半高通量筛选潜在的抗干旱的生菜（莴苣）种质资源

摘要

该方案的开发是为了筛选叶菜生菜 （Lactuca sativa L.） 的大型种质集的耐旱性，以确定用于生理学、分子和遗传学研究的小型候选生菜库，以确定潜在的耐旱性状以及育种计划。

摘要

该协议描述了一种方法，通过该方法筛选了大量绿叶蔬菜生菜 （Lactuca sativa L.） 种质，以寻找可能的耐旱性状。 农业用淡水的可用性是美国以及世界许多地区日益关注的问题。短期干旱事件，加上对水资源供应监管的监管干预，再加上长期气候变化的迫在眉睫的威胁，可能导致许多重要农业地区的降水减少，这增加了加快种植适应于提高用水效率的作物的必要性，以便在未来几年维持或扩大生产。 该协议并不是在生理或分子水平上识别生菜耐旱性状的分步指南，而是通过筛选数千种不同的生菜品种来开发和完善的方法。 这种筛选的性质部分基于简化的测量，只关注三个水分胁迫指标：叶片相对含水量、枯萎和干旱胁迫后植物生长的差异。快速筛选大型种质资源库的目的是将候选库缩小到可以应用更密集的生理、分子和遗传方法来鉴定实验室或田间特定耐旱性状的程度。 候选物种也可以作为耐旱性状的来源直接纳入育种计划。

引言

几十年来，

灌溉用水的可用性一直是美国和全球关注的问题，但对干旱胁迫以及其他非生物胁迫的反应的研究落后于工业、学术和政府层面的疾病和昆虫抗性领域的工作，这主要是由于缺乏资金。农业用水历来只是政策制定者层面的事后才想到的。 最近，由于美国和澳大利亚重要农业生产区发生了几次严重干旱，^1,2 淡水供应在国家和国际层面都成为人们关注的焦点，导致更多的资源被用于研究开发主要粮食作物的耐旱品种。 虽然这种将重点转向耐旱主要作物的开发是有益的，但与植物研究的许多领域一样，特种作物在很大程度上被抛在了后面。

严重的干旱目前正在限制加利福尼亚州的蔬菜生产，加利福尼亚州是美国最大的生菜 （Lactuca sativa L.） 产区³. 这些短期天气模式，加上立法和司法行动以及长期气候变化^4,5 结合在一起，导致加州许多生产力最高的地区可用于农业用水的减少。加利福尼亚州的生菜生产是一个价值 15 亿美元的产业，占美国生菜产量的近 80%³。 叶菜的叶子含水量高，尤其是生菜，根系较浅^6,7，这使得作物容易受到水分胁迫。与所有作物一样，在生菜中，随着灌溉淡水供应变得更加受限，耐旱品种的开发将变得越来越重要⁸。

该协议规定了一种方法，通过该方法对大量生菜种质进行初步筛选，以确定一组潜在的耐旱候选品系，用于生理学、分子和遗传学研究，以确定特定的耐旱性状。 这些候选品种也可以直接用作育种计划中耐旱的来源，以提高商业品种的水分利用效率。 该方案是专门为解决在广泛种质集合的任何筛选过程中出现的挑战而开发的，尤其是空间可用性和劳动力问题。 此外，所提出的方案是为用于生菜而开发的，但已成功适应用于筛选菠菜 （Spinacia oleracea） 的种质集合的潜在耐旱性，并且可以简单地修改以筛选任何叶菜作物。

在开始耐旱筛选之前，一个重要的考虑因素是了解这种方法是什么，不是什么。 该协议旨在代表一种快速方法，通过该方法，可以快速有效地将大型种质库缩小到可管理数量的候选种质，用于更集中和彻底的研究，以确定个体耐受性状。 该协议使植物承受快速诱导的严重水分胁迫，而不是在田间条件下观察到的更自然的缓慢诱导的中度持续干旱胁迫。 在这两种类型的水分胁迫事件（快速脱水与自然干旱）期间，植物内部诱导的反应类型并不相同⁹，这可能导致某些材料被排除在将来的试验之外。 尽管这两个胁迫事件并非没有重叠¹⁰，并且该协议应该作为识别大型集合中包含的潜在耐旱种质的有效方法。 仅凭该方案不应被认为足以高度确定在田间水分胁迫条件下包含持久耐旱性的种质，但它代表了在快速筛选绿叶蔬菜潜在耐旱性状方面向前迈出的重要一步。

方案

1.种植

1. 填写穴盘（128细胞; 28×54厘米与细胞3厘米见方的5厘米深）带插头的土壤结构。为了帮助细胞均匀填充使用空穴盘压缩土壤中的每个托盘。
2. 植物种子生菜¼英寸深入每个细胞2-3种子。工厂所有的实验线的复制盘，以提供一个干旱强调和控制托盘干旱试验。
3. 将穴盘成无孔基盘。
4. 水盘和盖倒托盘或塑料圆顶。发芽通常发生在48〜72小时。发芽后取下盖子和移动托盘到温室。
   注：此协议也可以在生长室进行。

2.生长和植物护理

1. 根据需要1-4周发芽后的水盘，通常是2-3倍每周填写下层纸盒，并允许土壤趋于饱和（约1小时），光线坐长时间水[参考译文]这可能植物健康和根系发育产生负面影响，并可能影响干旱屏幕。
2. 施肥盘每周一次与商业水溶性肥料20-20-20混合的1.5小勺/加仑的速度。
3. 薄盘，以每单元1-2周一个工厂后发芽。

3.起爆干旱胁迫

1. 当植物四个周龄独立纸盒分为2组。受一组严重缺水。使用以及浇水控制其它纸盘。水的对照组如在步骤2.1在整个实验。在干旱胁迫的开始暂停施肥所有托盘的实验的剩余部分。
2. 实验干旱时期发生在一个星期。在干旱胁迫试验（0天）的初始日填补所有较低塔板与水，并允许塞状育苗盘的土壤变得完全饱和，然后从盘排水。之后的t的开始之前饱和土壤他紧张时期，将有助于最大限度地减少单个细胞的穴盘中的土壤水分的任何变化。

4.开展基本干旱胁迫屏幕采用的参数进行测量

注：以下步骤概述如何收集三个生理测量，将被记录在干旱屏幕的过程中，而表1提供对干旱胁迫试用期的每一天采取的测量的时间表。

1. 测量叶片相对含水量（RWC）在天0，2，4审判。
   1. 从托盘夹生菜厂，并删除2叶。
   2. 冲从每个叶片用＃9软木螟（〜1.6厘米直径）3盘。结合叶冲作为一个样本。
   3. 权衡的叶盘，这是用于计算RWC的鲜重（FW）的值，然后将盘在一个培养皿。
   4. 加入足够的蒸馏水至板所有嗷嗷所有叶盘浮动。这是充分滋润叶盘收集肿胀的权重RWC分析。让叶盘漂浮24小时，在RT。
   5. 从板中取出现在完全水合叶盘和称量盘前轻轻擦干叶盘用纸巾的外部。记录这些权重肿胀重量（TW）的RWC计算。
   6. 在纸的实验室地点叶盘在55℃下擦拭或滤纸盘在一个开放的培养皿中，并干燥培养箱24小时。
      注意：纸张防止叶盘从干燥过程中附着在陪替氏培养皿。
   7. 称取干叶盘并记录干重（DW）为RWC计算。
   8. 使用RWC Weatherley公式所描述的智能和宾汉姆^11,12计算。
      RWC =（FW-DW / TW-DW）* 100
      FW =鲜重，TW =肿胀重，DW =干重
   9. 每个种质和治疗的试验重复步骤4.1。
2. 记录植物枯萎，每日一次开始对干旱胁迫试验的第1天，当植物的100％的枯萎，一般4天或5结束。
3. 恢复阶段和增长差
   1. 第6天，得出结论：干旱胁迫期间和强调植物进入审判的复苏阶段。下部托盘装满水，并允许干旱强调托盘恢复标准浇水时间表前浸泡24小时，步骤2.1，为控制托盘。
   2. 让所有的植物恢复为10天。
   3. 10天后干旱胁迫收获上述每一种植物的地上部分全部并记录鲜重。

结果

当为了由所希望的实验性状偏析人口，在该协议干旱应激反应的情况下，执行一个大屏幕，生成将相应地从非常不同的数据强调易受可能耐旱和之间的所有点。 图1包含表示结果，可以从这个协议来预期的类型图。三种不同类型的莴苣（莴苣（COS），crisphead和butterhead）代表品种都包含在显示的数据。而代表只有三个生菜类型的数据都在这里显示这个协议是成千上万的莴苣和菠菜种质资源在大多数类型的筛选过程中开发的。除了 ​​这三种类型的生菜前面提到这个协议成功地用于筛选的红色和绿色的叶和茎莴苣类型一起从密切相关的检疫性杂草毒莴苣物种种质以及无关乐AFY绿色蔬菜菠菜。笔者使用该协议缩小4000生菜收集到的200生菜品种田间试验的候选池中使用时产生的数据。

示出图1代表结果数据代表三个生理测量的包括在此...

讨论

样本数量的考虑屏幕。

所需样品的数量应根据数据从该屏幕的期望用途。如果出版物质量结果所需的建议收获来自每个线路3的个体植物（3次生物学重复），并执行一个最少的2次重复实验，得到足够的点质量的统计分析。如果期望的结果是简单地快速缩小候选种质的大池，以便执行更严格的或复杂的水胁迫实验，更少的样品和或重复可能是必要的。所需样品的数量必须在种植时决定。

种植布局和土壤干燥盘的考虑。

其中一个很重要的考虑是，在穴盘边缘的土壤细胞就会枯竭速度超过了内部细胞和护理应注意避免偏差在结果中只从托盘内部（ 图2）收获的植物。只收获从内部细胞工厂将有可能影响到托盘的种植布局。期间，其中该协议被开发3至6个独特的种质是每穴盘种植连同一个控制莴苣品种的屏幕。一种在一个特殊作物筛选干旱耐受的挑战往往存在没有知道胁迫耐受性或易患种质使用作为阳性或阴性对照。当没有正面或负面的控制可作为该协议的开发利...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
插头托盘 128	T.O. Plastics Hummert International	11-8595-1	任何品牌的插头托盘都可以使用，但所有试验都使用相同样式的托盘。
下部托盘（展示托盘）	T.O. Plastics 悍马国际	11-3305-1
插播混合物 （Sunshine Mix #5）	阳光 悍马国际	10-0467-1	如果将此方案应用于不同的作物，则可能需要更换不同的混合物。阳光混合物 #4 用于菠菜试验。
肥料 （20-20-20）	Jack's： 专业水溶性肥料 Hummert International	07-5915-1	任何肥料都可以使用，根据需要调整类型，以适应特定的作物需求。