成熟的脂肪细胞可能通过去分化成为干细胞的丰富来源，从而产生一群均一的成纤维细胞样细胞。使用胶原酶消化法从人体脂肪中分离成熟的脂肪细胞。本实验方案的目标是从人成熟脂肪细胞中获得具有多向分化潜能的去分化脂肪细胞。
本文内容
摘要
摘要
成熟脂肪细胞已被证明可将其表型逆转为成纤维细胞样细胞 体外 通过一种称为顶壁培养的技术。此外，也可从新鲜脂肪组织中分离成熟脂肪细胞，用于特定脂肪库的功能及代谢特性分析。本文介绍了一种经充分验证的、通过胶原酶消化法从脂肪组织中分离成熟脂肪细胞的实验方案，以及后续进行顶壁培养的步骤。简言之，将脂肪组织置于含有胶原酶的克雷布斯-林格-亨瑟莱特缓冲液中孵育，以降解组织基质。成熟的脂肪细胞因漂浮而聚集于缓冲液表层，可由此收集。将分离的成熟细胞接种于完全充满培养基的T25培养瓶中，并倒置培养一周。另一种采用6孔板的培养方法可用于分析脂肪细胞去分化过程中的特性变化。在培养过程中，脂肪细胞形态随时间发生显著改变。如FABP4免疫荧光染色所示，可在6孔板中培养的细胞爬片上便捷地进行免疫荧光检测。FABP4蛋白存在于成熟脂肪细胞中，但在脂肪细胞去分化过程中表达下调。成熟脂肪细胞的去分化可能为细胞治疗与组织工程提供新的研究方向。
引言
体外 通过一种称为顶壁培养的技术可实现成熟脂肪细胞的去分化1由于成熟脂肪细胞在水溶液中具有天然的漂浮倾向，因此将分离的成熟脂肪细胞接种于完全充满培养基的倒置培养瓶中时，细胞会附着在液面处。经过数天培养，细胞的球形形态逐渐改变，转变为成纤维细胞样细胞。这些获得的细胞被称为去分化脂肪细胞（dedifferentiated fat cells, DFAT细胞），具有多向分化潜能。2关于脂肪细胞去分化（dedifferentiation）的研究文章，尤其是涉及人类细胞的研究仍较为有限。然而，这些研究已提供了有关DFAT细胞多向分化潜能、细胞表型及增殖能力的有趣信息。2来自不同脂肪区室的成熟脂肪细胞已被成功去分化，包括源自人体内脏和皮下脂肪组织的脂肪细胞2-4除了这些脂肪库外，Kishimoto 及其合作者还采集了颊脂垫中的脂肪组织，并将脂肪细胞去分化为 DFAT 细胞5Matsumoto 及其合作者成功地从不同年龄段的患者中生成了皮下 DFAT 细胞，大多数细胞具有较高的增殖率，即使在体外培养传代 10 次后，衰老细胞比例仍低于 6%2.
DFAT 细胞已成功地被再分化为多种谱系，包括脂肪生成、成骨、软骨生成和神经生成谱系2,3,6。这些细胞表达多种胚胎干细胞标志物，如 Nanog 以及四种已知的多能性因子 Oct....
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方案
伦理声明：本项目在招募患者前已获得IUCPQ研究伦理委员会的批准。为撰写本文/制作本视频，我们获取了两位患者的组织样本：1）一位62岁、体重指数（BMI）为50.7 kg/m2的男性患者；2）一位35岁、体重指数（BMI）为57 kg/m2的女性患者。实验可使用两种脂肪组织隔室进行，但本视频中仅限于一种脂肪组织隔室。视频中的技术操作使用患者1的样本完成，而FABP4免疫荧光实验则使用患者2来源的去分化细胞进行。
1. 样品处理
- 请外科医生在腹腔镜减重手术期间采集网膜脂肪和皮下脂肪组织。
- 迅速将脂肪样本在室温下运送至实验室，并立即进行处理。
- 在实验室非无菌环境中进行消化。细胞最终将转移至培养室并在无菌条件下培养。为避免污染，使用蒸馏并过滤的水配制KRH缓冲液，并在消化前经0.22 µm滤膜过滤。在将试管转移至细胞培养超净台用于培养瓶和培养板准备前，需用乙醇彻底清洗。
- 将脂肪组织置于预先称重的培养皿中并记录重量。取每份组织样本的一小块（小于1 cm2），在室温下用10%福尔马林缓冲液固定至少24小时，随后进行石蜡包埋。该包埋样本用于免疫组织化学实验（技术未展示）。
- 另取一块组织放入50 ml离心管中，液氮速冻后于-80 °C保存，用于后续对完整脂肪组织的进一步研究（例如， 基因表达——....
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结果
在去分化过程中，成熟的脂肪细胞会发生显著的形态学变化（图1）。如图2所示，对正在进行去分化的细胞使用抗FABP4抗体进行荧光分析染色。具有圆形形态的细胞表达FABP4蛋白，而大多数成纤维细胞样细胞则不表达。去分化完成后，DFAT细胞可通过标准培养程序进行多代培养。我们已成功将人网膜和皮下DFAT细胞系传代超过15代（数据未显示）。
图1. 成熟脂肪细胞在培养过程中随时间去分化时的形态学变化：（A）培养4天时，（B）培养7天时，以及（C）培养12天时。图像在孵育期间的不同时间点使用相差显微镜拍摄。
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讨论
采用顶壁培养技术使成熟脂肪细胞去分化，是一种从小量原代脂肪组织样本中获取脂肪源性干细胞的新方法。根据我们及他人的经验2，仅需1克组织即可接种一个25 cm2的培养瓶，并获得一群已被Poloni及其合作者3证实具有同质性的DFAT细胞。脂肪细胞的去分化似乎可在来自任何供体的细胞中实现，不受其年龄、性别及其他特征的影响。在所获得的DFAT细胞群体中，仍存在少量呈圆形或部分伸长形态、未完全去分化的细胞。这些细胞通常在传代培养过程中被弃去，因其会在胰酶-培养基混合液中漂浮。
这些细胞的多向分化潜能已得到证实，并支持其在细胞治疗中的应用2,3。已有报道表明它们具有较高的增殖能力，这对于干细胞应用中的细胞培养而言是一个重要优势2。针对人源DFAT细胞的研究显示，基于其复制能力和分化潜能，它们可能比来自同一供体的ASC更具效率18。最近的一项病例研究支持这一观点，发现DFAT细胞向脂肪细胞和成骨细胞分化的效率更高，且端粒酶水平高于来自同一位患有肥胖症和糖尿病供体的A.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（371697-2011，AT）资助。作者谨此感谢减重外科医生 S. Biron 博士、F-S. Hould 博士、S. Lebel 博士、O. Lescelleur 博士、P. Marceau 博士，以及来自 IUCPQ 组织库的 Christine Racine 和 Caroline Gagnon 提供的帮助。我们感谢 IUCPQ 音视频服务部的 Jacques Cadorette 先生在视频拍摄与编辑方面的工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7906 | |
| 腺苷 | Sigma | A4036 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A0278 | |
| NaCl | 可使用任意品牌 | ||
| KCl | 可使用任意品牌 | ||
| CaCl2 | 可使用任意品牌 | ||
| MgCl2 | 可使用任意品牌 | ||
| KH2PO4 | 可使用任意品牌 | ||
| HEPES | 可使用任意品牌 | ||
| 葡萄糖 | 可使用任意品牌 | ||
| I型胶原酶 | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12，含HEPES，不含酚红 | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | 向培养基中添加：20% 小牛血清、庆大霉素（50 µg/ml）和两性霉素B（2.5 µg/ml） |
| 铁强化小牛血清，来自配方喂养的小牛 | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 英寸塑料衬套 | Iberville | 2704-CP | 货号：1000120918（Home Depot） |
| 液氮 | Linde | ||
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | SIGMA | HT501128 | |
| 无菌镊子 | |||
| 无菌剪刀 | |||
| 60 cc 注射器 | BD Syringe | ||
| 塑料导管 | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit 储存缓冲液（KRH） | 按以下方法配制储存缓冲液：25 mM HEPES（pH 7.6）、125 mM NaCl、3.73 mM KCl、5 mM CaCl2·2H2O、2.5 mM MgCl2·6H2O、1 mM K2HPO4。调节pH至7.4。 | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit 工作缓冲液（KRH-WB） | 将以下组分新鲜加入KRH缓冲液中：4% 牛血清白蛋白、5 mM 葡萄糖、0.1 µM 腺苷、560 µM 抗坏血酸 | ||
| 添加I型胶原酶的KRH-WB缓冲液 | 加入350 U/ml的I型胶原酶 | ||
| T25 无通气盖组织培养瓶 | Sarstedt 或其他品牌 | ||
| 6孔组织培养板 | BD Falcon 或其他品牌 | ||
| 显微镜盖玻片 22×22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| 无菌烧杯 |
参考文献
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fa....
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