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EPA 方法 1615：通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。第二部分：总可培养病毒检测

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DOI：

10.3791/52437

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2016年9月11日

 , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency

本文内容

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摘要

本文介绍了一种利用水牛绿色猴肾细胞系检测可培养病毒总量的方法。该方法为检测环境水和饮用水中感染性病毒的存在情况提供了一种标准化的工具。

摘要

当利用多个分析实验室开展关于环境中和饮用水中病毒发生情况的全国性研究时，需要采用一种标准化的方法。美国环境保护署（USEPA）制定的1615号方法旨在为此类水中肠道病毒和诺如病毒的检测提供统一标准。该方法通过带正电荷的滤膜从水样中浓缩病毒，用牛肉提取液将病毒从滤膜表面洗脱，再通过有机絮凝进一步浓缩。本文介绍了1615号方法中关于滤膜洗脱、二次浓缩以及总可培养病毒检测的实验方案。将每个样品的浓缩洗脱液取部分接种至10个重复的水牛绿猴肾细胞培养瓶中。根据出现细胞病变效应的培养瓶数量，计算每升水中感染性病毒单位的最可能数（MPN）。该方法采用多项质量控制措施，以提高数据质量，并减少实验室间和实验室内的变异。实验室必须达到规定的性能标准。通过对在试剂级水和接种了萨宾Ⅲ型脊髓灰质炎病毒的地下水样品中病毒回收率的评估，验证了1615号方法的性能。在总可培养检测中，试剂级水中的脊髓灰质炎病毒平均回收率为111%，地下水中为58%。

引言

肠道病毒是一类感染人类肠道系统并通过粪-口途径传播的病毒。这些病毒通过污水处理厂和化粪池的排放物、设计不当或破损的化粪池、破裂的污水管道、合流制下水道溢流以及其他点源和非点源进入地表水和地下水1-4。水源性病毒导致的人类感染和疾病通常因饮用受污染或消毒不充分的水，或通过接触娱乐用水而发生。疾病症状可能包括轻度至重度胃肠炎；结膜炎；发热；上呼吸道不适；手足口病；心肌炎；无菌性脑膜炎；脑炎；瘫痪；败血症5-8，甚至死亡9,10。

美国环保署方法1615（USEPA Method 1615）提供了一种用于检测环境水和饮用水中感染性肠道病毒颗粒的程序。这些水体中可能含有感染性和非感染性病毒颗粒的混合物，但只有感染性颗粒具有潜在的健康危害。在环境水和饮用水中，感染性病毒颗粒会随着时间推移而失去感染能力，原因包括病毒蛋白衣壳完整性的丧失、阳光中紫外线对核酸的损伤，以及水中可能存在的消毒剂所造成的破坏11-13。该方法中提供的总可培养病毒检测程序基于在水牛绿猴肾细胞（BGM）系中产生细胞病变效应（CPE）的原理。选择该细胞系是因为其在环境病毒学领域被广泛使用14,15，尽管其检测到的感染性病毒类型主要局限于某些肠道病毒15。本文旨在描述方法1615中关于五英寸正电荷筒状滤器的洗脱、二次浓缩以及总可培养病毒测定的具体操作步骤。对该方法整体性能的评估详见Cashdollar et al.16的研究。

方案

注：请参见补充材料部分 S1 以获取术语定义列表。与美国环保局方法 1615 相关的质量保证程序在补充材料部分 S2 中有详细描述。

1. 滤膜洗脱步骤

  1. 第一次洗脱
    1. 将500 ml经缓冲的1.5%牛肉提取物（pH 9.0）置于量筒中，并升温至室温。打开滤器外壳，加入足量牛肉提取物以完全覆盖电正性滤膜。盖上滤器外壳盖，将剩余的牛肉提取物倒入无菌烧杯中。
    2. 接触1分钟后，使用加压容器或蠕动泵将滤器外壳内的牛肉提取物溶液与无菌烧杯中剩余的溶液缓慢通过滤膜。将洗脱液收集至2 L玻璃烧杯中。
  2. 第二次洗脱
    1. 使用另外500 ml经缓冲的1.5%牛肉提取物重复步骤1.1，但在步骤1.1.2中将接触时间延长至15分钟。
    2. 将第二次洗脱所得的牛肉提取物加入盛有第一次洗脱液的2 L烧杯中。向烧杯中加入一个无菌搅拌子。

2. 有机絮凝浓缩法

  1. 用0.525%次氯酸钠对复合式pH电极进行灭菌，时间不少于5 min。用无菌去离子水冲洗电极2O，然后用 0.05 M 硫代硫酸钠脱氯。使用 pH 为 4 和 7 的标准缓冲液校准 pH 计。
  2. 将含有洗脱液的烧杯放在搅拌器上。打开搅拌器并提高搅拌速度，直至形成漩涡。
  3. 将洗脱液的 pH 值缓慢调节至 3.5 ± 0.1，通过逐滴加入 1.2 M HCl 实现。需逐滴加入 HCl，因为快速加入会导致病毒失活。在此过程中，随着沉淀物开始形成，洗脱液将变得浑浊。
  4. 将混合速度降低至缓慢搅拌，然后在室温下继续监测并维持洗脱液的pH值为3.5 ± 0.1，持续30分钟。
  5. 将沉淀的牛肉浸提物悬液倒入一个或多个离心管中，在2,500 × g条件下离心15分钟 4 °C从离心机中取出瓶子，用移液器吸除或缓慢倾倒上清液，以防止沉淀物损失。弃去上清液。
    注意：不同批次的牛肉浸膏在沉淀物的数量和质量上可能存在显著差异。某些批次产生的沉淀物可迅速溶解，而其他批次产生的沉淀物则难以溶解。
  6. 向含有沉淀的离心管中加入 30 ml 0.15 M 磷酸钠溶液。
    1. 使用0.15 M磷酸钠缓冲液（pH 9.0）溶解在5分钟内完全溶解的牛肉提取物批次中的沉淀物。沉淀物完全溶解后，搅拌10分钟，然后立即进入步骤2.7。
    2. 使用 0.15 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.0–7.5）溶解其他所有沉淀物。搅拌 10–15 分钟以促进溶解；对于较难溶解的沉淀物，可使用无菌刮刀将其破碎，或在搅拌过程中用移液器反复抽吸溶液，或在摇床（160 rpm）上振荡沉淀物，或结合使用上述方法。
      注意：使用多个离心管时，先用少于30 ml的磷酸钠溶液合并沉淀物，然后用剩余的磷酸钠溶液冲洗其他管子，将沉淀物全部转移至同一个管子或烧杯中。
    3. 如果合并的沉淀物位于平底离心瓶中，向瓶中加入一个搅拌子。进入步骤 2.6.5。
    4. 如果合并的沉淀物位于带有锥形底部的离心管中，则将其转移至一个小玻璃烧杯中，并向烧杯中加入一个搅拌子。
    5. 将瓶子或烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌至沉淀物完全溶解。
    6. 用0.525%次氯酸钠对复合型pH电极进行重新灭菌，并按步骤2.1所述使用0.05 M硫代硫酸钠脱氯。使用pH 7和pH 10标准缓冲液校准pH计。用1 M NaOH缓慢调节完全溶解的沉淀物的pH至9.0，然后搅拌10分钟。
  7. 移除搅拌子，将溶解的沉淀物在 4,000–10,000 x g 条件下离心 10 分钟，并 4 °C.
  8. 小心地将上清液倒入玻璃烧杯中，避免扰动沉淀。向烧杯中加入搅拌子，弃去沉淀。
  9. 将烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌溶液。逐滴加入1.2 M HCl，调节pH至7.0–7.5。
  10. 通过已用15 ml 1.5% 牛提取物、0.05 M 甘氨酸、pH 7.0–7.5预处理过的带有预滤器的除菌滤膜过滤上清液，进行过滤除菌。
  11. 检测样本体积（S）的计算：
    1. 使用公式1计算除实验室加标空白和实验室试剂空白外所有测试样品的S值，
      Static equilibrium equation, S=D/TSV×FCSV, describes force distribution calculation.        公式 1
      其中，D（检测的原始水样体积）为地下水时取500 L，TSV（总样品体积）为实验室接收到的通过5英寸正电荷滤芯的野外样品体积，FCSV（最终浓缩样品体积）为第2.10步过滤后的体积。示例见补充材料第S4.1节。
    2. 计算 S 用于实验室加标空白样（LFB； 即，使用接种的试剂级水作为阳性质量控制）以及实验室试剂空白（LRB； 即，使用试剂级水作为阴性质量对照）通过乘以 FCSV 0.3。
  12. 将FCSV分为三个子样本。
    1. 制备体积为1.04倍的1号和2号子样品 检测样本体积. 将这些子样品在 -80 °C 或更低温度下冷冻70 °C 若无法在24小时内使用总可培养病毒检测法（子样本1，步骤4）进行分析，或无法在24小时内处理用于分子检测（未展示）；否则，应置于 4 °C.
    2. 将剩余体积（子样本3）冷冻至或低于 -70 °C.
  13. 计算 接种物体积 通过分割 S 10。

3. 总可培养病毒量子测定法

注意：所有步骤中均需小心添加溶液，避免扰动细胞单层。

  1. 从传代后3–6天含有BGM细胞单层的测试容器中倾去或吸除培养基，然后加入与移除量相等的平衡盐溶液。
  2. 将细胞培养试验容器中的平衡盐溶液倾出或吸除，然后接种细胞培养试验容器
    1. 为每种测试样品接种10个测试容器，每个容器中接种的子样品1体积等于 接种物体积 以及总可培养病毒量子测定对照（补充材料部分 S2.4）。
    2. 对于LFB和实验室加标样品基质（LFSM； 即，接种水基质样品），使用子样品3和0.15 M磷酸钠缓冲液（pH 7.0–7.5）作为稀释液，制备5倍、25倍和125倍稀释液。稀释操作的示例步骤见补充材料S3部分。每个稀释系列使用10个已洗涤的细胞培养试验容器进行接种 接种物体积 在每个测试容器上，以及第3.2.1步中接种未稀释子样品1的容器上。
    3. 对于第3.2.1步中的任何测试样本（第3.2.2步接种的样本除外），若在培养14天后所有10个重复均出现细胞病变效应（CPE）（参见第3.3步），则对子样本3制备5倍、25倍、125倍和625倍稀释液。每种稀释度系列分别接种10个经洗涤的细胞培养测试容器，使用一种 接种物体积 在每个测试容器中，同时加入一组新的可培养病毒总量测定对照（补充材料部分 S2.4）。
    4. 通过前后倾斜容器，将接种物均匀分布于细胞单层表面。将待测容器置于室温下，在机械摇床平台上以每分钟1–5次振荡的频率孵育80–120分钟，或每15–20分钟手动摇动容器一次，以使可能存在的病毒充分吸附于细胞。
    5. 加入预热的维持培养基，然后将试验容器在 36.5 ± 1 °C.
  3. 每天使用显微镜观察各试验容器中细胞病变效应（CPE）的出现情况，前3天每日观察，之后每2–3天观察一次，直至第14天。将出现≥75%细胞病变效应（CPE）的任何试验容器转移至温度设定为或低于-的冰箱中70 °C. 将所有剩余培养物及总可培养病毒量子测定对照在或低于 -70 °C 在最后一天检查血管后。
  4. 解冻所有培养物，并通过滤膜过滤每个细胞病变效应（CPE）阳性的测试容器中至少15%的培养基 0.2 μm 无菌滤器。如果由于堵塞导致无法过滤指定体积，则以1,500–18,000 x g离心培养基10分钟，并 4 °C 过滤前
  5. 对所有样本进行第二次传代st 使用经洗涤的BGM测试容器传代测试容器。
    1. 用所有阴性测试容器的解冻培养基以及阳性容器的过滤培养基，分别取相当于其体积10%的接种量，接种至新的测试容器中。
    2. 重复步骤 3.2.4–3.4.3，但将任何在第1次检测中呈阴性的测试容器进行冷冻st 传代并呈阳性于第2代nd 如步骤 3.3 中所述。执行 3rd 传代，具体操作如针对第2代所述nd 仅使用阴性检测对照和在第1次检测时呈阴性的细胞培养物进行传代st 传代及第2代呈阳性nd 传代
  6. 当病毒在两种条件下均表现出细胞病变效应（CPE）时，判定该检测容器为病毒阳性st 和 2nd 传代，或在CPE直到第2代才出现的情况下nd 传代，在2的两个nd 和 3rd 传代。
  7. 使用美国环保署（USEPA）最可能数计算器，并采用如图所示的默认程序设置 表 S2 用于计算所有测试样本的病毒滴度。
    1. 将步骤 3.6 中每个测试样本的病毒阳性重复检测容器数量输入计算器，以确定 MPN/ml 值（MmL）以及上部（CLμL）和较低（细胞系lmL95% 置信区间/ml 值
    2. 获得 MPN/L 值（ML使用公式 2 计算相应测试样品的）值。
      Static equilibrium formula, \( M_L = \frac{M_{mL} \, S}{D} \), illustrating moment distribution.        公式 2
      MmL 是步骤 3.7 中的 MPN/ml 值， S 是 检测样本体积，以及 D 是 检测的原始水样体积.
    3. 将 CL 代入以计算上限置信区间/L微升 M 的值mL 值。通过将 CL 代入计算下置信限/LlmL M 的值mL 值。示例计算见补充材料第 S4.2 节。
    4. 报告 MmL 将0值记为≤1/D。例如，地下水样品为≤0.002 MPN/L（≤1/500 L）。
    5. 通过将计算器得出的每毫升数值乘以以下系数，计算每个实验室加标空白样和实验室试剂空白样的MPN值及95%置信限 S 然后将结果除以 0.3。

结果

采用带正电荷的滤膜从三家饮用水处理厂和一口私人水井的源地下水中浓缩病毒。在不同时间点，从各处理厂分别采集了两组样本（每组包含一个现场样本和一个LFSM对照样本），并从私人水井采集了一组样本。总体病毒回收率通过其中两家处理厂和该私人水井的LFSM样本确定（由于重复培养瓶中出现异常的细胞病变效应，导致无法准确测定其中一家处理厂两个样本及另一家处理厂一个样本所用接种病毒的MPN值，因此这些样本未纳入计算）。地下水中脊髓灰质炎病毒的平均回收率为58%，变异系数为79%（图2）16。在所有未接种病毒的地下水现场样本的重复检测中，均未检测到可培养的病毒。

还使用两种不同接种浓度的 LFB 样品来评估方法性能。采用“低”滴度（300 MPN 的脊髓灰质炎病毒）评估在低于美国环保局方法 1615 中“标准”500 MPN LFB 水平下的性能；采用“高”滴度（1,000 MPN 的脊髓灰质炎病毒）测试在 LFSM 对照水平下的性能。这些对照的检测结果相似，平均回收率为 111%，变异系数为 100%（图 2）。所有 LRB 样品均为阴性，所有 LFB 样品的检测结果均在可接受范围内（补充材料 表 S1）。

病毒过滤示意图；洗脱装置：滤筒模块、管路、加压容器、烧杯。
图1. 滤器洗脱。 示意图为使用加压容器进行滤筒式滤器洗脱的装置。通过正压空气将加压容器中的牛肉浸出液推动，使其流经含有电正性滤芯的滤筒外壳。也可用蠕动泵替代加压容器，将泵的进液端置于盛有牛肉浸出液的容器中。

带误差线的回收率柱状图；展示实验回收效率的对比数据。
图2. 从地下水和试剂级水中回收脊髓灰质炎病毒的平均回收率（%）。 图中显示了从地下水（静态平衡显微镜图像；ΣFx=0；材料研究中的力学平衡分析。；n=4）和试剂级水（黑色材料纹理的显微图像，显示详细的表面图案分析。；n=12）样品中回收脊髓灰质炎病毒的平均百分比回收率。12个试剂级水样品中，包括6个接种了300 MPN和6个接种了1,000 MPN脊髓灰质炎病毒的样品。误差线表示标准误差。

讨论

美国环保署方法1615（USEPA Method 1615）是在非受控污染物监测法规第三轮监测周期（UCMR3）期间开发的17，主要用于测定地下水中病毒的存在情况。该方法与信息收集规则（Information Collection Rule, ICR）方法15,18有许多共同步骤，但存在两个细微差异。两种方法均采用终点稀释法（quantal assay），通过检测病毒在BGM细胞单层上产生的细胞病变效应（CPE），并基于最可能数（Most Probable Number, MPN）计算进行定量。方法1615允许使用一种较新的正电滤膜，用于从多种水质基质中浓缩病毒，并将每个稀释度所需的细胞培养测试容器重复数从20个减少至10个。这两项微小改进均降低了整体方法成本。重复数的减少可节省人力，但会导致检测限略有降低。尽管预期地下水中病毒浓度低于地表水19,20，但该方法所检测的样品量是地表水方法的五倍，可在一定程度上弥补检测限的差异。减少重复数对于大多数地表水样品是足够的，但部分样品仍需进行稀释处理。

方法1615包含若干关键步骤和局限性。牛肉提取物在不同批次之间存在差异，每批都应测试其病毒洗脱效果以及在二次浓缩步骤中的病毒浓缩能力，具体测试方法见补充材料部分S2.3。该方法采用精确的公式来计算接种到BGM细胞培养物的样品量以及确定病毒滴度，若未严格遵循这些公式，将导致结果不准确。细胞培养过程中必须采用正确的无菌操作技术。在14天培养期间出现异常的未感染BGM细胞培养对照，通常提示细胞培养维护存在问题。在向细胞培养瓶接种和添加培养基的移液操作中，也必须格外小心，以避免交叉污染。补充材料第S2部分所述的质量控制措施必须严格遵守，该部分还提供了针对质量问题的故障排除建议。

病毒吸附到带正电滤膜的主要机制是电荷相互作用，该作用与滤膜上正电荷的强度以及病毒自身负电荷的强度有关，后者取决于病毒的等电点和待测水样的pH值21。从滤膜中洗脱病毒的过程同样受到这些相互作用强度的影响。由于不同病毒类型之间，甚至同一种类内不同毒株之间的电荷特性存在差异，因此病毒从滤膜上的洗脱并不完全一致。这意味着任何检测结果都可能低估环境水体中实际存在的病毒水平。此外，仅使用单一的BGM细胞系也会低估病毒的存在。该细胞系中能够产生细胞病变效应（CPE）的肠道病毒种类主要局限于脊髓灰质炎病毒和Enterovirus B种的血清型，以及部分呼肠孤病毒14,15,22。其他具有感染性的病毒类型将无法被检测到。

脊髓灰质炎病毒从地下水和试剂级水中的回收率均符合美国环保局方法1615对性能评价（PE； 即，向试剂级水样中接种未知滴度的样本，这些样本用于在研究开始前评估分析人员的检测性能）以及LFB样本（补充材料 表 S1）。采用培养法从地下水中获得的58%回收率与其他人使用自来水时报道的结果相似。23,24LFB样品的平均回收率为111%，变异系数（CV）为100%，尽管高于ICR期间PE样品所观察到的结果，但仍符合方法性能可接受标准。ICR期间PE样品的实验室间平均回收率为56%（CV为92%），而实验室内的平均回收率在36%至85%之间（CV为58%至131%；来自ICR PE数据库的未发表数据）。本研究中，低接种量LFB样品的回收率高于高接种量样品（122%对比42%）。在ICR设计阶段，预期接种量较低的PE样品其回收率会低于接种量较高的样品。与本研究中LFB样品的结果类似，ICR中PE样品的脊髓灰质炎病毒回收率在接种量≤300 MPN、300–1,500 MPN和>1,500 MPN时分别为71%（CV 100%）、54%（CV 69%）和44%（CV 71%）。 >1,500 MPN，分别。

检测水样中感染性病毒的方法有多种25。与其他方法相比，本方法在标准化程度上具有重要意义。该标准化不仅包括质量和性能控制，还采用规定的体积和计算公式，以确保所有分析实验室均以相同方式执行该方法。若缺乏标准化，不同实验室之间的结果将难以比较，因此在多个分析实验室开展大规模研究时，标准化至关重要。由于具备内置的标准化流程，未来该方法可进一步扩展，以涵盖更多病毒类型和细胞系。目前已有研究正在开展，旨在为将腺病毒纳入该方法提供数据支持。

披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

作者感谢美国农业部（威斯康星州马什菲尔德）的 Mark Borchardt 博士提供了本研究中使用的萨宾脊髓灰质炎病毒 3 型；感谢 Dynamac 公司的 Mary Jean See、Nancy Schable 和 Jenifer Jones 进行 BGM 培养物的制备；感谢 Nichole E. Brinkman、Shannon M. Griffin、Brian R. McMinn、Eric R. Rhodes、Eunice A. Varughese、Ann C. Grimm、Sandhya U. Parshionikar 和 Larry Wymer 对美国环保局方法 1615 全面评估所做出的贡献；感谢 Gretchen Sullivan 提供的技术支持；同时感谢当地私人井主和供水单位允许我们采集水样。尽管本研究已通过美国环保局审查并批准发表，但其内容不一定反映该机构的官方政策。提及商品名称或商业产品并不构成对其使用之认可或推荐。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
脱水牛肉浸粉BD Bacto211520
冻存管Thermo Fisher3775/945373
Hank’s 平衡盐溶液Invitrogen14170-112
机械摇床平台DaiggerEF4907G
旋转摇床Thermo Fisher14-285-729
带预过滤器的除菌滤器VWR28143-295
除菌注射器滤器Corning431219
pH 标准液Sigma-Aldrich33643, 33646, 33648
MEMSigma-AldrichM1018 或 M4642
Leibovitz L-15Sigma-AldrichL4386
碳酸氢钠，7.5%Sigma-AldrichS8761
胎牛血清Invitrogen10082-139
抗生素-抗真菌剂Life Technologies15240-062
胰蛋白酶-EDTAInvitrogen25200072

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:

These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2),

to:

These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).

The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:

The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR,

to:

The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

标签

EPA 方法 1615：通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。第二部分：总可培养病毒检测
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