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方法文章

单链DNA瓦片自组装形成复杂的二维结构

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DOI：

10.3791/52486

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2015年5月8日

 ,  ,  , 
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

本文内容

摘要

DNA瓦片化是一种构建可编程纳米结构的有效方法。本文描述了通过单链DNA瓦片的自组装来构建复杂二维形状的实验方案。

摘要

当前的DNA纳米结构技术已成功利用自组装原理构建出多种二维和三维结构。本文详细描述了如何通过可寻址的单链DNA瓦片（single-stranded DNA tiles, SST）的自组装来制备复杂二维形状的实验方案，这些瓦片在分子画布上充当分子像素。每种单链瓦片（SST）是一条由42个核苷酸组成的DNA链，包含四个串联的模块化结构域，在自组装过程中分别与四个相邻瓦片结合。分子画布是由SST自组装形成的矩形结构。通过从包含310个像素的分子画布中选择特定的分子像素（SST），并将对应的DNA链进行一锅法退火，即可形成预定的复杂二维形状。由于SST方法具有模块化特性，我们展示了该方法的可扩展性、多功能性和稳健性。与替代方法相比，SST方法通过使用更多样化的信息聚合物和序列，实现了更广泛的设计自由度 从头合成 设计并合成了短DNA链。

引言

先前的核酸自组装研究1-25 已成功构建出多种复杂结构，包括DNA2–5,8,10–13,17,23或RNA7,22的周期性3,4,7,22和算法性5二维晶格、带状结构10,12和管状结构4,12,13、三维晶体17、多面体11以及有限的二维形状7,8。其中一种特别有效的方法是支架化DNA折纸术，该方法通过大量短的辅助“订书钉”链将一条长的支架链折叠成复杂的结构9,14–16,18–21,25。

我们最近报道了一种利用单链瓦片（SST）构建具有指定二维形状的离散纳米结构的方法，并展示了复杂程度可与DNA折纸术相媲美的结构26。本文改编自我们先前的工作26，详细描述了将可 individually 地址化的SST组装成具有精确预设尺寸（宽度和长度）及形态的复杂有限二维结构的实验方案。SST方法的一个关键优势在于其模块化特性。结构中的每一个SST组分在组装过程中均作为一个模块化的构建单元，而这些SST的不同子集可生成不同的形状。因此，我们建立了一个通用平台，能够利用短的合成DNA链构建具有预设大小和形状的纳米结构。

SST 包含四个结构域，每个结构域长度为 10 或 11 个核苷酸（图 1A）。SST 通过其平行的螺旋结构相互结合，形成由交叉连接维持的 DNA 晶格。每个交叉点位于第 2 和第 3 结构域之间的磷酸基团处。图中为增强可视性，磷酸基团被人为拉伸显示。这些交叉点之间的间距为两个螺旋圈（21 个碱基）（图 1B）。复合矩形结构以其螺旋数和螺旋圈数表示其尺寸。例如，一个宽六个螺旋、长八个螺旋圈的矩形结构记为 6H × 8T 矩形。通过省略、添加或重新排列 SST，可构建出任意形状和大小的结构（图 1C）。例如，一个矩形设计可卷曲成具有特定长度和半径的管状结构（图 1D）。

或者，可将矩形SST晶格视为由SST像素构成的分子画布，每个像素为3 nm × 7 nm。在本研究中，我们使用的分子画布包含310条全长内部SST、24条构成左右边界的全长SST，以及28条形成上下边界的半长SST。该画布由24条通过交叉连接的双螺旋组成，每条螺旋包含28个螺旋圈（294个碱基），因此被称为24H × 28T矩形画布。该24H × 28T画布的分子量与利用M13噬菌体支架构建的DNA折纸结构相似。

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方案

1. DNA序列设计

  1. 使用 UNIQUIMER 软件27 设计 SST-有限结构，通过指定双螺旋的数量、每个双螺旋的顶部和底部螺旋长度以及交叉模式，构建一个 24H × 28T 的画布。定义这些参数后，程序将以图形方式展示整体结构（链的组成及互补性排列） 。
  2. 生成满足互补性排列及其他附加要求（如有）的指定结构链序列。通过最小化序列对称性28（针对大多数结构）来设计 DNA 序列。
    1. 逐个随机生成核苷酸（A、C、G 和 T）。
    2. 根据碱基配对规则，生成与已生成核苷酸互补的核苷酸：A 与 T 配对，反之亦然；C 与 G 配对，反之亦然。
    3. 避免使用超过八个或九个核苷酸的重复片段。若在设计过程中出现此类重复片段，需突变最近生成的核苷酸，直至满足重复片段限制条件。
    4. 避免使用四个连续的 A、C、G 或 T 碱基。
    5. 在单链连接点处使用预先指定的核苷酸（例如，对于大多数链，分别将第21位和第22位核苷酸设为 T 和 G），以防止连接点周围碱基发生滑动（e.g., 若第21位和第22位核苷酸均为 T，则第21位核苷酸可能与本应由第22位核苷酸结合的核苷酸发生结合）。
  3. 手动修改 DNA 序列，以实现链霉亲和素标记、将矩形结构转化为管状结构、在不同尺度上形成不同的矩形和管状结构，并防止因 SST 上暴露区域导致的聚集。
    1. 将分子画布边界上的暴露区域替换为多聚 T 序列片段。
    2. 对于链霉亲和素标记，设计手柄片段（附加在组分链上的额外片段，可与互补链如反手柄链结合），使其能够容纳带有 3' 生物素修饰的反手柄链。
    3. 将矩形转化为管状结构时，移除矩形的顶部和底部行，并插入新的一行，其 SST 具有特定互补性，可分别与次顶部行和次底部行上的对应瓦片结合。
    4. 对于不同形状的暴露单链区域，替换为长度为 10–11 个核苷酸的多聚 T 片段，或使用与暴露区域互补并在末端带有长度为 10–11 个核苷酸的多聚 T 片段的边缘保护链进行覆盖。

2. 分子画布的制备

  1. 从寡核苷酸生产商处获取指定序列的DNA单链，其溶解于无RN酶的水中，置于V型底96孔板中，寡核苷酸合成规模为10 nmol，经标准脱盐处理。将含有DNA单链的96孔板在600 × g条件下离心约10秒。
    1. 从用于24H × 28T矩形的362个孔中，每孔移取1 μl含有DNA链的溶液（图3A) 以每条链100 μM（厂家说明书）加入2 ml离心管中。加入138 μl去离子蒸馏水H2将O加入2 ml离心管中，配制每条链浓度为200 nM的链混合物储备溶液。
  2. 加入50 μl 200 nM的链混合物储备液、10 μl 10×退火缓冲液A（50 mM Tris，pH 7.9，10 mM EDTA，250 mM MgCl₂）2)，以及 40 μl 去离子蒸馏水 H2O 至一个 0.2 ml 的 PCR 管中。这将制备出 100 μl 分子画布样品，溶于 1X 退火缓冲液 A（5 mM Tris, pH 7.9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl）中2).
  3. 将样品在热循环仪中退火17小时，温度从90 °C降至25 °C。热循环仪程序设置如下：以每分钟降低5 °C的恒定速度从90 °C降温至61 °C；再以每分钟降低20 °C的恒定速度从60 °C降温至25 °C；最后在4 °C孵育，直至可取出样品。
  4. 制备1×2%的天然琼脂糖凝胶。
    1. 称取 2.4 g 琼脂糖放入 600 ml 烧杯中。向烧杯中加入 120 ml 0.5X TBE 缓冲液（44.5 mM Tris-硼酸，pH 8.3，1 mM EDTA）和 30 ml 去离子蒸馏水。
    2. 微波加热3分钟（或煮沸后再加热40至60秒）。通过加入30 ml水补充蒸发损失的水分，以维持凝胶中琼脂糖浓度为2%。
    3. 轻轻摇动容器内的内容物 在冷水浴中放置烧杯1分钟。加入1 ml 1.2 M MgCl₂。2 （配制 10 mM MgCl₂ 溶液）2 凝胶中浓度）并用 6 μl SYBR Safe 染料（1:20,000）对凝胶进行预染。
    4. 将凝胶溶液倒入干燥的凝胶板中，插入一把厚度为1.5 mm的12孔电泳梳。将凝胶板置于水平平台上静置15–30分钟，使其充分凝固。
    5. 加入凝胶电泳缓冲液（44.5 mM Tris-硼酸盐，pH 8.3，1 mM EDTA，10 mM MgCl₂）2) 加入琼脂糖凝胶的加样孔中。取 2–3 μl 的 1 kb DNA Marker 加入琼脂糖凝胶的一个加样孔中。将 4 μl 6× 溴酚蓝染料（0.25% 溴酚蓝，5 mM Tris，1 mM EDTA，10 mM MgCl₂）与样品混合2 并加入20 μl分子画布样品，将混合液加入琼脂糖凝胶的另一个加样孔中。
  5. 在冰水浴中以100 V电压运行2%天然琼脂糖凝胶2小时（溴酚蓝，图中显示为蓝色，迁移速度比组分链快，可作为指示剂，用于判断2小时运行时间是否合适）。
  6. 使用配备适合SYBR Safe染料滤光片的凝胶成像系统对凝胶进行成像（图2B).
  7. 在蓝光透射仪上，使用锋利洁净的剃须刀片切下与1 kb DNA Ladder中1,500碱基对条带迁移率相近的主要条带。将所需凝胶片段放入离心柱中，用微量离心管研杵将凝胶碾碎成细小碎片。在4 °C下以438 × g离心3分钟。
  8. 使用紫外分光光度计在260 nm处测定DNA浓度。
    1. 使用 2 μl 超纯无 DNase/RNase 蒸馏水作为空白样校准仪器。
    2. 使用从离心柱中收集的样品等体积溶液来估算DNA浓度。在260 nm紫外吸收波长下测得的浓度值（“a” = ng/μl）将用于确定原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）成像所需的稀释倍数。
    3. 将测得的浓度从“a”（ng/μl）转换为“b”（nM），计算公式为 b = a × 106 /（330 × 核苷酸数量）
      注意：一个核苷酸的分子量为330 g/mol。计算出的摩尔浓度值将决定原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）成像时的稀释倍数。以24H × 28T矩形结构为例，纯化后样品的常见浓度约为10 - 60 ng/μl。由于该结构包含14616个核苷酸，其摩尔浓度约为2 - 12 nM。最终浓度取决于离心回收率（约20 - 50%）以及切胶时所取凝胶条带的体积（体积越大，纯化样品越稀释）。

3. 原子力显微镜成像

  1. 使用透明胶带剥离附着在样品金属圆盘上的云母，以获得一个平坦的表面，并将样品圆盘放置于成像载物台上。
  2. 在新剥离的云母表面加入 40 μl 的 1× 退火缓冲液 A，随后加入 5 μl（2 - 5 nM）纯化的 24H × 28T 矩形样品。让混合物静置约 2 分钟。
  3. 将原子力显微镜（AFM）氮化硅悬臂芯片安装到悬臂夹持器上。成像时使用 C 型三角形探针（共振频率 f0 = 40 - 75 kHz；弹性常数 k = 0.24 Nm-1）。
  4. 在液体轻敲模式下对样品进行成像。扫描时采用以下参数：扫描尺寸为 2 μm，分辨率为 1024 行，扫描速率为 0.5 - 1 Hz（图 2C）。
  5. 如有必要，可加入 10 μl 或更多的 10 mM NiCl2 溶液，以增强 DNA 与云母之间的结合强度29。

4. 链霉亲和素标记的样品制备

  1. 手动设计 24H × 28T 矩形结构，使其在特定位置引入 手柄链 ，这些手柄链与经生物素修饰的抗手柄链互补，从而可特异性结合链霉亲和素。
    1. 通过在矩形顶部和底部两行的各14个瓦片上连接一段3'端17个核苷酸的片段，对分子画布进行修饰，以标记边界（图3A）。该片段包含两个核苷酸（TT）作为间隔序列，以及一段15个核苷酸的手柄序列（GGAAGGGATGGAGGA）。该序列与3'端带生物素修饰的抗手柄链（TCCTCCATCCCTTCC-生物素）互补。
  2. 对于内部标记，在矩形的8个内部瓦片和6个边界瓦片上连接3'端17个核苷酸的片段（图4A）。
    1. 将28条带手柄的链（用于边界标记）与24H × 28T矩形的其余组分链（共334条）混合，配制成200 nM的储备溶液。将14条带手柄的链（用于内部标记）与24H × 28T矩形的其余组分链（共348条）混合，获得200 nM的储备溶液。
  3. 对于边界标记，向一个0.1–0.2 ml的PCR试管中加入50 μl 200 nM的链储备溶液、6 μl 100 μM的生物素修饰抗手柄链、10 μl 10×退火缓冲液A以及34 μl去离子蒸馏水。组分链的终浓度为100 nM，抗手柄生物素修饰链的终浓度为6,000 nM。注意，一个24H × 28T矩形可结合28个抗手柄生物素修饰链分子，因此抗手柄生物素修饰链过量100%以上，以利于结合反应进行。
  4. 对于内部标记，向一个0.1–0.2 ml的PCR试管中加入50 μl 200 nM的链储备溶液、3 μl 100 μM的内部抗手柄生物素修饰链、10 μl 10×退火缓冲液A以及37 μl去离子蒸馏水。组分链的终浓度为100 nM，抗手柄生物素修饰链的终浓度为3,000 nM。注意，一个24H × 28T矩形可结合14个抗手柄生物素修饰链分子，因此抗手柄生物素修饰链过量100%以上，以利于结合反应进行。
  5. 将两个样品在热循环仪中按照2.3步骤所述条件退火17小时。
  6. 按照2.4步骤所述方法制备2%的天然琼脂糖凝胶。
  7. 按照2.5步骤所述方法对两个样品进行纯化。
  8. 按照2.6步骤所述方法测定目标DNA结构的浓度。

5. 链霉亲和素标记的原子力显微镜检测

  1. 按照步骤3所述，使用原子力显微镜（AFM）对每个样品进行成像（图3B和图4B）。
  2. 完成第一轮成像后，向样品中加入40 μl的1X退火缓冲液A，随后加入1 μl浓度为10 mg/ml的链霉亲和素。混合物静置约2分钟后，重新成像（图3C和图4C）。

6. 将矩形转化为管状结构

  1. 为了基于矩形设计管状结构，除顶部和底部行外，保留所有组分SST。引入新的一行，其SST通过将各列的上半部分和下半部分半砖依次连接，从而将原始矩形环化为管状构型（图5A）。
  2. 将新行的链（14条链）与24H × 28T矩形的组分链（不包括顶部和底部行，共336条链）混合，得到200 nM的储备溶液。
  3. 按照凝胶纯化步骤2.2 - 2.7进行操作（图5B）。

7. 透射电子显微镜成像

  1. 称取 0.06 g 甲酸铀酰溶于 3 ml 蒸馏水中，配制 2% 的甲酸铀酰水溶液染色液。使用连接在注射器上的 0.2 µm 滤膜过滤 2% 的甲酸铀酰水溶液染色液。
    1. 向 1 ml 过滤后的染色液中加入 5 µl 5 N NaOH。短暂涡旋混匀后，在 20,000 x g 条件下离心。
  2. 对碳膜载网（碳膜面朝上）进行辉光放电处理，设置参数如下：25 mA，45 s，0.1 mBar，负高压极性。
  3. 使用自闭合镊子从边缘夹取经辉光放电处理的载网。
  4. 将 3.5 µl 样品滴加到载网上，作用 4 min。用滤纸从侧面接触载网，吸除多余样品。
  5. 立即在载网上滴加 3.5 µl 染色液，作用 1 min。
  6. 参照步骤 7.4 吸除染色液，并将滤纸紧贴载网保持 1 - 2 min。
  7. 将载网转移至透射电镜样品 holder 中，使用在 80 kV 下运行的 JEOL JEM-1400 电镜进行成像，放大倍数范围为 10 K 至 80 K（图 5C）。

8. 使用分子画布构建任意形状

  1. 确定一个形状，并在分子画布上选择与该形状对应的链。例如，对于三角形形状，从362条链中选择206条用于分子画布。
  2. 将暴露的结构域（即沿三角形斜边的部分）替换为一段10–11个核苷酸长度的poly-T片段（图6A中的设计1），或添加一段与暴露结构域互补的边缘保护链，并在其末端接上一段10–11个核苷酸长度的poly-T片段（图6A中的设计2），以防止聚集。
    注意：仅将对应于三角形像素的单链模板（SST）退火（不使用保护链）会导致聚集，在凝胶电泳中无法形成明显的产物条带。建议对各种形状采用边缘保护链设计，因其资源利用更高效；相比替换设计（图6B）所需的额外14组链，边缘保护设计仅需额外增加四组链（图6C）。
  3. 构建一个包含310像素分子画布的链库，其中包括核心组（362条SST画布链）， 第1*组（结合SST上结构域1的边缘保护链）、第2*组（结合SST上结构域2的边缘保护链）、第3*组（结合SST上结构域3的边缘保护链）以及 第4*组（结合SST上结构域4的边缘保护链），共计1344条边缘保护链。
  4. 将不同组别的96孔板离心约10秒。从各孔板中移取所需链，以制备特定形状的储备溶液。
    1. 对于带有边缘保护链的三角形形状，从核心组中移取206条链各1 μl，第1*组、第2*组、第3*组各0条，第4*组中移取24条链，分别加入一个2 ml离心管中。向管中加入20 μl去离子蒸馏水，配制成浓度为400 nM的DNA链储备溶液。
  5. 在一个0.2 ml PCR管中加入50 μl 400 nM的DNA链储备溶液、10 μl 10×退火缓冲液B（50 mM Tris, pH 7.9, 1 mM EDTA, 125 mM MgCl2）以及40 μl去离子蒸馏水H2O。最终得到100 μl样品，其中退火缓冲液B为1×（5 mM Tris, pH 7.9, 1 mM EDTA, 12.5 mM MgCl2），每条链的浓度约为200 nM。
  6. 按照步骤2.3所述，在热循环仪中对混合物进行17小时退火。
  7. 按照步骤2.4所述，制备天然2%琼脂糖凝胶。
  8. 按照步骤2.5所述，对样品进行纯化。
  9. 按照步骤2.6所述，测定DNA浓度。
  10. 按照步骤3所述，使用原子力显微镜（AFM）对样品成像（图7C和图7D）。
  11. 使用同一链库，选取并混合不同形状所需的链。分别对不同溶液进行退火，并将不同形状的纯化样品混合，以节省AFM成像时间。

9. 可选：形状设计与液体混合的机器人自动化

  1. 使用定制的 MATLAB 程序辅助设计复杂形状。
  2. 使用软件以移液序列的形式向机器人液体处理系统发送指令。利用机器人液体处理系统选择并混合构成目标形状的链段。
    注意：形状设计和链段混合已实现自动化，以减少人为误差并降低构建过程的劳动强度。

10. 不同尺度下的矩形与管状结构

  1. 通过简单地改变平行螺旋的数量（H）和螺旋圈数（T），构建不同尺寸的矩形（图10）。
  2. 按照第3步操作，构建特定尺寸的矩形。
  3. 按照第6步操作，构建特定尺寸的管状结构。

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结果

SSTs 的自组装 （图1） 将得到一个24H × 28T的矩形，如图所示 图2不同SST的DNA序列可以被修饰/优化以实现链霉亲和素标记 （图3和图4），将矩形转化为管状结构（图5），SST 可编程自组装形成不同尺寸的管状和矩形结构 （图10）以及利用分子画布构建二维任意形状 (图8）。测试了两种设计（结构域替换设计和边缘保护设计），以解决任意形状暴露结构域上的聚集问题。 （图7）两种设计的凝胶产量和结构完整性相当，但边缘保护设计由于需要的辅助物种较少，因而更具成本效益。 (图6）。链的挑选与混合可实现自动化，如图所示 图9 以减少人为误差并节省时间。

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讨论

在结构形成步骤中，保持适当浓度的镁离子至关重要（例如在DNA链混合物中加入适当浓度的镁离子（如15 mM），以促进DNA纳米结构的自组装。同样，在琼脂糖凝胶表征/纯化步骤中，保持适当的镁离子浓度也至关重要。例如在凝胶和电泳缓冲液中加入 10 mM Mg²⁺，以在电泳过程中保持 DNA 纳米结构的稳定性。对于 24H×28T 矩形结构，我们测试了在不同 Mg²⁺ 条件下的退火效果。++ 浓度，并发现该结构通常在 10 - 30 mM Mg 范围内形成++ （以约 20 mM Mg 获得最佳成形产率）++).

与支架化的折纸结构不同，单链砖（SST）结构具有模块化架构。通过选择适当的SST砖子集，可从同一画布设计出不同的形状。此外，SST结构仅由短的合成DNA链组装而成，不涉及折纸方法中所使用的长支架链。因此，SST结构的尺寸不受可用支架长度的限制。然而，尽管DNA折纸方法通常可被优化以产生折叠完全的结构或未折叠的单体，SST方法可能产生部分形成的结构，因而可能需要凝胶纯化以用于后续实...

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披露

作者声明存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由美国海军研究办公室青年研究者计划奖 N000141110914、美国海军研究办公室资助项目 N000141010827、美国国家科学基金会职业奖 CCF1054898、美国国立卫生研究院院长新创新者奖 1DP2OD007292、威斯生物启发工程研究所教师启动基金（授予 P.Y.）以及清华-北大生命科学中心启动基金（授予 B. W.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DNA链 Integrated DNA Technology第3.1节
SYBR Safe DNA凝胶染料InvitrogenS33102第3.4.2节
Freeze'N Squeeze DNA凝胶提取离心柱BIO-RAD731-6166第3.6节
Bruker的Sharp Nitride Lever探针Bruker AFM ProbesSNL10第4.3节
Safe Imager 2.0蓝光透射仪InvitrogenG6600第3.6节
Centrifuge 5430R离心机Eppendorf5428 000.414第3.6节
透射电子显微镜 JeolJem 1400第7.4节
Multimode 8原子力显微镜Veeco第4节
Typhoon FLA 9000激光扫描仪GE Healthcare Life Sciences28-9558-08第3.5节
超纯蒸馏水Invitrogen10977-023第3.7.1节
云母片SPI Supplies12001-26-2第4.1节
钢制载物盘Ted Pella, Inc.16218第4.1节
用于透射电镜的碳支持铜网Electron Microscopy SciencesFCF400-Cu第7.2节
镊子Dumont0203-N5AC-PO第7.31节
辉光放电系统Quorum TechnologiesK100X第7.2节
DNA Engine Tetrad 2 Peltier梯度PCR仪BIO-RADPTC–0240G第3.3节
Owl Easycast B2微型凝胶电泳系统ThermoScientificB2第3.4.3节
Seekam LE琼脂糖 500GLonza50004第3.4.1节
GeneRuler 1kb Plus DNA Marker（预混型，75-20000bp）ThermoScientificSM1333第3.4.4节
Nanodrop 2000c紫外-可见分光光度计ThermoScientific第3.7节
0.2 µm滤膜Corning Inc.431219第7.1.2节

参考文献

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