斑马鱼角质形成细胞外植体用于研究皮肤伤口愈合中的集体细胞迁移与再上皮化

摘要

斑马鱼角膜细胞从外植体中以细胞片层形式迁移，并提供一种 体外 用于研究上皮伤口愈合过程中集体细胞迁移机制的模型。这些方案详细介绍了建立原代组织块培养物以用于集体细胞迁移检测的有效方法。

摘要

由于其独特的运动特性，从组织块培养中分离出的鱼类角质细胞长期以来被用于研究单个细胞迁移的机制。然而，在组织块培养初期，这些细胞也会以集体方式移动，同时保持许多使单个角质细胞成为研究细胞迁移理想模型的特征：快速的迁移速率、富含肌动蛋白且具有垂直肌动蛋白束的片状伪足，以及相对恒定的迁移速度和方向。在早期组织块中，单独迁移细胞与集体迁移细胞之间能够快速相互转化，这使得研究人员可以探究细胞间黏附在决定迁移模式中的作用，并凸显了两种迁移模式之间的分子联系。在后期组织块中，随着上皮-间质转化的发生以及与伤口愈合和炎症相关的基因出现差异表达，细胞逐渐丧失快速且集体迁移的能力。因此，角质细胞组织块可作为 体外 一种用于研究皮肤伤口愈合过程中上皮再形成机制的模型，可作为在特定基因表达变化程序背景下研究集体细胞迁移机制的独特系统。目前已有多种突变体和转基因斑马鱼品系，使得能够从不同遗传背景的鱼类中建立外植体，从而可特异性地探究不同蛋白质在这些过程中的作用。本文所述方案介绍了一种简便且高效的方法，用于建立此类外植体培养体系，以应用于多种与集体细胞迁移相关的检测分析。

引言

对细胞迁移的研究传统上集中于单个迁移的细胞。从鱼类和两栖类组织外植体培养而来的角质细胞已被证明是研究细胞迁移机制的有力模型系统，可用于实验研究和数学建模方法^1-6。对单个迁移细胞的实验研究得益于这些细胞快速、平稳的滑行运动，同时能保持形态、速度和方向的一致性。然而，在活体（in vivo）条件下，细胞通常在维持细胞间连接的情况下进行集体迁移，这种情况尤其常见于胚胎发育、伤口愈合和转移过程中。因此，集体细胞迁移已成为细胞迁移领域中一个日益重要且不断发展的研究方向。这些细胞的集体迁移行为最近已有描述⁷，其具有多种独特特征，使其成为在伤口愈合模型中研究集体细胞迁移的有力体系。

当从麻醉的成年斑马鱼身上拔下鳞片时，部分上皮组织会附着在鳞片的腹面。加入细胞培养基后，这些上皮细胞（即角质细胞）会作为一个集体单位迅速从鳞片迁移而出。这种鳞片外植体培养可视为一种上皮伤口愈合模型，其中细胞从外植体迁移出去，类似于在伤口床的临时基质上迁移，以重建完整的上皮层。近期数据显示，这一过程 离体 培养物模拟了许多特征 体内 成年斑马鱼的伤口愈合。伤口闭合速率⁸ 迁移速度，与观察到的相似 离体 系统⁷此外，在一个 体内 伤口愈合模型中，使用华法林治疗表明止血过程对愈合速率无影响，而使用氢化可的松抑制免疫反应并不会延迟再上皮化。

方案

本方案符合美国兽医协会（AVMA）关于实验动物护理与使用的动物福利原则，并已获得中西部大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 麻醉与设备的准备 & 媒体

1. 使用市售的除氯剂（可在宠物店购买）或将自来水静置 24 小时，对约 1.5 升自来水进行除氯。准备三个 1 升烧杯，每个烧杯中加入 500 毫升已除氯的水。将其中一个标记为用于操作前暂养鱼类，另一个用于术后恢复。向第三个烧杯中加入 100 µg/ml 的三卡因甲磺酸盐（tricaine methanesulfonate），该烧杯将用于鱼类麻醉。
2. 在浅盘中装入冰块，将培养基（RPMI 1640，含 10% FBS（胎牛血清）、50 µg/ml 庆大霉素、100 µg/ml 卡那霉素、25 mM HEPES）升温至室温，并准备好洁净的珠宝镊子。将镊子尖端浸入 70% 乙醇中，随后通过本生灯火焰灼烧，使乙醇完全燃烧去除。
3. 确定操作是否在无放大条件下进行，或使用带有照明的商用台式放大镜（放大倍数为 2–10 倍），或使用解剖显微镜（完全根据个人偏好决定）。

2. 建立外植体培养

1. 捕获所需数量的鱼类并放入暂养烧杯中。将单条鱼转移至麻醉烧杯；最好逐条进行麻醉。
2. 通过观察鱼的游动和鳃部运动来监测麻醉效果。随着麻醉的进行，鳃部运动逐渐减慢，....

结果

如图1所示，在建立外植体培养数小时内，即可观察到角质细胞层从鳞片下方迁移而出。偶尔可见个别角质细胞脱离集体迁移的细胞层，单独迁移。此外，由于外植体来源于先前被拔除鳞片的鱼类，因此有大量中性粒细胞穿过细胞层迁移。在更长时间的培养后，角质细胞层发生上皮-间质转化（EMT¹⁴），导致细胞层碎裂。

在培养的最初48小时内，细胞片层的初始推进速度非常迅速，但随着细胞铺展（通过面积和核间距测量，分别增加约1.8倍和3.1倍），推进速度迅速减慢（图2A-C）。这种快速推进与细胞增殖无关；使用荧光标记的胸腺嘧啶类似物乙炔基脱氧尿苷（EdU）进行24小时标记后，仅有约10%的细胞显示出细胞分裂的证据，该比率远低于转化细胞系中的水平，但更符合人类器官型培养中参与再上皮化过程的细胞特征³⁰。在后期，细胞片层出现碎片化（此现象与本系统中观察到的上皮-间质转化（EMT）相关¹⁴），导致难以准确测量前沿边缘的推进情况。

2.......

讨论

角质形成细胞外植体培养成功最关键的步骤是，在加入培养基之前，让鳞片在培养皿上贴附约 2 - 3 分钟。大约 75% 的鳞片会贴附并生长成片状结构（因此每个实验所需的培养数量需相应调整）。并非每一片从鱼体上取下并置于培养环境中的鳞片都会形成角质形成细胞片层，原因有多种。首先，对外植体进行 DAPI 染色显示，部分鳞片附着的细胞数量极少，因此这些鳞片无法形成角质形成细胞片层。其次，外植体能否成功贴附于组织培养皿表面，是细胞片层迁移的关键前提。决定鳞片是否能够贴附并建立成功外植体培养的关键因素之一，是将鳞片放置于生长表面后至加入培养基之间的时间间隔。若在无培养基条件下贴附时间不足，会导致鳞片漂浮于培养基中（有时可见组织附着）；而贴附时间过长则会导致鳞片虽已贴附但无细胞生长（可能是由于外植体干燥所致，边缘可见细胞残留物）。鳞片放置于培养皿后至加入生长培养基之间的时间可能需要通过实验确定，因为实验室内的温度和湿度等因素可能会影响细胞在不干燥的情况下贴附到培养皿表面的速度。

尽管市售的斑马鱼特异性抗体数量正在增加，但可用试剂的种类仍可能受限。通常认为免疫原与靶蛋白之间需要达到85%的同源性才能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底培养皿（聚-D-赖氨酸包被）	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm 厚度最适合盖玻片移除。14 mm 直径可提供更大的培养面积。
Swiss Jewelers 型镊子，Integra，Miltex 17-303	VWR	21909-460	我们发现窄而精细的镊子最适合鳞片移除。