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Summary

此稿件描述了SUMO化修饰和着丝粒蛋白，Ndc10和Ndc80的泛素化的检测，在芽殖酵母 。

Abstract

翻译后修饰（翻译后修饰），例如磷酸化，甲基化，乙酰化，泛素化，和蛋白修饰，调节许多蛋白质​​的细胞功能。与着丝粒DNA着丝粒关联的蛋白质翻译后修饰调解忠实染色体分离，以维持基因组稳定性。生物化学方法如质谱和Western blot分析最常用于识别翻译后修饰的。这里，一个蛋白质纯化方法进行说明，该技术同时SUMO化的动粒蛋白，Ndc10和Ndc80，在酿酒酵母和泛素化的检测。表达组氨酸-Flag标签SMT3（HF-SMT3）和Myc标签Ndc10或Ndc80构建并用于我们的研究的菌株。对于检测蛋白修饰，我们设计了一个协议，以亲和通过使用镍珠纯化His标签的SUMO化蛋白质并用于Western印迹分析用抗Myc抗体检测SUMO化Ndc10一个第二Ndc80。为了检测泛素化，我们设计了一个协议的Myc标签蛋白免疫沉淀和使用免疫印迹分析与抗泛素的抗体，表明Ndc10和Ndc80被泛素化。我们的结果表明，在带有His标记感兴趣的表位标记的蛋白标记的SMT3应变便于多个翻译后修饰的检测。未来的研究应该允许开发这种技术的鉴定和表征蛋白质的相互作用是依赖于特定的PTM。

Introduction

泛素化和SUMO化允许泛素和小泛素样修饰的缀合（SUMO; SMT3在酿酒酵母 ^1）到目标蛋白。着丝粒蛋白的翻译后修饰影响其细胞水平和蛋白质 – 蛋白质相互作用中不同的细胞周期阶段，以确保忠实染色体分离。例如，蜂窝Cse4 / CENP-A和外着丝粒蛋白DSN1的水平通过泛素介导的蛋白水解以确保基因组稳定性^2-5调节。不正确动粒微管附件失稳要求IPL1 /极光酶b激酶，磷酸化而与Dam1复合Ndc80直接与微管^​​6-8交互。尽管年过七旬动粒蛋白的鉴定，也有极少数的研究，调查这些蛋白质翻译后修饰用， 例如 ，泛素和SUMO的修改。一个主要的限制是为了保护PTM的能力s纯化和定制抗体的缺乏检测翻译后修饰如蛋白修饰，磷酸化，甲基化，以及其他的期间。 SUMO化着丝粒蛋白的表征Ndc10，Cep3，Bir1和Ndc80利用自定义抗体^9。此外，Ndc10已经牵涉作为底物泛素化^10。人类Hec1（Ndc80在酿酒酵母 ）也底泛素化，通过APC / C-hCdh1 E3连接酶调节^11。因此，Ndc10和Ndc80是很好的候选方案的最优化同时检测SUMO化和泛素化的S.酵母 。

为了方便SUMO化的标识，我们构建了表达HF-SMT3和Myc标签Ndc10或Ndc80株。使用表位标签（HF:的His6-标志）的背景最小化由于交叉反应性是在多克隆血清了针对一个候选蛋白质经常观察到。我们设计了一个协议，以亲和纯化HF的SMT3偶联物，然后用商业抗Flag和抗Myc抗体检测sumolyated Ndc10和Ndc80在纯化SMT3制剂的存在。对于泛素化，我们设计了一个修饰免疫协议，保留了Myc基因标记着丝粒蛋白的泛素化和进行Western blot分析与商业的抗泛素的抗体来检测Ndc10和Ndc80的泛素化。

Protocol

1.生长酵母细胞的在一个小烧瓶中接种于30ml YPD（ 表1）的酵母细胞。孵育在30℃过夜振荡培养。 在50 YPD毫升稀释细胞至0.2的光密度在600nm（OD 600 = 0.2）和孵育在30℃下振荡。 生长培养物以1.0在600nm（OD 600 = 1.0）的光密度。 离心细胞5分钟，在2000×g离心并弃去上清液。 重悬在40毫升无菌水中，并离心将细胞沉淀5分钟，在2000×g离心以洗涤细胞。弃去上清液并储存细胞沉淀在-20℃下。 2.提取的蛋白质使用Ni-NTA超流珠或悬浮细胞在0.5ml冰冷胍缓冲液（表1）为下拉测定法缓冲液A（ 表1）进行免疫沉淀。保持在冰上管在任何时候。 转移至2μm升螺丝帽筒。 加入的玻璃珠相同体积（表材料 ）。 珠击败细胞在微型珠打浆机（表材料）在室温下2分钟，然后放置在冰上2-3分钟。重复此三次。 涡旋高速在4℃下30-60分钟。检查细胞可视化在显微镜下，以确保细胞溶解。 注:裂解的细胞会出现暗鬼，缺乏边界或定义形状。最适的至少80％的细胞应被裂解。 穿刺在使用推销和地点管底部的孔中收集的15毫升锥形管中（螺丝帽要宽松）。 离心在1000×g离心1分钟，以收集裂解液。 将裂解物转移到微量离心管中。 离心机以15,000×g离心30分钟，在4℃下以收集所提取的蛋白质。 使用蛋白阿萨测量所提取的蛋白质的浓度ÿ试剂盒（表材料 ），并归一所有的提取物，以含有蛋白质的量相同。使总体积为1毫升，合适的缓冲液。 注:从50 OD 600细胞获得约5毫克总蛋白。 保存50微升（250微克蛋白质，如果从步骤2.10中提取的总蛋白为5毫克），全细胞提取物（WCE）。加入50微升2×Laemmli样品缓冲液（ 表1），并在一个热块孵育在100℃下进行3-5分钟。负载10微升进行Western印迹分析（第5节:Western blot分析）一SDS-PAGE凝胶每个样品。 3.净化HF-SMT3偶联物得到的Ni-NTA超流珠（表材料 ）所需的实验（100微升每个样品珠）通过低速离心（800-1500×g离心），持续1分钟。去除上清。 洗珠五倍用1毫升的PBS（表材料）中:反转顶过底部，直到珠悬浮，收集珠低速离心，去除上清。 暂停珠在1ml胍缓冲液（ 表1），并分装成对应于样本被处理管的数量。收集珠低速离心，去除上清。通过反向顶底以上的混合珠好。 注:通过反向顶底多珠混合很好。 至100微升的Ni-NTA超流珠:对于每个样品，（蛋白质提取步骤2.11）加950微升其余WCE的。 孵育在摇摆平台上在4℃至少4小时或过夜。 离心机在800-1500×g离心在4℃下1分钟。 节省50微升的上清液（SUP）。加入50微升2×Laemmli样品缓冲液并在一个热块孵育在100℃下进行3-5分钟。负载10微升进行Western印迹分析（第5节的SDS-PAGE凝胶每个样品:Western印迹肛门ysis）。 洗涤珠子一次用1ml胍缓冲5-10分钟在摇摆平台上。 洗涤珠粒5倍用1ml 5-10分钟破碎缓冲液（ 见表1）在摇摆平台上的。 重悬珠子在90微升2×Laemmli样品缓冲液中。 加10微升1M咪唑。 注意:咪唑有助于解离从的Ni-NTA珠的带有His标记的蛋白质，由于咪唑和珠粒间竞争相互作用。 在3-5分钟的热块孵育100℃。 旋涡，然后离心13000 XG 30秒。将上清液转移到新的管中。 负荷10-20微升的SDS-PAGE凝胶进行Western印迹分析每个样品的（第5节:Western blot分析）。 注意:10-20微升相当于0.5-1.0毫克输入的，如果5毫克WCE的被使用。 4.免疫沉淀Myc标签动粒蛋白获得抗c-Myc的琼脂糖亲和凝胶的tibody（表材料 ）所需的实验（25微升每个样品树脂）通过低速离心（800-1500×g离心）。去除上清。 用1毫升缓冲液A洗涤树脂5倍:反转顶过底，直到树脂再悬浮，收集树脂低速离心，去除上清。 暂停树脂在1ml缓冲液A和等分成对应于样本被处理管的数量。收集树脂低速离心，去除上清。 注:通过反向顶过底混合树脂很好。 添加950微升剩余WCE（来自步骤2.11:蛋白质的提取），以25微升树脂。 孵育在摇摆平台上在4℃下过夜。 离心机在800-1500×g离心在4℃下1分钟。 节省50微升的上清液（SUP）。加入50微升2×Laemmli样品缓冲液并在一个热块孵育在100℃下进行3-5分钟。罗广告10微升进行Western印迹分析的SDS-PAGE胶（第5节:Western blot分析），每个样品。 用1毫升缓冲液A洗涤树脂5倍:反转顶过底，直到树脂再悬浮，收集树脂低速离心，去除上清。 重悬在100微升SUMEB样品缓冲液（ 见表1）的树脂。 注意:SUMEB样品缓冲液含有8M尿素和1％SDS（强变性条件）。 在3-5分钟的热块孵育100℃。 旋涡，然后离心13000 XG 30秒。将上清液转移到新的管中。 负荷10-20微升的SDS-PAGE凝胶进行Western印迹分析每个样品的（第5节:Western blot分析）。 注意:10-20微升相当于0.5-1.0毫克输入的，如果5毫克WCE的被使用。 5. Western印迹分析加载蛋白提取物在4-12％Bis-Tris凝胶（表材料）和性能的ORM电泳在120伏90分钟（电泳缓冲液:表材料 ）。 从凝胶转移蛋白用传送设备硝酸纤维素膜（表材料 ）在30 V 90分钟（传输缓冲区:表材料 ）。 方框中的5％乳/ 1×TBST（ 表1）的膜1小时，在室温下进行。 孵育膜中的5％乳/ 1×TBST过夜，在4℃下一级抗体（表材料 ）。为初级抗体，可使用的稀释度1:1000（抗Flag和抗泛素抗体）或1:5000（抗Myc抗体）。 每10分钟用1×TBST洗膜3次。 孵育膜与二级抗体（表材料 ）中的5％乳/ 1×TBST 1小时，在室温下进行。使用1:5000稀释的二抗的。 每10分钟用1×TBST洗膜3次。 孵育膜ECL worki纳克溶液（表材料 ）5分钟。 暴露的膜感蓝X射线胶片（表材料 ）和使用自动显影剂（表材料 ）开发。

Representative Results

以检测的着丝粒蛋白质Ndc80和Ndc10蛋白修饰，菌株与HF-SMT3和Myc标签着丝粒蛋白（Ndc80或Ndc10）构建（ 表2），如前所述9,12。 HF-SMT3缀合物使用Ni-NTA珠的亲和纯化。纯化HF的SMT3的Western印迹分析用抗Flag抗体允许检测SUMO底物是不存在于无HF-SMT3（ 图1A和1B，左图）对照菌株的SUMO化形式。正如预期的，多种形式的SUMO基板在HF-SMT3应变进行检测。我们接下来确定是…

Discussion

表位标记，如HA，Myc基因，旗，和GST被广泛用于蛋白质的生化分析。菌株与HF-SMT3和Myc标签动粒蛋白质，如Ndc10和Ndc80的构造，有利于翻译后修饰如SUMO化和泛素化的检测。 HF-SMT3 pull down实验允许SUMO化着丝粒蛋白，Ndc10和Ndc80（ 图1）的检测。亲和纯化方案和Western印迹分析使用抗Flag抗体建立的HF-SMT3和目标蛋白质之间相互作用的特异性，因为没有在无HF-SMT3对照株检测修饰的蛋白质。使用对?…

Materials

Glass beads	BioSpec Products	11079105	0.5 mm diameter
Mini beadbeater	BioSpec Products	#693	8 cell disrupter
Ni-NTA superflow	Qiagen	30430	100 ml
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8215	1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	A7470	1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14)	Santa Cruz Biotechnology	sc-789	Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10	Covance	MMS-150P	Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody	Covance	MMS-258R	Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA934V	Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA931V	Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay	Bio-Rad	500-0116
Nitrocellulose membrane	Novex	LC2001	0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Novex	NP0321BOX	1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer	Novex	NP0002	20x
NuPAGE Transfer Buffer	Novex	NP0006-1	20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34078
10x PBS pH7.4	GIBCO	70011-044
Blue sensitive X-Ray film	Dbio	DBOF30003
Automatic developer	Kodak	M35AX-OMAT
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404	50 mg
MG-132	Selleck Chemicals	S2619	25 mg