丘脑前核深部脑刺激后大鼠海马区基因表达变化的分析

摘要

深部脑刺激（DBS）手术治疗作用背后的机制仍需进一步研究。本文所述方法介绍了一种实验性方法，通过分析可能促进DBS术后神经发生的候选基因的基因表达谱，来探讨DBS所触发的细胞事件。

摘要

脑深部电刺激（DBS）手术通过靶向大脑多个区域（如基底神经节、丘脑和丘脑下核区域），已成为治疗多种药物难治性运动障碍的有效手段。近年来，DBS手术的应用范围已逐步拓展至病态性肥胖、抑郁症及强迫症等其他疾病领域。尽管适应证不断扩展，目前对DBS手术产生治疗效应的潜在生理机制仍知之甚少。研究这一问题的一种方法是对接受电刺激的神经元进行基因表达分析。既往研究表明，在大鼠中通过DBS靶向丘脑前核（anterior nucleus of the thalamus）可诱导齿状回的神经发生¹。临床上，靶向ATN的DBS手术已广泛用于治疗耐药性癫痫。因此，探索电刺激ATN所诱导的转录水平变化对我们具有重要意义。本文中，我们描述了在成年雄性Wistar大鼠中实施立体定向引导下靶向ATN的DBS手术的技术方法，并阐述了后续的组织解剖、RNA提取、cDNA制备以及定量RT-PCR检测基因表达变化的操作步骤。该方法可被应用于或经修改后用于刺激基底神经节及其他临床上常靶向的大脑区域。本文所述的基因表达研究采用候选靶基因策略，以发现可能介导DBS作用机制的关键分子因子。

引言

深部脑刺激作为一种神经外科技术的发展历史可追溯至19世纪70年代，当时人们开始探索通过电刺激脑回路的可能性²。自20世纪60年代起，慢性高频刺激开始被用于治疗神经性疾病³。到了20世纪90年代，随着慢性植入式深部脑刺激电极的出现^4-6，接受深部脑刺激治疗的神经性疾病种类持续增加。深部脑刺激在美国首次被用于治疗原发性震颤⁶。如今，该手术已广泛应用于目前无法通过药物干预有效治疗的多种神经性疾病。目前，深部脑刺激已被用于治疗帕金森病和肌张力障碍等运动障碍疾病^7-9。阿尔茨海默病型痴呆、亨廷顿病、癫痫、慢性疼痛以及神经精神类疾病，如抑郁症、强迫症（OCD）、抽动秽语综合征（Tourette’s syndrome）和成瘾等，也均属于可采用深部脑刺激治疗的疾病范畴^10-12。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）仅正式批准深部脑刺激用于治疗帕金森病、肌张力障碍和原发性震颤，但针对上述其他疾病的深部脑刺激应用目前正处于不同阶段的实验室与临床研究中，为患者带来了广阔前景^13,14。

临床上，DBS 手术分为两个阶段进行。第一阶段是通过影像定位、CT、MRI 以及微电极记录相结合的方法，将 DBS 电极精确地植入目标解剖位置。第二阶段是在患者上胸部植入脉冲发生器，并将延伸导线从头皮连接至脉冲发生器。根据不同的神经系统疾病，目前已标准化多种脉冲发....

方案

注意：伦理声明：本文所述所有操作均符合美国国立卫生研究院（NIH）动物研究指南（《实验动物护理与使用指南》）的要求，并已获得哈佛医学院动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 术前准备

1. 确保所有外科手术器械均通过高压灭菌或根据需要使用消毒溶液和/或乙醇进行清洁消毒。尽可能使用无菌一次性设备，如手术刀、针头和注射器。
2. 用外科手术巾覆盖工作台面，并确保配备有生物危害废物处理设施。
3. 称量大鼠体重并计算麻醉剂量。使用氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮 75 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg）对大鼠进行麻醉。
   注意：体重在 200–250 g 之间的大鼠最适合固定于立体定位仪中，并可实现对丘脑前核（ATN）的精确定位。也可使用异氟烷作为麻醉剂。
4. 将两个无菌电极（通过高压灭菌或环氧乙烷灭菌）安装并固定在立体定位手术仪的电极夹持器  (图 2) 上，并借助显微镜（10–40 倍放大），检查电极尖端是否对齐。将两个电极固定在相距 3.0 mm 的位置。
   注意：操作时应避免电极尖端接触硬物表面，以防损坏。

2. DBS 手术

1. 向动物腹腔内注射氯胺酮/赛拉嗪混合物，并通过检查趾夹反射、呼吸频率、呼吸深度及呼吸节律确认动物已达到外科麻醉水平。剪除....

结果

图1A 和 图1B 显示了BDNF和GABRD相对于对照基因β-actin的相对表达水平。BDNF是一种神经营养因子，常与多种神经疾病中的神经保护作用相关^38-41。因此，分析在刺激前丘脑核（ATN）后BDNF的表达谱具有重要意义，因为ATN刺激可为癫痫患者带来治疗益处。在 图1A 中，展示了深部脑刺激（DBS）术后各指定时间点BDNF的基因表达谱，结果显示在DBS手术后即刻（0小时）BDNF表达即上调，并在刺激后3小时达到峰值（比未刺激组高3倍）。该结果提示，BDNF表达的增强及其介导的神经保护作用可能有助于DBS的治疗效果。另一个基因GABRD（图1B）也通过qPCR方法进行了检测。GABRD是一种GABA受体，是抗癫痫药物研发的潜在靶点之一⁴²。GABRD的表达谱同样显示，在DBS刺激后3小时，刺激组动物的表达水平高于未刺激对照组动物。鉴于GABA激动剂已被用作有效的癫痫发作抑制剂，观察到DBS后GABRD表达增强的现象引人关注，提示GABA可能在DBS.......

讨论

继贝纳比德的开创性工作之后 等 在使用脑深部电刺激治疗帕金森病和原发性震颤的过程中，过去十年间，DBS 手术技术已受到广泛关注，并被研究用于治疗多种神经系统疾病^6,10,43目前，多个研究团队正在针对脑神经回路中的不同神经解剖学区域开展脑深部电刺激（DBS）研究，以应对主要的神经性疾病，这些研究处于临床试验的不同阶段。刺激丘脑底核（STN）或苍白球内侧部（GPi）已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗帕金森病的运动障碍¹⁰SANTE 临床试验表明，接受丘脑前核高频刺激的癫痫患者呈现出良好的治疗趋势³¹双侧穹窿深部脑刺激的I期临床试验结果显示，认知功能下降速度减缓，阿尔茨海默病中观察到的葡萄糖低代谢摄取现象出现逆转，同时记忆相关神经环路被激活^8,44此外，近年来神经外科医生已开展深部脑刺激（DBS）临床试验，用于治疗强迫症（OCD）、难治性抑郁症、抽动秽语综合征（Tourette syndrome）和成瘾等神经精神疾病。^10,45-55.

除了.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
深部脑刺激手术
立体定位仪	Kopf Instruments	Model 900
钻具	Dremmel	7700, 7.2 V
手术刀	BD	372610
氯胺酮	Patterson Veterinary	07-803-6637	属三级管制药品，须依照机构规定进行采购、使用和储存
赛拉嗪	Patterson Veterinary	07-808-1947
丁丙诺啡	Patterson Veterinary	07-850-2280	属三级管制药品，须依照机构规定进行采购、使用和储存
外科缝合钉	ConMed Corporation	8035
缝线（3-0）	Harvard Apparatus	72-3333
注射器（1 ml，29½ G）	BD	329464	无菌，用于腹腔注射麻醉药
注射器（3 ml，25 G）	BD	309570	无菌，用于皮下注射镇痛药
针头	BD	305761	无菌，用于清除骨孔中的碎骨片
乙醇	Fisher Scientific	S25309B	用于常规消毒
眼润滑剂	Fisher Scientific	19-898-350
刺激器	Medtronic	Model 3628
DBS电极	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100 mm	电极为铂金材质，同心圆型，双极结构
聚维酮碘（碘伏）	PDI	S23125	一次性棉签棒，用于切口前头皮消毒
脑组织解剖与海马组织分离
丙烯酸啮齿类脑组织切片模具	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
剃须刀片	V W R	55411-050
断头剪	Clauss	18039	用于断头操作，确保剪刀保持清洁并处于良好工作状态
剪刀	Codman Classic	34-4098	用于从颅骨中取出脑组织
镊子	Electron Microscopy Sciences	72957-06	用于从颅骨中取出脑组织及解剖过程中的组织操作
磷酸盐缓冲液	Boston Bioproducts	BM-220
RNA提取与cDNA制备
Trizol试剂	Sigma	T9424	操作时必须在通风橱中进行，并佩戴护目镜；避免接触皮肤
注射器（3 ml，25 G）	BD	309570	用于组织匀浆
氯仿	Fisher Scientific	BP1145-1	操作时必须在通风橱中进行，并佩戴护目镜；避免接触皮肤
异丙醇	Fisher Scientific	A416-1
糖原	Thermo Scientific	R0561
DNase I试剂盒	Ambion	AM1906
Superscript第一链合成试剂盒	Invitrogen	11904-018
台式微量离心机	Eppendorf	5415D
定量PCR
SYBR Green PCR试剂盒	Qiagen	204143
定制寡核苷酸	Invitrogen	10668051
PCR板（96孔）	Denville Scientific	C18080-10
光学密封膜	Thermo Scientific	AB1170
无核酸酶水	Thermo Scientific	SH30538-02
实时荧光定量PCR仪	Applied Biosystems	7500