斑马鱼角质形成细胞外植体用于研究皮肤伤口愈合中的集体细胞迁移与再上皮化

摘要

斑马鱼角膜细胞从外植体中以细胞片层形式迁移，并提供一种 体外 用于研究上皮伤口愈合过程中集体细胞迁移机制的模型。这些方案详细介绍了建立原代组织块培养物以用于集体细胞迁移检测的有效方法。

摘要

由于其独特的运动特性，从组织块培养中分离出的鱼类角质细胞长期以来被用于研究单个细胞迁移的机制。然而，在组织块培养初期，这些细胞也会以集体方式移动，同时保持许多使单个角质细胞成为研究细胞迁移理想模型的特征：快速的迁移速率、富含肌动蛋白且具有垂直肌动蛋白束的片状伪足，以及相对恒定的迁移速度和方向。在早期组织块中，单独迁移细胞与集体迁移细胞之间能够快速相互转化，这使得研究人员可以探究细胞间黏附在决定迁移模式中的作用，并凸显了两种迁移模式之间的分子联系。在后期组织块中，随着上皮-间质转化的发生以及与伤口愈合和炎症相关的基因出现差异表达，细胞逐渐丧失快速且集体迁移的能力。因此，角质细胞组织块可作为 体外 一种用于研究皮肤伤口愈合过程中上皮再形成机制的模型，可作为在特定基因表达变化程序背景下研究集体细胞迁移机制的独特系统。目前已有多种突变体和转基因斑马鱼品系，使得能够从不同遗传背景的鱼类中建立外植体，从而可特异性地探究不同蛋白质在这些过程中的作用。本文所述方案介绍了一种简便且高效的方法，用于建立此类外植体培养体系，以应用于多种与集体细胞迁移相关的检测分析。

引言

对细胞迁移的研究传统上集中于单个迁移的细胞。从鱼类和两栖类组织外植体培养而来的角质细胞已被证明是研究细胞迁移机制的有力模型系统，可用于实验研究和数学建模方法^1-6。对单个迁移细胞的实验研究得益于这些细胞快速、平稳的滑行运动，同时能保持形态、速度和方向的一致性。然而，在活体（in vivo）条件下，细胞通常在维持细胞间连接的情况下进行集体迁移，这种情况尤其常见于胚胎发育、伤口愈合和转移过程中。因此，集体细胞迁移已成为细胞迁移领域中一个日益重要且不断发展的研究方向。这些细胞的集体迁移行为最近已有描述⁷，其具有多种独特特征，使其成为在伤口愈合模型中研究集体细胞迁移的有力体系。

当从麻醉的成年斑马鱼身上拔下鳞片时，部分上皮组织会附着在鳞片的腹面。加入细胞培养基后，这些上皮细胞（即角质细胞）会作为一个集体单位迅速从鳞片迁移而出。这种鳞片外植体培养可视为一种上皮伤口愈合模型，其中细胞从外植体迁移出去，类似于在伤口床的临时基质上迁移，以重建完整的上皮层。近期数据显示，这一过程 离体 培养物模拟了许多特征 体内 成年斑马鱼的伤口愈合。伤口闭合速率⁸ 迁移速度，与观察到的相似 离体 系统⁷此外，在一个 体内 伤口愈合模型中，使用华法林治疗表明止血过程对愈合速率无影响，而使用氢化可的松抑制免疫反应并不会延迟再上皮化。⁸由于斑马鱼在取下鳞片时不会出血，因此止血不是主要影响因素。尽管我们在外植体中发现了免疫细胞，但我们尚未研究这些细胞对集体细胞迁移可能产生的影响。

本文所述方案介绍如何建立斑马鱼角质细胞外植体培养体系，该体系可确保在多种生物学检测中具有高度的一致性与可重复性。此类外植体培养体系尤其具有显著优势 体外 集体细胞迁移的多种原因模型。首先，斑马鱼角质细胞是在建立外植体培养后数小时内使用的原代细胞。因此，这些细胞尚未经历原代细胞传代相关的形态学和基因表达变化^9-13其次，该系统为研究伤口愈合过程中上皮再形成提供了一个模型¹⁴ 并且，作为对损伤的响应，上皮-间质转化（EMT）过程被启动，其证据包括基因表达的变化和细胞骨架的重排^14,15因此，已对未经处理的细胞中基因表达和运动性的背景变化进行了表征，为解释处理后的变化提供了参照背景。此外，鱼类角质细胞与人类角质形成细胞功能上是等效的；两者分别是其所属物种的主要上皮细胞，在上皮组织伤口愈合过程中发挥关键作用。第三，成年斑马鱼正逐渐被认可为多种人类疾病的模型系统^16-18 包括黑色素瘤及其他癌症^19-21皮肤伤口愈合^8,14 和组织再生^22-24.

该模型系统的技术优势同样显著。目前，越来越多的突变体和转基因品系可从非营利性的集中化机构获得。具体而言，威康信托桑格研究所的斑马鱼突变项目（Zebrafish Mutation Project, ZMP）旨在为斑马鱼基因组中的每一个蛋白质编码基因创建敲除等位基因。截至目前，该项目已对11,892个基因进行了突变，约占基因组的45%，并已鉴定出24,088个等位基因。此外，ZMP接受研究人员提交的申请，并将免费生成相应的基因敲除品系。近年来在幼体和成体斑马鱼中应用的基因敲降技术^25-28，为研究那些难以或无法通过转基因方法进行分析的重要发育相关基因的功能提供了灵活性。

由于其在建立培养后不久即表现出极快的运动速率（约145 µm/hr）²⁹，相关检测可快速完成（通常在24小时或更短时间内）。由于实验周期短且细胞在室温下生长良好，因此避免了许多与哺乳动物细胞迁移实验中涉及视频显微镜技术相关的技术难题。此外，在科研经费日益紧张的时代，斑马鱼易于饲养且成本低廉。

组织块的结构和行为十分复杂。由于在去除鳞片时鱼类不会出血，因此很可能只有表层的上皮层被一并移除。当鳞片刚从鱼体上取下时，角质细胞似乎是组织块中占主导地位的细胞类型，因为绝大多数细胞均表现出抗E-钙黏蛋白抗体的阳性染色¹⁴。此外，通过免疫荧光检测未发现波形蛋白染色，表明初始培养物中不存在成纤维细胞¹⁴。然而，在反复取鳞的过程中，组织块中似乎出现了大量中性粒细胞（见视频 1）。我们根据这些细胞的形态特征，包括其大小、快速运动能力，以及在脂多糖（LPS）刺激下从细胞层中迁移出来的行为，将其鉴定为中性粒细胞（数据未显示）。此外，这些细胞对中性粒细胞胞质因子抗体以及多种IgG二抗均呈现强阳性染色，表明其表面存在丰富的Fc受体（数据未显示）。组织块内包含多个细胞层。共聚焦显微镜观察显示，在迁移前沿附近为单层细胞，靠近鳞片处则存在两层以上的角质细胞层，而中性粒细胞可见于角质细胞层的上方、下方以及细胞层之间。

在早期时间点，多层外植体边缘的细胞发生极化，启动角质形成细胞的集体迁移，初始迁移速率约为145 µm/hr。外植体覆盖的面积迅速扩大，导致细胞铺展、细胞层内张力增加，以及前沿推进速度减慢。在细胞层内自发形成和闭合孔洞的过程中，前沿的领导细胞与跟随细胞之间快速相互转换⁷。随着由外植体启动的上皮-间质转化（EMT）过程持续进行，细胞层发生断裂，角质形成细胞失去其特化的快速运动能力。与EMT、伤口愈合及炎症反应一致的基因表达和形态学变化在培养7天内出现，外植体通常在约10天内保持活性¹⁴。

方案

本方案符合美国兽医协会（AVMA）关于实验动物护理与使用的动物福利原则，并已获得中西部大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 麻醉与设备的准备 & 媒体

1. 使用市售的除氯剂（可在宠物店购买）或将自来水静置 24 小时，对约 1.5 升自来水进行除氯。准备三个 1 升烧杯，每个烧杯中加入 500 毫升已除氯的水。将其中一个标记为用于操作前暂养鱼类，另一个用于术后恢复。向第三个烧杯中加入 100 µg/ml 的三卡因甲磺酸盐（tricaine methanesulfonate），该烧杯将用于鱼类麻醉。
2. 在浅盘中装入冰块，将培养基（RPMI 1640，含 10% FBS（胎牛血清）、50 µg/ml 庆大霉素、100 µg/ml 卡那霉素、25 mM HEPES）升温至室温，并准备好洁净的珠宝镊子。将镊子尖端浸入 70% 乙醇中，随后通过本生灯火焰灼烧，使乙醇完全燃烧去除。
3. 确定操作是否在无放大条件下进行，或使用带有照明的商用台式放大镜（放大倍数为 2–10 倍），或使用解剖显微镜（完全根据个人偏好决定）。

2. 建立外植体培养

1. 捕获所需数量的鱼类并放入暂养烧杯中。将单条鱼转移至麻醉烧杯；最好逐条进行麻醉。
2. 通过观察鱼的游动和鳃部运动来监测麻醉效果。随着麻醉的进行，鳃部运动逐渐减慢，鱼会出现不规则游动并频繁翻转至腹部朝上；一旦鳃部运动停止，即可认为鱼已进入麻醉状态。切勿让鱼在麻醉液中停留过长时间，以免导致死亡。
3. 将鱼从麻醉烧杯中取出，转移至冰上，放置时使鱼体呈水平方向，尾部朝向手持镊子的手。若操作熟练且需使用多条鱼制备外植体，可在此时将下一条鱼放入麻醉烧杯中。
4. 去除鳞片时，将镊子平行于鱼体放置，镊尖对准鳞片边缘。将镊子的扁平侧稍压入鱼体侧面，使鳞片从鱼体抬起。用镊子夹住鳞片，拔下后（避免翻转）直接放入组织培养皿中。重复此操作，从一条大型成年鱼身上最多取12片鳞片（每侧6片），注意避开鳃区、侧线和鳍部。
5. 将鱼放入恢复烧杯中，并观察其是否从麻醉状态中恢复。此时可将鱼转移回单独的养殖缸中。让鱼至少恢复21天，以确保鳞片完全再生。
6. 根据实验设计，每个塑料35 mm组织培养处理皿中可放置最多20片鳞片，或每个玻璃底皿中放置4–6片鳞片。在轻轻加入培养基前，先让鳞片充分贴附于皿底，以防其脱离皿面。
   注意：操作熟练后，可在向第一个培养皿加液前先处理多条鱼的鳞片。
7. 向每个35 mm培养皿中加入1.2 ml完全培养基（见上述1.2部分）。
8. 最好将外植体培养物置于28 °C、5% CO₂条件下孵育所需时间，可选择是否添加其他处理。也可将培养物置于加热显微镜载物台或活细胞培养腔内，用于视频显微观察。

3. 明场与视频显微镜技术

1. 将含有细胞片的培养皿放置在显微镜载物台上，先使用 4X 物镜进行初步聚焦。
   注意：可根据实验需要使用更高倍数的物镜。在载物台上标记每个细胞片的位置和/或培养皿的方向，有助于在不同时间点拍摄时保持细胞片大致相同的方向。
2. 从培养箱中取出培养皿，按照各实验方案在不同时间点进行拍照；若实验时间段内仅需静态图像，则拍照后将其放回培养箱中。
3. 进行视频显微观察时，请注意以下事项：
   1. 调整标尺/新生细胞片在视野中的位置，确保迁移的细胞片在整个视频录制过程中始终保留在视野范围内。
      注意：这需要一定经验来观察细胞如何从标尺下方迁移。对于较短时间的视频，此问题影响较小；而对于较长时间的视频则更为重要。
   2. 对于较短时间的观察，可在室温（RT）下进行孵育；对于较长时间（18 小时以上）的观察，应使用加热载物台或培养箱，以维持温度、pH 平衡，并减少培养基的蒸发。

4. 免疫荧光显微镜的固定

1. 将所有溶液配制并预热至 28 °C。为了在荧光下观察角膜细胞，按照上述方法使用底部为玻璃的 35 mm 组织培养皿培养外植体。或者，可使用玻璃底共聚焦培养皿。
2. 向每皿中加入 0.8 ml 含 4% 多聚甲醛的 1.1x PBS 溶液。无需先移除培养基。 室温孵育 5 分钟，然后吸去溶液。
3. 向每皿中加入 0.8 ml 含 4% 多聚甲醛的 1.1x PBS 溶液。室温孵育 5 分钟，然后吸去溶液。
4. 除非使用外源配体或细胞外表位，否则通过加入 0.5 ml 含 0.2% Triton X-100 的 1X PBS 溶液对细胞进行透化处理。室温孵育 5 分钟，然后吸去溶液。
5. 向每皿中加入 0.5 ml 含 1% BSA 的 1x PBS 溶液，室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。
   注意：根据实验条件，此步骤可加入鬼笔环肽（phalloidin）。
6. 孵育结束后，吸去溶液，随后进行抗体染色。或者，可向培养皿中加入至少 1–2 ml 含 1% BSA 的 1x PBS 溶液，在 4 °C 保存 3–4 周。

5. 免疫荧光实验方案

1. 根据制造商的建议配制一抗和二抗溶液。
   注意：如果制造商未提供建议，一抗的起始稀释比例（溶于含1% BSA的1×PBS中）可采用多克隆抗体1:500，单克隆抗体1:1,000；二抗的起始稀释比例建议为1:1,000。若信号较弱，可适当提高原始储备液的稀释倍数；若信号较强且背景较高，则应降低稀释倍数。
2. 吸除含1% BSA的1×PBS溶液，加入0.5 ml一抗溶液，在室温下孵育1小时，或在4 °C下过夜（O/N）。
3. 移除一抗溶液，转移至洁净并标记好的1.5 ml微量离心管中，于-20 °C冷冻保存。
   注意：如有需要，可重复使用该一抗溶液。
4. 用1×PBS洗涤培养皿3至5次，每次洗涤后吸除并弃去PBS。
5. 加入0.5 ml二抗溶液。如需观察肌动蛋白纤维，可在本步骤中加入荧光标记的鬼笔环肽（phalloidin），浓度遵循制造商推荐。在室温下孵育1小时，或在4 °C下过夜（O/N）。
   注意：使用荧光标记的鬼笔环肽可实现对肌动蛋白纤维的可视化；我们发现488标记的鬼笔环肽在斑马鱼角质细胞中效果最佳，但也可使用其他荧光染料。
6. 移除并弃去二抗溶液。
7. 用1×PBS洗涤培养皿3至5次，每次洗涤后吸除并弃去PBS。
   注意：若无法立即观察，可将培养皿避光保存于4 °C；保存前需向皿中加入1×PBS以防止细胞干燥。使用前将其恢复至室温（20–30分钟），然后在进入下一步前吸除PBS。
8. 准备观察时，根据实验需求，在培养皿中加入2–3滴封片剂（含或不含DAPI），室温静置10分钟。
   注意：我们使用的是市售的含DAPI的甘油基封片剂，但也可选用其他类型的封片剂。静置10分钟有助于后续轻松地将玻璃盖玻片从培养皿底部取出。
9. 孵育结束后，轻轻挤压培养皿侧壁以松动并取出盖玻片。在载玻片上滴加一滴封片剂，将盖玻片（细胞面朝下）置于载玻片上。
   注意：若需长期保存（超过1–2天），建议使用透明指甲油将盖玻片边缘密封固定于载玻片上。
10. 在荧光显微镜下观察载玻片。
    注意：我们的大部分图像均采用油镜下40X或63X物镜拍摄，但具体使用的物镜取决于实验方案。

结果

如图1所示，在建立外植体培养数小时内，即可观察到角质细胞层从鳞片下方迁移而出。偶尔可见个别角质细胞脱离集体迁移的细胞层，单独迁移。此外，由于外植体来源于先前被拔除鳞片的鱼类，因此有大量中性粒细胞穿过细胞层迁移。在更长时间的培养后，角质细胞层发生上皮-间质转化（EMT¹⁴），导致细胞层断裂成碎片。

片状细胞的初始推进速度极快，但在培养的前48小时内，随着细胞铺展（通过面积和核间距测量，分别增加约1.8倍和3.1倍），推进速度迅速减慢（图2A-C）。这种快速扩展与细胞增殖无关；使用荧光标记的胸腺嘧啶类似物乙炔基脱氧尿苷（EdU）进行24小时标记后，仅有约10%的细胞显示出细胞分裂的证据，该比率远低于转化细胞系中的水平，但更符合人源类器官培养中参与再上皮化过程的细胞特征³⁰。在后期，细胞片出现碎片化现象（与此系统中观察到的上皮-间质转化（EMT）相关¹⁴），导致前沿边缘的推进难以准确测量。

24 小时...

讨论

角质形成细胞外植体培养成功最关键的步骤是，在加入培养基之前，让鳞片在培养皿上贴附约 2 - 3 分钟。大约 75% 的鳞片会贴附并生长成片状结构（因此每个实验所需的培养数量需相应调整）。并非每一片从鱼体上取下并置于培养环境中的鳞片都会形成角质形成细胞片层，原因有多种。首先，对外植体进行 DAPI 染色显示，部分鳞片附着的细胞数量极少，因此这些鳞片无法形成角质形成细胞片层。其次，外植体能否成功贴附于组织培养皿表面，是细胞片层迁移的关键前提。决定鳞片是否能够贴附并建立成功外植体培养的关键因素之一，是将鳞片放置于生长表面后至加入培养基之间的时间间隔。若在无培养基条件下贴附时间不足，会导致鳞片漂浮于培养基中（有时可见组织附着）；而贴附时间过长则会导致鳞片虽已贴附但无细胞生长（可能是由于外植体干燥所致，边缘可见细胞残留物）。鳞片放置于培养皿后至加入生长培养基之间的时间可能需要通过实验确定，因为实验室内的温度和湿度等因素可能会影响细胞在不干燥的情况下贴附到培养皿表面的速度。

尽管市售的斑马鱼特异性抗体数量正在增加，但可用试剂的种类仍可能受限。通常认为免疫原与靶蛋白之间需要达到85%的同源性才能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底培养皿（聚-D-赖氨酸包被）	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm 厚度最适合盖玻片移除。14 mm 直径可提供更大的培养面积。
Swiss Jewelers 型镊子，Integra，Miltex 17-303	VWR	21909-460	我们发现窄而精细的镊子最适合鳞片移除。