高精度锌同位素测定在小鼠器官中的应用

摘要

我们介绍了在小鼠器官中高精度测定锌同位素比值的技术。

摘要

我们介绍一种高精度测定小鼠器官中锌同位素比值的方法。锌由5种稳定同位素组成（⁶⁴Zn, ⁶⁶Zn, ⁶⁷Zn, ⁶⁸Zn 和 ⁷⁰Zn），这些元素在小鼠器官中天然存在分馏现象。我们首先展示如何溶解不同器官以释放Zn原子；该步骤通过HNO₃和H₂O₂的混合液完成。₃ 和 H₂O₂然后，我们从所有其他元素中纯化锌原子，特别是去除同量异位素干扰（例如，Ni)，通过在稀 HBr/HNO₃ 中进行阴离子交换色谱分离₃ 培养基。前两步操作均在洁净实验室中使用高纯度化学试剂完成。最后，采用低分辨率多接收电感耦合等离子体质谱仪测定同位素比值。样品通过雾化室进样，并利用标准物质比值校正法（标准 Bracketing 技术）对质谱仪引起的同位素分馏进行校正。 完整的典型 该方法产生的同位素比值具有50 ppm（2倍标准偏差）的重现性。

引言

由于多接收等离子体质谱仪的发展，高精度（优于100 ppm/原子质量单位）锌稳定同位素组成的测定仅在约15年前才成为可能，此后主要应用于地球与行星科学领域。在医学领域的应用是新兴的，对于改变锌代谢的疾病（例如，阿尔茨海默病）具有作为生物标志物的巨大潜力。本文报道了一种用于精确测定小鼠多种器官中天然锌稳定同位素比值的方法，该方法同样适用于人类样本。该方法包括器官的溶解、锌与其他元素的化学分离纯化，随后在质谱仪上进行同位素比值分析。

锌同位素测量的准确性取决于化学纯化的质量（锌的纯度高、相对于样品中锌含量的空白值低、化学回收率高）以及对仪器偏差的有效控制。最终锌组分的高纯度对于消除同量异位素干扰和引起基质效应的非同量异位素干扰至关重要。同量异位核素会产生直接干扰（例如，⁶⁴Ni）。非同量异位干扰则产生所谓的“基质”效应，通过改变离子化条件而影响测量的分析精密度，这种离子化条件与作为比对基准的纯锌标准物质不同¹。低空白值（< 10 ng）表明样品未受到外来锌的污染，否则会扭曲测得的同位素组成。由于锌同位素在离子交换色谱过程中可能发生分馏²，因此必须完全收集所有锌原子，以确保不发生同位素分馏，这意味着化学处理过程应实现完全回收。最后，质谱测量过程中仪器引起的同位素分馏校正采用“标准品夹心法”进行。

因此，获得精确测量结果的主要困难在于控制外部污染（即， 低空白），实现完全产率的化学纯化，去除所有其他原子或分子，并校正质谱仪中的仪器同位素分馏效应。本文将描述我们从鼠类器官中分离锌的分析流程以及质谱测量方法。

提取过程采用微量稀释酸（HBr/HNO₃ 体系）在阴离子交换树脂的微柱（0.5 µl 和 0.1 µl）上进行。该方法回收率完全，对 ⁶⁶Zn/⁶⁴Zn 比值的测量外部重复性优于 50 ppm。该方法的另一优势是速度非常快。因此，该方法特别适用于医学科学领域，相较于地球科学（这些分析方法最初在此领域开发），医学科学通常需要分析更大量的样品。

方案

注意：涉及动物的实验程序已获得巴黎狄德罗大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 材料准备

1. 对1升酸（HNO₃、HBr）进行亚沸蒸馏，以去除其中的杂质。
2. 将烧杯和移液器吸头适配器在热的（约100 °C）浓HNO₃酸浴中浸泡至少两天进行清洗。
3. 将移液器吸头在冷的3 N HNO₃溶液中浸泡数天，然后用去离子水逐个冲洗三次。

2. 样品制备

1. 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪使小鼠麻醉。采用脚趾夹捏法评估麻醉效果。
2. 在含有肝素的1.5 ml离心管中，通过心脏穿刺采集血液。
3. 通过离心（10分钟，1,500 × g）将血浆与血细胞分离，并使用聚丙烯吸头将血浆转移至聚丙烯冻存管中。
4. 通过剪断肝静脉并经心脏注入DPBS，清除器官中的残留血液。通过颈椎脱位法确认小鼠死亡。
5. 使用无菌不锈钢器械取下器官，去除周围脂肪（如有），并在聚丙烯冻存管中迅速冷冻。

3. 化学纯化

1. 首先，将样品溶解于约 1 ml 浓（30%）H₂O₂ 和约 1 ml 浓（~15 M）HNO₃ 的混合液中。所有步骤均需在通风橱内进行。
   1. 将目标器官整体放入一个 15 ml 聚四氟乙烯（Teflon）烧杯中，然后向烧杯中加入 H₂O₂/HNO₃ 混合液⁵。保持烧杯敞口数分钟，以避免因有机物氧化反应及 CO₂ 释放导致的溅出。
   2. 最后，将烧杯置于约 100 °C 的加热板上加热数小时，直至溶液完全澄清。
2. 打开烧杯，继续在约 100 °C 的加热板上将溶液蒸干。
3. 样品干燥后，向其中加入 1 ml 1.5 N HBr；盖上烧杯并置于 100 °C 加热板上加热数小时，使其充分溶解。
4. 同时准备 500 µl 层析柱。
   1. 向层析柱中加入 500 µl AG1X8 200-400 目树脂，并将其安装在层析柱架上，下方放置废液收集烧杯。依次用 5 ml 18.2 MΩ ⋅ cm 水、5 ml 0.5 N HNO₃、5 ml 水、5 ml 0.5 N HNO₃ 和 5 ml 水交替洗涤树脂。最后用 5 ml 1.5 N HBr 对树脂进行预平衡处理。
5. 将烧杯从加热板上取下，放入超声浴中处理约 30 分钟，随后让烧杯冷却至室温。
6. 待烧杯冷却且树脂完成洗涤后，打开烧杯。将接头适配器安装至注射器上，连接移液枪头，吸取 1 ml 样品溶液，并缓慢加载至树脂柱上（避免扰动树脂床）。
7. 待全部液体流经层析柱后，加入 5 ml 1.5 N HBr。
8. 当 5 ml 1.5 N HBr 完全通过层析柱后，将下方的废液收集烧杯更换为洁净的 15 ml 烧杯。
9. 分次加入共 5 ml 0.5 N HNO₃，每次 2.5 ml。此阶段锌（Zn）将从树脂上被洗脱下来。
10. 当 5 ml HNO₃ 完全通过层析柱后，取下收集烧杯并置于 100 °C 加热板上蒸干。
11. 从柱架上取下层析柱，弃去树脂（每个样品需使用新的树脂）。
12. 样品干燥后，在更小的层析柱（100 µl）上以相同体积的酸重复上述操作流程，随后置于加热板上蒸干。样品现已准备好用于质谱分析。

4. 质谱测量

1. 使用多接收器电感耦合等离子体质谱仪（MC-ICP-MS）分析锌（Zn）同位素组成。
   1. 采用 表1 中总结的仪器参数。
2. 调整法拉第杯位置，以采集质荷比（m/z）为 ⁶²Ni、⁶³Cu、⁶⁴Zn、⁶⁵Cu、⁶⁶Zn、⁶⁷Zn 和 ⁶⁸Zn 的信号。
3. 配制含有 500 ppb Zn 的 0.1 M HNO₃ 溶液用于同位素分析。
4. 使用喷雾室结合 100 µl/min 聚四氟乙烯雾化器分析 500 ppb 的 Zn 溶液。每个样品测量 30 次扫描（1 个包含 30 个循环的区块），每次扫描的积分时间为 8.389 秒。
5. 通过从样品信号中扣除空白溶液（用于重新溶解样品的 0.1 M HNO₃ 溶液）的峰上零强度值来校正背景。
6. 通过测量 ⁶²Ni 峰的强度来控制并校正可能存在的 ⁶⁴Ni 同量异位素干扰。假设 ⁶⁴Ni/⁶²Ni 比值为自然丰度比值（0.2548），根据仪器质量歧视效应校正该比值，然后按下式从质量数 64 处扣除 ⁶⁴Ni 的贡献：
   ⁶⁴Zn_实际 = ⁶⁴Zn_实测 - ⁶⁴Ni = ⁶⁴Zn_实测 - (⁶⁴Ni/⁶²Ni)_自然 × ⁶²Ni_实测。
7. 通过在每个样品前后插入 500 ppb 的 JMC Lyon Zn 标准溶液（或其它可用标准，如 IRMM-3702）进行标准样品夹心法校正仪器质量歧视效应。具体方法为：将样品的 ⁶⁶Zn/⁶⁴Zn 比值除以该样品前后两次测得的标准溶液 ⁶⁶Zn/⁶⁴Zn 比值的平均值，减去 1，再乘以 1,000（见 公式 1）。JMC Lyon Zn 标准物质的典型外部精度为 0.05‰/amu（2 倍标准偏差，2 s.d.）。

结果

在1.5 N HBr中，主要的锌物种（ZnBr₃⁻）与阴离子交换树脂形成非常稳定的络合物，而大多数其他元素不与树脂发生相互作用。随后通过将介质转换为稀释的HNO₃来回收锌。₃，改变锌的形态为Zn²⁺ 从树脂中释放^6,7.

同位素比值通常以相对于标准的千分之一偏差表示：

其中 x = 66 或 68。所用标准物质为锌“里昂”标准 JMC 3-0749 L¹。“里昂”标准...

讨论

通过在不同分析批次中对同一样品进行重复分析，评估测量结果的可重复性。例如⁶，我们对同一种陆地岩石样品进行了7次重复分析，得到的结果如表2所示。

根据同位素分馏理论¹⁰以及迄今为止在所有已测的太阳系物质（例如， 陨石^11-13、植物^3-5、深海沉积物¹⁴、动物^15-17）中的测量结果，本研究结果符合质量依赖性规律（见图1）。δ⁶⁸Zn的值约为δ⁶⁶Zn的两倍（图1），因为⁶⁸Zn与⁶⁴Zn之间的质量差是⁶⁶Zn与⁶⁴Zn之间质量差的两倍。这表明我们的测量结果不受同量异位素干扰的影响（此类干扰会使数据偏离直线），且锌同位素来自相同的同位素储库并发生分馏。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多通道电感耦合等离子体质谱仪	Thermo-Fisher
阴离子交换树脂 AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
特氟龙烧杯	Savillex	200-015-12
自制特氟龙柱，采用可收缩特氟龙材料制成