本方案提供了利用旷场迷宫评估实验小鼠模型的一般运动活性、焦虑及情绪行为的方法。
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摘要
摘要
动物模型已被证明对研究人员回答行为机制相关问题具有不可估量的价值。开放旷场迷宫（Open Field Maze）是测量动物模型行为最常用的平台之一。该实验快速且相对简便，可提供多种行为信息，从一般的运动能力到有关被试动物情绪状态的数据均可获取。针对啮齿类动物模型，该方法可用于研究不同品系的小鼠或大鼠，包括实验室培育和野外捕获的个体。该技术也适用于研究不同药理学化合物对焦虑样行为的抗焦虑（anxiolytic）或促焦虑（anxiogenic）作用。本文详细描述了使用开放旷场迷宫评估小鼠行为的实验方案，并对两种C57BL/6小鼠品系的一般运动能力和与焦虑相关的情绪行为进行了简单分析。简而言之，根据所述实验方案，野生型小鼠表现出的与焦虑相关的行为显著少于同龄的基因敲除型小鼠，而两种品系在运动能力方面表现相似。
引言
开放旷场迷宫（Open Field Maze, OFM）最初于1934年开发，用于检测啮齿类动物的情绪反应性1。它已成为动物心理学研究中应用最广泛的行为检测方法之一2。该实验可对明确定义的行为进行简便且相对快速的评估，无需对受试动物进行训练，实施测试的人员也几乎不需要接受特殊的专业培训。这些优点使得开放旷场迷宫被广泛应用于其他动物物种的研究中，例如犊牛、猪、兔子、灵长类动物、蜜蜂和龙虾3。其广受欢迎的部分原因在于，该测试所依据的心理学和生理学概念通常较为简单且已被充分理解。例如，已有假说认为，进化力量促使动物形成了共通的应答模式，使大多数物种对特定刺激表现出由焦虑介导的恐惧或逃避反应。以啮齿类动物为例，它们对广阔、明亮、空旷且陌生的环境表现出明显的回避行为4。我们可以推断，它们在系统发育过程中已被条件化，将此类环境视为危险。开放旷场迷宫正是整合了所有这些特征，并以此作为其在行为范式测试中的应用基础。
开放旷场迷宫由带围壁的区域构成，围壁高度足以防止实验对象逃脱。典型的迷宫形状为圆形或方形，其面积根据所测试对象的体型而定，需足够大，以使迷宫中心区域产生开阔感。在开放旷场迷宫中可记录多种变量，大多数参数涉及不同类型的运动活动2。行走活动是最常研究的行为，但也可测量其他行为，如潜伏期或直立行为。通常情况下，啮齿类动物的行为是在无任何物体的空旷迷宫中进行分析。然而，在迷宫地面添加一个或多个物体，可进一步观察实验对象与新异附加刺激之间的相互作用2。当存在物体时，相关参数通常包括接近物体的次数，或在某些情况下，对某一物体相对于另一物体的偏好或回避行为。
许多焦虑行为测试基于实验动物的身体活动和运动能力5。在解释情绪相关行为测试时，如何区分非情绪性混杂因素（如运动活动）一直是激烈争论的焦点6,7。根据最初的描述，开放场实验（OFM）可推导出两种情绪性指标：运动活动和粪便颗粒排泄（或排便）1。然而，一些研究显示，这两个指标之间并无关联，支持了啮齿类动物情绪具有多维性的结论5。尽管如此，文献中关于这些指标与小鼠模型中情绪性或焦虑之间关系的不一致，可能归因于分析标准或测试程序的差异。在比较小鼠模型时，已有研究明确将开放场实验（OFM）的分析结果与其他焦虑指标联系起来8。
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方案
注意：此处进行的所有操作均已提交并获得机构动物照护与使用委员会（IACUC，研究合规办公室）批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南执行。用于行为测试范式的实验小鼠均为未经处理的初试小鼠，且未参与其他实验。本方案中使用的C57BL/6野生型和基因敲除小鼠此前已有描述9，本文所展示的数据均来自该文献。
1. 测试房间和旷场实验装置的准备
- 使用由四个活动室组成的多单元开放场迷宫（OFM）进行本项分析（图1）。每个活动室尺寸为50 cm（长）× 50 cm（宽）× 38 cm（高），由白色高密度、无孔塑料制成。
- 迷宫地面应具有纹理以提供行走时的摩擦力，而迷宫侧壁保持光滑。迷宫的各个象限在本测试中完全保持空置。考虑到本方案的其余部分，将使用上述迷宫中的单个象限来演示开放场迷宫实验。
- 使用前及每次测试后，用95%乙醇擦拭活动室，以清除前一只实验小鼠留下的任何气味线索。
- 在对小鼠进行测试前，确保乙醇完全挥发。每次测试间隔可能需要5–10分钟。
- 本项分析使用PanLab/Harvard Apparatus公司的SMART视频追踪软件记录并评估小鼠运动。
注意：可使用任何商用视频追踪摄像机和软件来追踪实验对象并分析开放场迷宫的结果。最终用户必须清楚如何校准和运行所用软件以完成每项独立分析。无论使用何种摄像机和追踪软件，只有严格按照制造商说明正确校准设备和软件，才能获得最佳结果。 - 在具备标准照明的房间内进行测试，房间需能容纳迷宫装置及运行软件所需的计算机。将视频摄像机悬置于迷宫正上方，可通过将其固定于天花板或使用任何高架支撑系统，确保镜头可完整覆盖整个迷宫区域（图2）。
- 作为实验的操作人员，应确保在房间内有足够的空间，使自己完全不会被迷宫中的实验动物察觉，以避免影响小鼠的行为表现。
2. 准备用于测量活动的软件
- 打开视频追踪软件。
- 软件启动后，将光标移至“数据采集”选项卡下的“单目标追踪”选项，单击以打开该功能。
- 选择屏幕底部的“静态背景”选项。
- 选择“静态背景”后，需使用软件在放入测试对象前拍摄迷宫图像。操作方法为：将光标移至屏幕底部的“拍照”按钮，单击一次。
注意：软件将拍摄一张不含测试对象的场景图像，该图像将在追踪过程中被从实时图像中减去，从而确保软件仅分析测试对象的运动。 - 确认背景图像已被追踪软件完全消除：将光标移至屏幕底部的“测试”按钮并单击一次。若背景图像已完全消除，则显示区域将为纯白色。若光照条件发生变化或迷宫被意外移动，则该区域会出现黑色“阴影”，表明两张图像未能完全重合。若出现此情况，请重复上述第2.4步。
- 确认背景设置无误后，使用“定时”选项配置采集过程中的时间控制方式。操作方法为：将光标移至“配置”选项卡，单击“定时”标题。在新打开的窗口中输入实验参数。
- 本实验方案中，选择“程序设定时间”作为追踪时长，设定为10分钟。将“延迟时间”设为5秒，以便在追踪开始前有足够时间将小鼠放置于迷宫中央并撤离。输入“采集时间”为10分钟，作为测试的持续时间。将“停止控制”设为“当程序设定时间（10分钟）结束时”，以便软件自动关闭摄像头及追踪功能。
- 完成所有时间参数设置后，将光标移至“关闭”按钮并单击以关闭窗口。此时即可开始测试流程。
3. 开放旷场实验的实施
注意：本方案所使用的软件包最多可同时追踪16只小鼠。为便于操作，且如上所述，此处讨论的方案针对使用开放场迷宫（OFM）单个象限的一只小鼠。就本方案所用设备而言，每个迷宫象限最多可同时追踪4只小鼠。若使用多隔间迷宫，在将第一只实验小鼠放入其指定象限后，需将其余小鼠分别放入各自对应的迷宫象限中以进行追踪分析。本方案的后续说明将仅针对迷宫的单个象限进行。
- 将小鼠连同其饲养笼从饲养室移至测试室。在开始测试前，让小鼠在测试室内适应环境至少30分钟。
- 轻轻抓住小鼠尾巴，将其从饲养笼中取出，并放置于开放旷场迷宫中央，同时单击SMART软件的“开始”按钮，启动软件以追踪小鼠运动。小鼠通常会立即移动至迷宫边缘区域，释放小鼠与开始追踪的时间应保持一致，以准确记录该运动过程。
- 让小鼠在迷宫的相应象限内自由且不受干扰地活动10分钟，在此期间，追踪软件将记录其运动轨迹（图3）。
- 测试结束后，轻柔地抓起小鼠，将其从迷宫中取出并放回原饲养笼中。
- 在清洁迷宫前，目视计数迷宫内存在的粪便颗粒，并手动记录数量以供后续分析。
- 清除所有粪便颗粒，并擦拭尿液痕迹。用95%乙醇喷洒迷宫象限的地面和墙壁，再用干净的纸巾擦拭，待乙醇完全挥发干燥后，方可用于下一只小鼠的测试。
- 对下一只小鼠重复上述操作步骤。
4. 测试过程中行为的测量与分析
注意：通过本方案可轻松表征开放场地行为的三个测量方面（参见讨论部分）。以下简要说明如何在视频追踪软件中获取这些测量数据。
- 在 SMART 软件的主界面中，将光标移至“Zones”选项卡，单击“Definition”以打开区域编辑器（Zone Editor）。
- 按照 SMART 软件用户手册中的详细说明，定义要叠加在追踪路径上的区域或网格。此处使用该软件定义了一个覆盖迷宫底部的 5 × 5 网格，每个方格为 10 cm 的正方形（图 4）。在关闭区域编辑器之前，请务必保存所创建的区域文件。
- 在 SMART 软件的主界面中，将光标移至“Analysis”选项卡，单击以打开数据分析窗口。
- 将光标移至“File”选项卡，并打开上述创建的区域文件。
- 将光标移至“Configuration”选项卡，并打开“Track Analysis”选项，这将打开“Single-subject analysis configuration”窗口。
- 将光标移至“Standard”选项卡，将“Available Parameters”框（左侧）中的“Travelled distance”参数移至“Included Parameters”框（右侧）。
- 将光标移至“Zones Transitions”选项卡，并将所有相关参数如上所述移至“Included Parameters”框中。
- 确保窗口底部的“Full Track”复选框已被勾选。
- 将光标移至“OK”按钮，关闭“Single-subject analysis configuration”窗口。
注意：根据您希望执行的分析类型，此窗口中还可选择许多其他选项以提取数据。请阅读您所使用程序的详细用户手册，以确定哪些参数对您的数据分析最为重要。
- 在程序窗口左上角的“File”选项卡下，打开“Single subject track”窗口，并在所有待分析的轨迹旁打勾。将光标移至窗口顶部的“Check Mark”按钮并单击，以关闭轨迹浏览器（Track Explorer）窗口。
- 在数据分析窗口中，将光标移至“Go”按钮并单击，以启动轨迹数据的分析。
- 分析数据可输出为 ASCII 文本文件，也可直接导出至 EXCEL 电子表格中。请使用您所用软件程序的输出工具将数据导出以供自用。
注意：完成上述数据分析步骤后，将输出总移动距离以及在指定区域内停留的时间。需要再次强调的是，获取这些测量值的具体操作步骤可能因所使用的用户软件不同而有所差异，但无论使用何种软件程序，数据本身及其结果解释应基本一致。此外值得注意的是，本实验方案消除了测试管理员的主观偏差，因为所有收集的数据均由软件自动量化，而非由管理员主观判断。因此，所收集的数据不包含任何可被主观评价的成分。
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结果
在大多数情况下，每种小鼠品系的测试个体平均数量约为20只，以产生足够的统计学意义。然而，根据小鼠的可获得性，该数量可在8至30只之间变动。根据所需的测量或比较，建议使用年龄相匹配的实验对象。
在开放旷场迷宫实验中，首个且 arguably 最重要的特定参数是总移动距离。尽管在比较时测量单位并不重要，但通常以公制单位（cm）表示。在本实验所呈现的数据中（图5），野生型（WT）或正常的C57BL/6小鼠与特定基因敲除的C57BL/6小鼠品系（KO）表现出相似的移动能力。当不同品系或处理组之间所行进的总距离相近时，对情绪相关行为的进一步分析将更为简便，因为此时运动活动的影响实际上已被排除。如果被测试小鼠的运动能力存在显著差异，则对区域进入次数或在迷宫特定区域停留时间等指标的进一步分析可能会因活动量差异而产生偏差，而非真实反映品系或处理效应。虽然已有方法可用于校正运动活动的不均衡，但这些方法通常与具体的研究问题密切相关。
由于两种小鼠品系的总活动距离相似，我们能够分析野生型（WT）与基因敲除型（KO）...
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讨论
开放旷场迷宫是动物行为学研究中最常用的实验平台之一。在进行开放旷场迷宫实验（OFM）过程中，可采集并分析多种重要的传统和行为学参数2,4。这些数据使研究人员能够测量从整体运动活动到与焦虑相关的情绪行为等多种行为表现8。然而，开放旷场迷宫的使用也存在一些不足之处。其中一个混杂因素是在任何一次测试过程中可被操控的静态变量范围较广，例如时间、光照条件以及是否引入新异物体等。实验方案设置与设计上的差异虽然对于支持广泛的应用至关重要，但也使得不同研究之间的比较变得困难。当受试对象本身存在差异，例如使用不同遗传背景或转基因小鼠品系，以及接受不同药物处理时，测试结果之间的可比性将进一步降低。尽管存在这些问题，开放旷场迷宫仍然是啮齿类动物行为研究中最广泛应用的技术之一。本文将讨论通过开放旷场迷宫获得的结果及其分析方法，并探讨其与小鼠焦虑和情绪性之间的关系。
本方案可便捷地表征旷场行为的三个方面：1）测试全程计时期间动物行走的总距离（单位：cm）；2）趋壁性，即动物在迷宫外周墙壁附近停留的时间占整个10分钟测试时长的百分比，用以指示类似焦虑的行为；3）移除...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH-2RO1NS033661）和阿拉巴马农业实验站（HATCH ALA021-1-09017）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 多单元旷场实验 | San Diego Instruments, Inc. | White 7001-0354 | 可使用任何单单元或多单元旷场迷宫 |
| SMART DT 跟踪软件 | PanLab/Harvard Apparatus | 76-0695 | 本实验方案可配合任何跟踪软件使用 |
| Sony 990x 视频摄像机录像机 | Sony | CCD-TRV328 | 可将任何合适的视频摄像机连接至计算机，用于记录运动轨迹。 |
参考文献
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