一种可检测出芽酵母着丝粒蛋白 Ndc10 和 Ndc80 发生 SUMO 化与泛素化修饰的蛋白质纯化技术

摘要

本文描述了在芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中着丝粒动粒蛋白Ndc10和Ndc80的SUMO化修饰与泛素化修饰的检测方法。

摘要

翻译后内容：蛋白质翻译后修饰（PTMs），如磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化和SUMO化，调控多种蛋白质的细胞功能。与着丝粒DNA结合的动粒蛋白的PTMs介导染色体的准确分离，从而维持基因组稳定性。目前最常用的PTMs鉴定方法包括质谱分析和蛋白质印迹（Western blot）分析。本文描述了一种蛋白质纯化方法，可用于检测酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中动粒蛋白Ndc10和Ndc80的SUMO化和泛素化修饰。我们构建并使用了一种表达聚组氨酸-Flag标签Smt3（HF-Smt3）以及Myc标签Ndc10或Ndc80的菌株进行研究。为检测SUMO化，我们设计了一种利用镍柱亲和纯化His标签SUMO化蛋白的方案，并通过抗Myc抗体进行蛋白质印迹分析，以检测SUMO化的Ndc10和Ndc80。为检测泛素化，我们设计了Myc标签蛋白的免疫共沉淀方案，并使用抗泛素抗体进行蛋白质印迹分析，证明Ndc10和Ndc80存在泛素化修饰。我们的结果表明，在表达His-Flag标签Smt3的菌株中，目标蛋白的表位标签有助于多种PTMs的检测。未来的研究可利用该技术鉴定和表征依赖于特定PTM的蛋白质相互作用。

引言

泛素化和类泛素化分别介导泛素以及类泛素小蛋白（SUMO；在S. cerevisiae中为Smt3¹）与靶蛋白的共价连接。着丝粒动粒蛋白的翻译后修饰（PTMs）可影响其在细胞周期不同阶段的细胞内水平及蛋白-蛋白相互作用，从而确保染色体的准确分离。例如，Cse4/CENP-A和外层动粒蛋白Dsn1的细胞内水平通过泛素介导的蛋白降解途径进行调控，以维持基因组稳定性^2-5。错误的动粒-微管连接的去稳定化依赖于Ipl1/Aurora B激酶，该激酶可磷酸化直接与微管相互作用的Dam1和Ndc80复合物^6-8。尽管已鉴定出七十多种动粒蛋白，但针对这些蛋白的翻译后修饰（如泛素化和SUMO化）的研究仍极为有限。e.g.，泛素和SUMO。主要限制因素包括在纯化过程中难以保持PTMs的完整性，以及缺乏可用于检测如类泛素化、磷酸化、甲基化等PTMs的特异性抗体。对类泛素化修饰的动粒蛋白Ndc10、Cep3、Bir1和Ndc80的表征曾使用了定制抗体⁹。此外，Ndc10也被证实是泛素化的底物¹⁰。人源Hec1（即S. cerevisiae中的Ndc80）同样是泛素化的底物，其修饰由APC/C-hCdh1 E3连接酶调控¹¹。因此，Ndc10和Ndc80是优化在S. cerevisiae中同时检测类泛素化和泛素化实验方案的理想候选蛋白。

为了便于鉴定SUMO化修饰，我们构建了表达HF-Smt3以及Myc标签Ndc10或Ndc80的菌株。使用表位标签（HF：His6-Flag）可最大限度地减少由于多克隆抗血清针对候选蛋白时常见的交叉反应所导致的背景信号。我们设计了一种方案，通过亲和纯化HF-Smt3缀合物，随后使用商用抗Flag和抗Myc抗体，在纯化的Smt3样品中检测Ndc10和Ndc80的SUMO化修饰。对于泛素化修饰，我们设计了一种改良的免疫沉淀方案，以保持Myc标签着丝粒蛋白的泛素化状态，并使用商用抗Ub抗体进行蛋白质印迹分析，以检测Ndc10和Ndc80的泛素化修饰。

方案

1. 酵母细胞的培养

1. 在小型烧瓶中，将酵母细胞接种于 30 ml YPD 培养基（表 1）中，于 30 °C 摇床培养过夜。
2. 将细胞用 50 ml YPD 培养基稀释至 600 nm 处的光密度为 0.2（OD₆₀₀ = 0.2），于 30 °C 摇床培养。
3. 继续培养至细胞在 600 nm 处的光密度达到 1.0（OD₆₀₀ = 1.0）。
4. 将细胞以 2,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
5. 用 40 ml 无菌水重悬细胞沉淀，以 2,000 × g 离心 5 分钟以洗涤细胞。弃去上清液，将细胞沉淀于 -20 °C 保存。

2. 蛋白质提取

1. 使用冰上预冷的胍缓冲液（0.5 ml，见表1）重悬细胞，用于Ni-NTA superflow磁珠的pull-down实验；或使用缓冲液A（见表1）进行免疫沉淀实验。操作过程中始终将离心管置于冰上。
2. 转移至2 ml螺口管中。
3. 加入等体积的玻璃珠（见材料表）。
4. 在微型珠磨仪（见材料表）中室温珠磨细胞2分钟，随后置于冰上2–3分钟。重复此步骤三次。
5. 在4 °C下高速涡旋振荡30–60分钟。通过显微镜观察细胞裂解情况，确保细胞已充分裂解。
   注意：裂解后的细胞呈现为暗色“鬼影”状，无完整边界或明确形态。理想情况下，至少应有80%的细胞被裂解。
6. 用图钉在管底打孔，并将该管放入15 ml锥形收集管中（螺帽应保持松动）。
7. 以1,000 × g离心1分钟，收集裂解液。
8. 将裂解液转移至微量离心管中。
9. 在4 °C下以15,000 × g离心30分钟，收集提取的蛋白质。
10. 使用蛋白定量试剂盒（见材料表）测定提取蛋白的浓度，并将所有样品调整至相同蛋白含量。用适当缓冲液补足总体积至1 ml。
    注意：从50 OD₆₀₀的细胞中通常可获得约5 mg总蛋白。
11. 保留50 µl（若步骤2.10中提取的总蛋白为5 mg，则含约250 µg蛋白）作为全细胞提取物（WCE）。加入50 µl 2× Laemmli上样缓冲液（表1），在金属浴中100 °C孵育3–5分钟。每样取10 µl上样于SDS-PAGE凝胶，进行Western Blot分析（第5节：Western blot分析）。

3. HF-Smt3 缀合物的纯化

1. 获取 Ni-NTA Superflow 珠（见表） 材料通过低速离心（800–1,500 × g，1 分钟）收集实验所需量的珠子（每份样品 100 µl）。移除上清液。
2. 用1 ml PBS（材料表）洗涤磁珠5次：将管子上下颠倒直至磁珠重新悬浮，低速离心收集磁珠，并移除上清液。
3. 将珠子悬浮于 1 ml 胍缓冲液中（表1) 并分装至与待处理样本数量相对应的离心管中。低速离心收集磁珠，弃上清液。通过倒置混匀磁珠。
   注意：通过上下颠倒充分混匀珠子。
4. 每个样品中，将950 µl剩余的WCE（来自步骤2.11：蛋白质提取）加入100 µl Ni-NTA superflow beads中。
5. 在4 °C下于摇床上孵育至少4小时或过夜。
6. 在 4 °C 条件下以 800-1,500 × g 离心 1 分钟。
7. 保留50 µl上清液（SUP）。加入50 µl 2x Laemmli上样缓冲液，于加热块中100 °C孵育3–5分钟。每种样品取10 µl上样至SDS-PAGE凝胶，用于Western Blot分析（第5节：Western blot分析）。
8. 用1 ml胍缓冲液在摇床上洗涤磁珠一次，5-10分钟。
9. 用 1 ml 裂解缓冲液洗涤珠子 5 次（表1在摇床上孵育 5-10 分钟。
10. 将珠子重悬于90 µl的2x Laemmli样品缓冲液中。
11. 加入10 µl的1 M咪唑。
    注意：咪唑可通过与Ni-NTA磁珠竞争性结合，帮助解离His标签蛋白与磁珠之间的相互作用。
12. 在加热块中于 100 °C 孵育 3-5 分钟。
13. 涡旋，然后在13,000 × g离心30秒。将上清液转移至新管中。
14. 将每份样品取 10–20 µl 加样至 SDS-PAGE 凝胶中，用于 Western Blot 分析（第 5 节：Western blot 分析）。
    注意：如果使用5 mg全细胞提取物（WCE），则10–20 µl对应0.5–1.0 mg的上样量。

4. Myc标签着丝粒蛋白的免疫沉淀

1. 获取抗c-Myc琼脂糖亲和凝胶抗体（见表） 材料通过低速离心（800–1,500 × g）收集实验所需树脂（每份样品25 µl）。弃去上清液。
2. 用1 ml缓冲液A洗涤树脂5次：上下颠倒混匀直至树脂重悬，低速离心收集树脂，并移除上清液。
3. 将树脂悬浮于1 ml缓冲液A中，并分装至与待处理样本数量相对应的离心管中。低速离心收集树脂，弃去上清液。
   注意：通过上下颠倒充分混匀树脂。
4. 将950 µl剩余的WCE（来自步骤2.11：蛋白质提取）加入25 µl树脂中。
5. 在4 °C下于摇床中孵育过夜。
6. 在 4 °C 条件下，以 800-1,500 × g 离心 1 分钟。
7. 保留50 µl上清液（SUP）。加入50 µl 2× Laemmli上样缓冲液，置于金属浴中100 °C孵育3–5 min。每种样品取10 µl上样至SDS-PAGE凝胶，用于Western Blot分析（第5节：Western blot分析）。
8. 用1 ml缓冲液A洗涤树脂5次：颠倒混匀至树脂重悬，低速离心收集树脂，弃上清液。
9. 将树脂重悬于 100 µl SUMEB 样品缓冲液中表1).
   注意：SUMEB 样品缓冲液含有 8 M 尿素和 1% SDS（强变性条件）。
10. 在加热块中于100 °C孵育3-5分钟。
11. 涡旋混匀，然后在13,000 × g离心30秒。将上清液转移至新管中。
12. 将每份样品取 10–20 µl 加样至 SDS-PAGE 凝胶中，用于 Western Blot 分析（第 5 节：Western blot 分析）。
    注意：如果使用5 mg全细胞提取物（WCE），则10-20 µl对应0.5-1.0 mg的上样量。

5. 蛋白质印迹分析

1. 将蛋白质提取物上样至4-12% Bis-Tris凝胶（材料表）中，在120 V电压下电泳90分钟（运行缓冲液：材料表） 材料).
2. 将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜（见表 材料) 使用转移装置在30 V电压下转移90分钟（转移缓冲液：见表格） 材料).
3. 用5%脱脂牛奶/1x TBST封闭膜表1室温下孵育1小时。
4. 用一抗孵育膜（见下表） 材料在含5%脱脂奶粉的1×TBST中4 °C过夜孵育。一抗稀释比例为：抗Flag抗体和抗Ub抗体1:1,000，抗Myc抗体1:5,000。
5. 用1×TBST缓冲液洗涤膜，每次10分钟，共洗3次。
6. 用二抗孵育膜（见下表） 材料在室温下用5%脱脂牛奶/TBST溶液封闭1小时。二抗使用1:5,000稀释度。
7. 用1×TBST缓冲液洗涤膜，每次10分钟，共洗3次。
8. 用 ECL 工作液孵育膜（见表） 材料5 分钟
9. 将膜暴露于对蓝光敏感的X射线胶片（见表 材料）并使用自动显影仪（见表 材料).

结果

为了检测着丝粒蛋白 Ndc80 和 Ndc10 的 SUMO 化修饰，构建了表达 HF-Smt3 和 Myc 标签标记的着丝粒蛋白（Ndc80 或 Ndc10）的菌株（表 2），方法如前所述^9,12。使用 Ni-NTA 琼脂糖珠对 HF-Smt3 偶联物进行亲和纯化。利用抗 Flag 抗体对纯化的 HF-Smt3 进行蛋白质印迹分析，可检测到 SUMO 底物的 SUMO 化形式，而在未表达 HF-Smt3 的对照菌株中则未检测到该信号（图 1A 和 1B，左图）。与预期一致，在表达 HF-Smt3 的菌株中检测到多种 SUMO 修饰的底物条带。接下来，我们通过抗 Myc 抗体进行蛋白质印迹分析，以确定纯化的 HF-Smt3 偶联物中是否含有 Ndc80 和 Ndc10。结果显示，存在多个分子量高于 Ndc80 或 Ndc10 单体的条带（图 1A 和 1B，右图）。此外，在经诺考达唑处理的细胞中，Ndc80 和 Ndc10 的多条带信号均有所减弱（...

讨论

HA、Myc、Flag 和 GST 等表位标签被广泛用于蛋白质的生物化学分析。构建表达 HF-Smt3 与 Myc 标签标记的动粒蛋白（如 Ndc10 和 Ndc80）的菌株，有助于检测翻译后修饰（PTMs），例如类泛素化（sumoylation）和泛素化（ubiquitination）。通过 HF-Smt3 下拉实验可检测到类泛素化的动粒蛋白 Ndc10 和 Ndc80（图 1）。利用抗 Flag 抗体进行亲和纯化和蛋白质印迹分析，可验证 HF-Smt3 与靶蛋白之间的特异性相互作用，因为在不含 HF-Smt3 的对照菌株中未检测到修饰蛋白。在蛋白底物上使用 Myc 标签可进一步验证 HF-Smt3 共价结合物中存在类泛素化的 Ndc10 和 Ndc80。此外，在经诺考达唑（nocodazole）处理的细胞中，Ndc10 和 Ndc80 的类泛素化水平均有所降低（图 1C 和 图 1D）。Montpetit 等⁹ 之前曾报道，诺考达唑处理仅导致 Ndc10 的类泛素化减少，而 Ndc80 无此变...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃珠	BioSpec Products	11079105	0.5 mm 直径
微型珠磨机	BioSpec Products	#693	8 孔细胞破碎仪
Ni-NTA superflow	Qiagen	30430	100 ml
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8215	1 ml
兔源抗 c-Myc 琼脂糖亲和凝胶抗体	Sigma-Aldrich	A7470	1 ml
鼠源单克隆抗 Flag M2 抗体	Sigma-Aldrich	F1804	一抗，稀释比例 1:1,000
c-Myc 抗体 (A-14)	Santa Cruz Biotechnology	sc-789	一抗，稀释比例 1:5,000
纯化鼠单克隆抗体 9E10	Covance	MMS-150P	一抗，稀释比例 1:5,000
泛素 (P4G7) 单克隆抗体	Covance	MMS-258R	一抗，稀释比例 1:1,000
ECL 兔 IgG HRP 标记全抗体	GE Healthcare Life Sciences	NA934V	二抗，稀释比例 1:5,000
ECL 小鼠 IgG HRP 标记全抗体	GE Healthcare Life Sciences	NA931V	二抗，稀释比例 1:5,000
DC 蛋白检测试剂盒	Bio-Rad	500-0116
硝酸纤维素膜	Novex	LC2001	0.45 mm 孔径
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶	Novex	NP0321BOX	1.0 mm，10 孔
NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液	Novex	NP0002	20x
NuPAGE 转膜缓冲液	Novex	NP0006-1	20x
SuperSignal West Pico 化学发光底物	Thermo Scientific	34078
10x PBS pH 7.4	GIBCO	70011-044
蓝色敏感 X 射线胶片	Dbio	DBOF30003
自动显影机	Kodak	M35AX-OMAT
诺考达唑	Sigma-Aldrich	M1404	50 mg
MG-132	Selleck Chemicals	S2619	25 mg