考试多巴胺快速与动态快速扫描循环伏安法在口内呈味物质管理清醒大鼠

摘要

细胞外多巴胺 （DA） 的快速波动介导哺乳动物的奖励加工和动机行为。本手稿描述了快速扫描循环伏安法 （FSCV） 和口服试药给药的联合使用，以确定试药如何改变清醒、自由移动的大鼠的快速多巴胺释放。

摘要

哺乳动物大脑中快速、阶段性多巴胺 （DA） 释放在奖励处理、强化学习和动机控制中起着关键作用。快速扫描循环伏安法 （FSCV） 是一种具有高空间和时间（亚秒）分辨率的电化学技术，已被用于检查几种制备物中的阶段性 DA 释放。单细胞和脑切片的体外实验以及麻醉啮齿动物的体内实验已被用于确定在正常条件和疾病模型中介导多巴胺释放和摄取的机制。在过去的 20 年里，在清醒、自由移动的啮齿动物中进行的体内 FSCV 实验也提供了对奖励处理和奖励学习中多巴胺能机制的见解。清醒、自由移动的准备工作的一个主要优点是能够检查与特定行为事件或奖励或提示呈现时间锁定的快速 DA 波动。然而，行为和伏安法联合实验的一个局限性是难以将特定于主要奖励或厌恶刺激的 DA 效应与介导奖励导向或其他运动行为的共同发生的 DA 波动区分开来。在这里，我们描述了一种使用体内 FSCV 和清醒大鼠口服输注的组合方法，以直接研究 DA 对口服品尝剂的反应。在这些实验中，口服品尝剂直接注入大鼠的上颚 - 绕过奖励导向行为和自愿饮酒行为 - 允许直接检查 DA 对品尝刺激的反应。

引言

相位 DA 释放在调节奖励导向行为中起着重要作用 ^[1-3]。然而，分离和研究主要奖励如何改变阶段性 DA 释放通常会因同时发生的行为或认知过程而变得复杂，这些过程也能够改变阶段性 DA 释放 - 例如决策过程或奖励导向的运动行为以获得奖励。在目前的工作中，我们通过使用体内快速扫描循环伏安法 （FSCV） 结合通过口内插管进行品尝递送来分离对品尝剂的阶段性 DA 反应。这项技术绕过了选择和行动，并允许我们检查在将 tastant 直接输注到大鼠上颚期间的细胞外 DA 释放。

FSCV 是一种具有高时间和空间分辨率的电化学技术，允许在亚秒级（10 Hz 分辨率）上测量离散局部区域（约 100 μm）中的 DA 释放。口内给药和 FSCV 的结合提供了观察快速、"实时"DA 对味觉剂的反应的优势，这是使用传统微透析方法无法检查的。此外，响应奖励或奖励相关线索的阶段性 DA 释放发生在 20-100 nM 的浓度之间，高于 FSCV 的 10-20 nM 检测阈值 ^[4]。FSCV 的高空间分辨率还允许从小大脑区域的子区域进行记录，例如伏隔核 （NAc）。因此，FSCV 与口内输注品尝剂相结合是研究品尝剂或其他刺激如何改变清醒、行为良好的动物阶段性 DA 释放的理想模型。事实上，这些技术已经允许进行实验，研究有益和厌恶的味觉剂如何改变细胞外 DA 释放 ^[5]。

方案

所有的实验都是根据健康（NIH）指南实验动物的护理和使用全国学院进行，并批准了耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）。

1）预手术的准备

1. 口服溶液的制备
   1. 创建10％蔗糖和0.005％L-薄荷醇在去离子水（pH 7.4）中的溶液。在密闭容器中储存这些溶液，在室温下，并重新制作每2周，以防止降解。
2. 电极校准解决方案
   1. 使Tris缓冲液（pH7.4）中，在校准之前的任何时间。该解决方案由12.0毫摩尔Tris盐酸，140 mM氯化钠，3.25毫米氯化钾，1.20毫氯化钙，1.25毫磷酸二氢钠，1.20毫的MgCl _2，和2.00毫摩尔的Na ₂ SO _4。
   2. 创建10mM的多巴胺（DA;盐酸多巴胺）的储备溶液在0.1M高氯酸。高氯酸有助于防止多巴胺的氧化即存储此原液在-20℃，并使用时间长达6个月。使DA原液存储使用每个等分试样只有一次的几个等分试样。
   3. 从10毫米DA股票，稀释于Tris缓冲液为1微米，500纳米，250纳米，125纳米，62.5纳米，纳米31.25浓度。
   4. 对于pH校准，准备的Tris解决方案7.2，7.3，7.5，和7.6的pH缓冲剂。这将提供了模仿体内实验过程中可能发生的pH值的变化的解决方案。
3. 电极....

结果

FSCV结合口内导管植入用于研究如何蔗糖，食欲一个呈味物质，调节阶段性多巴胺释放在伏隔核。前促味剂输注，电刺激（150微安，60赫兹，24个脉冲;由红色条表示）VTA中的产生健壮增加相位DA释放在伏隔核（ 图1）图1示出一个彩色图上的潜力。 y轴，时间上的x轴，和电流（表示为伪色）上的z轴。下面的颜色情节DA浓度随时间变化的痕迹。浓度随时间的变化，使用的电流随时间跟踪在多巴胺的氧化电势来确定将其转化为浓度，继电极的后校准（通过虚线的白线表示）。该DA浓度对时间的跟踪被用作训练PCA集的一部分。

被收购的训练集后，25蔗糖输注（10％，每输注200微升）被给予每1-3分钟。阶段性DA释放的蔗糖调制的例子示于图2和3，在图2中，6.5秒输注（由红色条表示）产生的高程在电流（由白色，向下箭头表示）时的氧化电位多巴胺（由白虚线表示）。把该数据变换成浓度对时间的曲线图后的PCA证实在响应于所述促味剂的增加的电流的增加的DA浓度的结果。另一个促味剂，薄荷醇（0.005％，每输注200微升）中.......

讨论

口腔内促味剂递送结合FSCV允许“实时”DA响应口服食用香料分析。但是也有一些需要成功的DA测量在协议三个关键步骤。首先，在口服导管的适当的注入是用于递送香味剂是至关重要的。确保导管插入第一磨牙后面和楔入就位防止导管从失去通畅，并防止意外删除由动物。在恢复后最初几天冲洗导管也很重要，因为在第一2或3天给予动物软食手术后会阻塞导管。第二，电极的质量提高信噪比以可自由移动的大鼠的关键。在一些情况下，在视觉上出现电极成为高品质和良好的条件可能仍然给予噪声信号。解决此问题的一种方法是采取基线记录在Dorsal纹状体（4毫米以下硬脑膜）。如果电极产生过多的噪声，所述电极可以被删除，与进行了实验，在伏隔核记录站点（6-7毫米以下硬脑膜）之前以一个新的电极代替。第三关键步骤是寻找在目标脑区域，其中自发DA释放事件（“瞬态​​”）被以足够的频率（至少1每分钟）以足够增加多巴胺浓度（至少20纳米观察到一个合适的记录位置到40纳米）。这种优化将确保自发阶段性DA释放事件可以在特定的位置，前香料施用被检测到。降低的增量相当于暴露碳纤维（50-100微米）的尺寸的电极最大化找到一个记录站点检测瞬变的可能性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
刺激电极	塑料	MS303/2-A/SPC	订购时，要求在基座下方切割 电极
	生物分析系统	MD-2251
玻璃毛细管	A-M 系统	624503
碳纤维	Thornel	T650
电极拉拔器	Narishige International	PE-22
神经日志刺激隔离器	Digitimer Ltd.	DS4
热缩管	3M	FP-301
电极绝缘线	Squires 电子	定制	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
显微作器	伊利诺伊大学芝加哥分校，工程机械车间
环氧树脂	ITW Devcon	14250	"5 分钟环氧树脂"
全氟-3,6-二氧杂-4-甲基-7辛烯-磺酸和四氟乙烯	离子功率	LQ-1105	即Nafion
银漆	GC Electronics	22-023
电源	BK Precision	9110
管材口腔内导管	药内	427426	PE 100，内径 = 0.86 mm;外径 = 1.52 mm
口腔内输液的管材	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32";外径 3/32"
用于流通池的注射泵	Pump Systems Inc.	NE 1000
外科粘接剂	登士柏填缝	剂 675571 和 675572
空气执行器	VICI	A60	6 位数字阀接口
阀接口	VICI	DVI	230 VAC
北	卡罗来纳大学电子设施
UEI 电源	卡罗来纳大学，电子设施
UEI 分线盒	北卡罗来纳大学，电子设施
注射泵的电源	Med Associates	SG-504
注射泵	Med Associates	PHM-107
钨微电极	MicroProbes	WE30030.5A3
银线参比，带 AgCl	InVivo公制	E255A
蔗糖	Sigma	80497
氯化镁	Sigma	M8266
氯化钠	Sigma	S7653
高氯酸	Sigma	244252
盐酸 （4 M）	Sigma	54435
氢氧化钠	Sigma	306576
过氧化氢	Sigma	H1009
盐酸多巴胺	Sigma	H8502
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