本实验方案旨在对莴苣（Lactuca sativa L.）叶用蔬菜的大量种质资源进行耐旱性筛选，以鉴定出少量候选莴苣材料，用于后续生理学、分子生物学和遗传学研究，揭示其耐旱性状的遗传基础，并服务于育种项目。
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摘要
摘要
本方案描述了一种对大量叶用绿叶蔬菜莴苣（Lactuca sativa L.）种质资源进行筛选、以鉴定其潜在抗旱性状的方法。农业用水的可获得性已成为美国以及世界许多地区日益关注的问题。短期干旱事件频发，水资源供给受到监管干预，加之长期气候变化可能造成许多重要农业区域降水减少的潜在威胁，这些因素共同加剧了加快培育水分利用效率更高作物品种的紧迫性，以确保未来几年内维持甚至扩大农业生产。本方案并非用于在生理或分子水平上逐步鉴定莴苣抗旱性状的详细指南，而是一种在筛选数千种不同莴苣品种过程中不断开发和完善的方法。该筛选方法部分基于简化的测量流程，仅关注三个水分胁迫指标：叶片相对含水量、萎蔫程度以及干旱胁迫后的植株生长差异。对大量种质资源进行快速筛选的目的是将候选材料范围缩小至可进一步在实验室或田间采用更深入的生理学、分子生物学和遗传学方法，以鉴定特定抗旱性状的程度。此外，筛选出的候选材料也可直接用于育种项目，作为抗旱性状的来源。
引言
几十年来，美国大部分地区乃至全球都一直关注灌溉用水的可获得性问题，但在工业、学术和政府层面，针对干旱胁迫以及其他非生物胁迫的研究进展，由于资金不足，一直落后于病害和虫害抗性领域的研究。历史上，农业用水的可获得性在政策制定层面往往只是次要考虑因素。近年来，由于美国和澳大利亚的重要农业产区多次遭遇严重干旱1,2，淡水可获得性问题已受到国家乃至国际层面的高度关注，从而促使更多资源被投入到主要粮食作物抗旱品种的研发研究中。尽管这种研究重点向抗旱主要作物的转移具有积极意义，但与许多植物研究领域类似，特色作物的研究在很大程度上仍被忽视。
目前，严重的干旱正在限制美国最大的生菜（Lactuca sativa L.）产区——加利福尼亚州的蔬菜生产3。短期气候模式与立法及司法行动，加之长期气候变化4,5，共同导致加州多个最富生产力的农业区域可用于农业的水资源减少。加利福尼亚州的生菜产业年产值达15亿美元，占全美生菜总产量的近80%3。叶类蔬菜具有较高的叶片含水量，而生菜尤其具有浅层根系6,7，这使得该作物极易受到水分胁迫的影响。随着灌溉用淡水供应日益紧张，与其他所有作物一样，培育抗旱性生菜品种将变得愈发重要8。
本方案介绍了一种对大量生菜种质资源进行初步筛选的方法，旨在鉴定出一批可能具有耐旱性的候选品系，用于生理学、分子生物学和遗传学研究，以明确具体的耐旱性状。这些候选品系也可直接作为耐旱性来源，应用于育种项目中，以提高商业栽培品种的水分利用效率。本方案的制定特别针对在大规模种质资源筛选过程中常遇到的挑战，尤其是空间和人力方面的限制。此外，本方案虽专为生菜筛选而设计，但已成功改编并应用于菠菜（Spinacia oleracea）种质资源的潜在耐旱性筛选，并可进一步简单修改后用于任何叶用蔬菜作物的筛选。
在启动抗旱性筛选之前，一个重要的考虑因素是明确该方法的适用范围及其局限性。本实验方案旨在提供一种快速方法，以便从大量种质资源中快速高效地筛选出数量可控的候选种质，用于后续更集中、更深入的研究，以鉴定个体的抗旱性状。本方案通过快速诱导严重水分胁迫来处理植物，这与田间条件下常见的缓慢诱导、中等强度且持续的干旱胁迫有所不同。这两种水分胁迫事件（快速脱水与自然干旱）在植物体内引发的响应并不完全相同9，可能导致某些材料在后续试验中被排除。尽管如此，这两种胁迫事件之间仍存在一定的重叠10，因此本方案仍可作为有效手段，用于从大量种质资源中识别潜在的抗旱种质。然而，仅依靠本方案尚不足以高度可靠地鉴定出在田间水分胁迫条件下具有持久抗旱性的种质资源，但它代表了在快速筛选叶用蔬菜潜在抗旱性状方面的重要进展。
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方案
1. 种植
- 将育苗盘（128 孔；28 × 54 cm，孔穴为 3 cm 见方，深 5 cm）装满育苗基质。为确保各孔填充均匀，可用一个空育苗盘按压基质以压实。
- 在每个孔穴中播种 2–3 粒生菜种子，播种深度约为 ¼ 英寸（约 0.6 cm）。将所有实验品系种植在重复的育苗盘中，以便为干旱试验同时提供干旱胁迫处理组和对照组育苗盘。
- 将育苗盘放入无孔的底盘中。
- 浇透水后，用倒置的育苗盘或塑料罩覆盖。通常在 48–72 小时内完成萌发。萌发后移除覆盖物，并将育苗盘移入温室。
注意：本方案也可在人工气候室中进行。
2. 植物生长与养护
- 根据需要在萌发后1-4周内进行浇水，通常每周2-3次，通过注满底部托盘使土壤充分饱和（约1小时） 长时间将植株浸泡在水中可能对植物健康和根系发育产生不利影响，并可能干扰干旱筛选实验。
- 每周使用商品化可溶性20-20-20肥料按1.5茶匙/加仑的浓度对育苗盘进行一次施肥。
- 发芽后1至2周，将幼苗稀植于育苗盘中，每穴一株。
3. 启动干旱胁迫
- 当植株生长至四周大时，将育苗盘分为两组。对其中一组施加严重水分胁迫，另一组作为充分供水的对照组。在整个实验过程中，对照组的浇水方式同步骤 2.1。开始干旱胁迫时，停止对所有育苗盘施肥，直至实验结束。
- 实验性干旱期持续一周。在干旱胁迫试验的第一天（第 0 天），将所有下层育苗盘注满水，使插盘中的土壤完全饱和，然后排干水分。在胁迫开始前立即饱和土壤，有助于尽量减少插盘各孔之间土壤含水量的差异。
4. 进行基础干旱胁迫筛选并测定相关参数
注意：以下步骤概述了如何采集在干旱筛选过程中将记录的三项生理指标，而表1提供了干旱胁迫试验期间每天所进行测量的时间安排。
- 在试验的第0、2、4天测定叶片相对含水量（RWC）。
- 从托盘中剪取一株生菜植株，并取下2片叶片。
- 使用#9打孔器（直径约1.6 cm）从每片叶片上打取3个叶圆片，将所有叶圆片合并为一个样品。
- 称量叶圆片，此重量即为RWC计算中的鲜重（FW），然后将叶圆片放入培养皿中。
- 向培养皿中加入适量蒸馏水，使所有叶圆片漂浮于水面，以充分水化叶圆片，获取RWC分析所需的膨压重（TW）。将叶圆片在室温（RT）下漂浮24小时。
- 从培养皿中取出已充分水化的叶圆片，用纸巾轻轻擦干叶圆片表面，然后称重。记录此重量为膨压重（TW），用于RWC计算。
- 将叶圆片置于开放的培养皿中的实验用纸巾或滤纸片上，在55 °C恒温箱中烘干24小时。
注：纸巾可防止叶圆片在干燥过程中粘附于培养皿表面。 - 称量干燥后的叶圆片，记录为干重（DW），用于RWC计算。
- 采用Smart和Bingham所述的Weatherley公式计算RWC11,12。
RWC = (FW - DW / TW - DW) × 100
FW = 鲜重，TW = 膨压重，DW = 干重 - 对试验中的每种种质和处理重复步骤4.1。
- 从干旱胁迫试验第1天开始，每天记录一次植株萎蔫情况，直至所有植株均出现萎蔫（通常为第4或第5天）。
- 恢复阶段与生长差异
- 第6天结束干旱胁迫期，胁迫植株进入恢复阶段。向底部托盘加水，使经干旱胁迫的托盘浸泡24小时，然后恢复至与对照组托盘相同的常规浇水程序（步骤2.1）。
- 让所有植株恢复生长10天。
- 在干旱胁迫后第10天，收获每株植物的全部地上部分，称量并记录其鲜重。
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结果
在进行大规模筛选以根据所需实验性状对群体进行分离时，例如本实验方案中的干旱胁迫响应，所获得的数据将表现出较大差异，从极度敏感至可能具有抗旱性，以及介于两者之间的各种表型。图1展示了本实验方案可能获得的结果类型。图中数据包含了三种不同类型生菜（罗马生菜（cos）、结球生菜和散叶黄油生菜）的代表性栽培品种。尽管此处仅展示了三种生菜类型的数据，但本实验方案是在对数千份生菜和菠菜种质资源（涵盖大多数类型）进行筛选过程中开发完成的。除上述三种生菜类型外，该方案还成功用于筛选红叶和绿叶散叶生菜、茎用生菜，以及近缘种Lactuca serriola的种质资源，同时还适用于无直接亲缘关系的叶用蔬菜菠菜。作者利用本方案产生的数据，将超过4,000份的生菜种质资源缩小至200个候选品种，用于后续田间试验。
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讨论
筛选实验的样本数量考量。
所需样本数量应根据本实验数据的预期用途来确定。如果希望获得可用于发表的高质量结果，建议从每个品系中分别收获3株独立的植株（3个生物学重复），并至少进行2次技术重复，以提供足够数量的数据点用于高质量的统计分析。如果目标仅仅是快速筛选大量候选种质材料，以便后续开展更严格或更复杂的水分胁迫实验，则可能需要较少的样本数或重复次数。样本数量必须在种植时即确定。
育苗盘中种植布局及土壤干燥的注意事项。
一个非常重要的考虑因素是，穴盘边缘孔位中的土壤比内部孔位干燥得更快，因此应避免仅从穴盘内部取样收获植株而导致结果产生偏差（图2）。如果只从内部孔位收获植株，可能会影响整个穴盘的种植布局。在本实验方案开发过程中进行的筛选试验中，每个穴盘种植了3至6份不同的种质材料，并设有一个对照莴苣品种。在特色作物中进行抗旱性筛选的一个挑战是，通常缺乏已知的抗逆性强或敏感的种质...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢加州食品与农业部对本项目提供的资助，该资助促成了本实验方案的开发。CDFA SCB11019。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 128孔穴盘 | T.O. Plastics Hummert International | 11-8595-1 | 可使用任意品牌的穴盘，但所有试验应保持使用相同类型的穴盘。 |
| 下层托盘（展示托盘） | T.O. Plastics Hummert International | 11-3305-1 | |
| 育苗基质（Sunshine Mix #5） | Sunshine Hummert International | 10-0467-1 | 若将本方案应用于其他作物，可能需要更换不同的基质。菠菜试验中使用的是Sunshine Mix #4。 |
| 肥料（20-20-20） | Jack's：专业水溶性肥料 Hummert International | 07-5915-1 | 可使用任意类型的肥料，根据具体作物需求调整肥料种类。 |
参考文献
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430(2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
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重印与许可
