋白基因转导并经过孵育期后，可使用蓝光激光刺激DCN。暴露DCN表面以进行光刺激的二次开颅手术，其技术方法与初次开颅手术类似（补充视频1）。DCN是一种厚度小于300 µm的表层结构。实验用小鼠标本在术后可保持活性长达6小时。

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讨论

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本文描述了在小鼠模型中直接可视化延髓耳蜗核（DCN）以操控中枢听觉系统的技术。这种直接可视化方法相较于主要的替代方法——立体定位法，具有显著优势。首先，直接可视化耳蜗核能够立即确认脑干靶点位置，而立体定位法则无法提供直接的视觉确认。在需要较长孵育时间的实验中（例如病毒介导的基因转移），如果注射“偏离”目标区域，则可能导致感染效率低下。此外，直接可视化方法适用于较宽年龄范围的动物。类似外科手术方法也可应用于其他动物模型（如大鼠和豚鼠）的存活实验中。

本方案中有几个关键步骤。首先，必须将小鼠正确固定在立体定位仪中。头部的任何移动都会导致开颅困难。其次，开颅位置至关重要。如果开颅位置不准确，将难以甚至无法在吸除小脑后观察到小脑深部核团（DCN）。最后，本方案最关键的步骤是对小脑进行部分定向吸除。吸除小脑有两种技术方法。第一种方法是在吸除过程中持续对小脑施加负压，将其自脑干上方轻轻提起。在此过程中，小脑深部核团可能部分显露于小脑下方，需持续吸引直至核团完全暴露且小脑组织被彻底清除。第二种方法是分层、多次进行小脑的部分吸除，直至小脑深部核团得以显露。若核团仍无法完全看清，可使用牙科尖头镊轻轻.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基金支持：本工作由 Bertarelli 基金会资助（D.J.L）、MED-EL 资助（D.J.L）以及美国国立卫生研究院基金 DC01089（M.C.B.）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
立体定位仪Stoelting51500
恒温毯Harvard507214
手术刀片 #11Fine Surgical Tools10011-00
虹膜剪Fine Surgical Tools14084-08
5 法式吸引管Symmetry Surgical2777914
牙科钻头Henry Schein100-8170
骨钳Fine Surgical Tools16020-14
10 µl Hamilton 注射器Hamilton 7633-01
34 号针头Hamilton 207434
咬骨钳Fine Surgical Tools16021-14

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
  2. Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
  3. Jero, J., et al.

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