成熟的脂肪细胞可能通过去分化成为干细胞的丰富来源，从而产生一群均一的成纤维细胞样细胞。使用胶原酶消化法从人体脂肪中分离成熟的脂肪细胞。本实验方案的目标是从人成熟脂肪细胞中获得具有多向分化潜能的去分化脂肪细胞。
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摘要
摘要
成熟脂肪细胞已被证明可将其表型逆转为成纤维细胞样细胞 体外 通过一种称为顶壁培养的技术。此外，也可从新鲜脂肪组织中分离成熟脂肪细胞，用于特定脂肪库的功能及代谢特性分析。本文介绍了一种经充分验证的、通过胶原酶消化法从脂肪组织中分离成熟脂肪细胞的实验方案，以及后续进行顶壁培养的步骤。简言之，将脂肪组织置于含有胶原酶的克雷布斯-林格-亨瑟莱特缓冲液中孵育，以降解组织基质。成熟的脂肪细胞因漂浮而聚集于缓冲液表层，可由此收集。将分离的成熟细胞接种于完全充满培养基的T25培养瓶中，并倒置培养一周。另一种采用6孔板的培养方法可用于分析脂肪细胞去分化过程中的特性变化。在培养过程中，脂肪细胞形态随时间发生显著改变。如FABP4免疫荧光染色所示，可在6孔板中培养的细胞爬片上便捷地进行免疫荧光检测。FABP4蛋白存在于成熟脂肪细胞中，但在脂肪细胞去分化过程中表达下调。成熟脂肪细胞的去分化可能为细胞治疗与组织工程提供新的研究方向。
引言
体外 通过一种称为顶壁培养的技术可实现成熟脂肪细胞的去分化1由于成熟脂肪细胞在水溶液中具有天然的漂浮倾向，因此将分离的成熟脂肪细胞接种于完全充满培养基的倒置培养瓶中时，细胞会附着在液面处。经过数天培养，细胞的球形形态逐渐改变，转变为成纤维细胞样细胞。这些获得的细胞被称为去分化脂肪细胞（dedifferentiated fat cells, DFAT细胞），具有多向分化潜能。2关于脂肪细胞去分化（dedifferentiation）的研究文章，尤其是涉及人类细胞的研究仍较为有限。然而，这些研究已提供了有关DFAT细胞多向分化潜能、细胞表型及增殖能力的有趣信息。2来自不同脂肪区室的成熟脂肪细胞已被成功去分化，包括源自人体内脏和皮下脂肪组织的脂肪细胞2-4除了这些脂肪库外，Kishimoto 及其合作者还采集了颊脂垫中的脂肪组织，并将脂肪细胞去分化为 DFAT 细胞5Matsumoto 及其合作者成功地从不同年龄段的患者中生成了皮下 DFAT 细胞，大多数细胞具有较高的增殖率，即使在体外培养传代 10 次后，衰老细胞比例仍低于 6%2.
DFAT 细胞已成功地被再分化为多种谱系，包括脂肪生成、成骨、软骨生成和神经生成谱系2,3,6。这些细胞表达多种胚胎干细胞标志物，如 Nanog 以及四种已知的多能性因子 Oct4、c-myc、Klf4 和 Sox23。它们还表达特异性针对三个胚层的标志物7。此外，基于表观遗传特征，DFAT 细胞与骨髓来源的间充质干细胞（BM-derived MSC）具有相似性3。利用 DFAT 细胞的干细胞潜能，许多研究团队已探索其在治疗或改善多种疾病方面的潜力8,9。在大鼠疾病模型中，通过注射 DFAT 细胞已观察到梗死心肌组织、脊髓损伤和尿道括约肌功能障碍等病理状况的改善10-12。
除了DFAT细胞的干细胞特性外，它们还可能为脂肪细胞生理学研究提供一种新的细胞模型。3T3-L1细胞系常被用于此类研究，因为这些细胞在脂肪生成刺激下可分化为贴壁的、储存脂质的脂肪细胞13。然而，这些细胞来源于小鼠胚胎组织13。此外，该模型无法研究脂肪组织部位特异性，且可能不能完全反映人类脂肪细胞的生理特性14。其他实验室使用从小鼠脂肪库中分离的脂肪细胞进行研究，但小鼠的脂肪分布并不存在两性差异，且啮齿类动物腹腔的解剖结构限制了其研究结果向人类的直接外推15。为了在人类肥胖症的病理生理背景下研究脂肪细胞，考虑体脂分布及不同脂肪库之间的特异性差异已变得至关重要16。原代前脂肪细胞培养存在一些局限性，包括从脂肪组织活检样本中获得的细胞数量有限，以及在体外传代数次后出现的细胞衰老现象，这些因素促使人们寻求替代模型。Perrini及其合作者研究了来源于内脏脂肪和皮下脂肪的DFAT细胞在基因表达上的部位特异性，并将其与来自相同脂肪库的脂肪源性干细胞（ASC）进行了比较。他们发现，基因表达和功能的差异主要存在于不同脂肪库之间，而非不同细胞类型之间，这表明DFAT细胞在生理上与来自相同脂肪库的ASC较为接近。因此，DFAT细胞可能成为研究人类肥胖症病理生理过程中脂肪分布问题的一个有价值的替代模型。此外，顶壁培养法是一种有前景的获取成体干细胞用于组织工程的方法。
本文介绍了胶原酶消化法，这是一种广泛用于从皮下和/或内脏脂肪样本中分离成熟脂肪细胞的常用技术17，以及后续进行顶壁培养并将这些细胞去分化为具有多能性的成纤维细胞样细胞的步骤。
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方案
伦理声明：本项目在招募患者前已获得IUCPQ研究伦理委员会的批准。为撰写本文/制作本视频，我们获取了两位患者的组织样本：1）一位62岁、体重指数（BMI）为50.7 kg/m2的男性患者；2）一位35岁、体重指数（BMI）为57 kg/m2的女性患者。实验可使用两种脂肪组织隔室进行，但本视频中仅限于一种脂肪组织隔室。视频中的技术操作使用患者1的样本完成，而FABP4免疫荧光实验则使用患者2来源的去分化细胞进行。
1. 样品处理
- 请外科医生在腹腔镜减重手术期间采集网膜脂肪和皮下脂肪组织。
- 迅速将脂肪样本在室温下运送至实验室，并立即进行处理。
- 在实验室非无菌环境中进行消化。细胞最终将转移至培养室并在无菌条件下培养。为避免污染，使用蒸馏并过滤的水配制KRH缓冲液，并在消化前经0.22 µm滤膜过滤。在将试管转移至细胞培养超净台用于培养瓶和培养板准备前，需用乙醇彻底清洗。
- 将脂肪组织置于预先称重的培养皿中并记录重量。取每份组织样本的一小块（小于1 cm2），在室温下用10%福尔马林缓冲液固定至少24小时，随后进行石蜡包埋。该包埋样本用于免疫组织化学实验（技术未展示）。
- 另取一块组织放入50 ml离心管中，液氮速冻后于-80 °C保存，用于后续对完整脂肪组织的进一步研究（例如， 基因表达——技术未展示）。
2. 胶原酶消化
- 将剩余的脂肪组织块放入50 ml离心管中用于消化。
- 在消化管中，每克样品加入4 ml含有胶原酶（350 U/ml）的KRH-WB溶液。
- 用剪刀剪碎脂肪组织。
- 将剪碎的脂肪组织悬液置于摇床中，在37 °C、最大90 rpm条件下孵育45分钟（最长不超过1小时）。
3. 脂肪细胞和前脂肪细胞的纯化
- 将含有少量脂肪块的透明溶液通过400 µM尼龙滤网倒入塑料烧杯中。
- 用镊子在尼龙滤网上轻轻揉搓细胞样品，并用5 ml KRH-WB冲洗。
- 用塑料导管（连接于60 cc注射器末端）小心地将滤过的细胞悬液转移至50 ml离心管中。
- 让成熟脂肪细胞悬液静置约10分钟，使细胞通过漂浮上行至缓冲液顶部。
- 使用60 cc注射器缓慢吸除管底的缓冲液。
- 加入20 ml KRH-WB进行洗涤。重复步骤3.4，再进行两次洗涤。
- 收集缓冲液，将脂肪细胞悬液调整至最终体积5或10 ml（根据细胞数量而定）。随后进行第5节中的步骤。
- 如需进一步进行原代细胞培养，可通过离心（3,000 rpm，室温，5分钟）从60 cc注射器收集的缓冲液中回收基质-血管组分（该技术未展示）。
4. 成熟脂肪细胞计数
- 取10 µl轻轻振荡混匀的脂肪细胞悬液，加入计数室（血细胞计数板）中。进行四次重复计数。
- 计算分离得到的成熟细胞数量。
5. 成熟脂肪细胞去分化至T-25培养瓶
- 填充一个25 cm2 组织培养瓶到 ¾ 体积的DMEM/F12-20%胎牛血清。
- 根据细胞计数，将500,000个成熟细胞加入培养瓶中。
- 使用50 ml管将培养基完全充满烧瓶，并尽可能去除气泡。
- 将无通气孔的瓶盖拧紧在烧瓶上。
- 在孵育前用乙醇清洁烧瓶，以避免污染。
- 将培养瓶倒置孵育一周，期间不要触碰，以避免培养物移动而影响细胞贴壁。
- 在倒置培养7天后翻转培养瓶之前，轻柔地晃动培养瓶，通过抽吸方式移除瓶内所有培养基，避免突然的移动。
- 加入12 ml DMEM-F12-20%胎牛血清，采用标准技术培养细胞。可在培养瓶上加装带滤膜的通气盖。
6. 成熟脂肪细胞去分化至6孔板
- 在6孔板每个孔的底部放置一个盖玻片
- 在每个盖玻片上方放置一个½英寸的塑料衬套
- 向孔中加入8 ml含20%胎牛血清的DMEM培养基
- 在每个塑料衬套上再放置一个盖玻片
- 将移液器吸头插入载玻片与管壁之间，将细胞注入载玻片下方（每孔50,000个细胞）
- 将培养板置于标准细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下培养一周
- 将带有贴壁细胞的盖玻片翻转，放入含有2 ml添加20%胎牛血清的培养基的孔中继续培养
- 利用正在进行去分化过程的细胞盖玻片进行多种实验，包括免疫荧光分析（该技术未展示）
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结果
在去分化过程中，成熟的脂肪细胞会发生显著的形态学变化（图1）。如图2所示，对正在进行去分化的细胞使用抗FABP4抗体进行荧光分析染色。具有圆形形态的细胞表达FABP4蛋白，而大多数成纤维细胞样细胞则不表达。去分化完成后，DFAT细胞可通过标准培养程序进行多代培养。我们已成功将人网膜和皮下DFAT细胞系传代超过15代（数据未显示）。
图1. 成熟脂肪细胞在培养过程中随时间去分化时的形态学变化：（A）培养4天时，（B）培养7天时，以及（C）培养12天时。图像在孵育期间的不同时间点使用相差显微镜拍摄。
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讨论
采用顶壁培养技术使成熟脂肪细胞去分化，是一种从小量原代脂肪组织样本中获取脂肪源性干细胞的新方法。根据我们及他人的经验2，仅需1克组织即可接种一个25 cm2的培养瓶，并获得一群已被Poloni及其合作者3证实具有同质性的DFAT细胞。脂肪细胞的去分化似乎可在来自任何供体的细胞中实现，不受其年龄、性别及其他特征的影响。在所获得的DFAT细胞群体中，仍存在少量呈圆形或部分伸长形态、未完全去分化的细胞。这些细胞通常在传代培养过程中被弃去，因其会在胰酶-培养基混合液中漂浮。
这些细胞的多向分化潜能已得到证实，并支持其在细胞治疗中的应用2,3。已有报道表明它们具有较高的增殖能力，这对于干细胞应用中的细胞培养而言是一个重要优势2。针对人源DFAT细胞的研究显示，基于其复制能力和分化潜能，它们可能比来自同一供体的ASC更具效率18。最近的一项病例研究支持这一观点，发现DFAT细胞向脂肪细胞和成骨细胞分化的效率更高，且端粒酶水平高于来自同一位患有肥胖症和糖尿病供体的A...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（371697-2011，AT）资助。作者谨此感谢减重外科医生 S. Biron 博士、F-S. Hould 博士、S. Lebel 博士、O. Lescelleur 博士、P. Marceau 博士，以及来自 IUCPQ 组织库的 Christine Racine 和 Caroline Gagnon 提供的帮助。我们感谢 IUCPQ 音视频服务部的 Jacques Cadorette 先生在视频拍摄与编辑方面的工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7906 | |
| 腺苷 | Sigma | A4036 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A0278 | |
| NaCl | 可使用任意品牌 | ||
| KCl | 可使用任意品牌 | ||
| CaCl2 | 可使用任意品牌 | ||
| MgCl2 | 可使用任意品牌 | ||
| KH2PO4 | 可使用任意品牌 | ||
| HEPES | 可使用任意品牌 | ||
| 葡萄糖 | 可使用任意品牌 | ||
| I型胶原酶 | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12，含HEPES，不含酚红 | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | 向培养基中添加：20% 小牛血清、庆大霉素（50 µg/ml）和两性霉素B（2.5 µg/ml） |
| 铁强化小牛血清，来自配方喂养的小牛 | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 英寸塑料衬套 | Iberville | 2704-CP | 货号：1000120918（Home Depot） |
| 液氮 | Linde | ||
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | SIGMA | HT501128 | |
| 无菌镊子 | |||
| 无菌剪刀 | |||
| 60 cc 注射器 | BD Syringe | ||
| 塑料导管 | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit 储存缓冲液（KRH） | 按以下方法配制储存缓冲液：25 mM HEPES（pH 7.6）、125 mM NaCl、3.73 mM KCl、5 mM CaCl2·2H2O、2.5 mM MgCl2·6H2O、1 mM K2HPO4。调节pH至7.4。 | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit 工作缓冲液（KRH-WB） | 将以下组分新鲜加入KRH缓冲液中：4% 牛血清白蛋白、5 mM 葡萄糖、0.1 µM 腺苷、560 µM 抗坏血酸 | ||
| 添加I型胶原酶的KRH-WB缓冲液 | 加入350 U/ml的I型胶原酶 | ||
| T25 无通气盖组织培养瓶 | Sarstedt 或其他品牌 | ||
| 6孔组织培养板 | BD Falcon 或其他品牌 | ||
| 显微镜盖玻片 22×22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| 无菌烧杯 |
参考文献
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892(2013).
- Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
- Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
- Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
- Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
- Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
- Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
- Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
- Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
- Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
- Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
- Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).
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