单核细胞增生李斯特菌 可导致孕妇胎儿感染以及易感人群的脑膜炎。某些细菌亚群可定植于心脏组织，引起患者及实验动物的心肌炎。本文介绍了一种用于评估的实验方案 单核细胞增生李斯特菌 心肌细胞侵袭 体外 感染动物心脏定植情况。
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摘要
摘要
Listeria monocytogenes 是一种革兰氏阳性兼性胞内病原体，可导致免疫功能低下者、老年人及孕妇发生严重的侵袭性感染。人类单核细胞增生李斯特菌病最常见的临床表现包括脑膜炎、脑炎以及胎儿流产。尽管相关报道较少，但侵袭性 L. monocytogenes 感染累及心脏仍是一个重要的继发性病变。即使接受治疗，由心脏受累引起的死亡率仍可高达35%，然而目前对 L. monocytogenes 在心肌组织中的定植及其所致病理变化知之甚少。此外，最近研究发现，L. monocytogenes 的某些亚群具有更强的能力侵入并在心肌组织中增殖。本实验方案详细描述了可用于评估 L. monocytogenes 分离株心肌趋向性（cardiotropism）的体外（in vitro）和体内（in vivo）方法。文中提供了在组织培养条件下感染H9c2大鼠心肌母细胞以及测定感染小鼠心脏中细菌定植情况的方法。这些方法不仅有助于识别在感染动物中心肌组织具有定植潜力的菌株，还可能促进发现促进细菌侵入心肌细胞和/或驱动心脏病理改变的细菌基因产物。此外，这些方法也支持对多种 L. monocytogenes 菌株之间心肌趋向性的直接比较。
引言
Listeria monocytogenes 是一种革兰氏阳性胞内病原菌，可在易感人群中引起严重疾病，包括老年人、孕妇、艾滋病病毒/艾滋病患者以及接受化疗的个体1。这些人群的感染通常是由于摄入了受污染的食品所致，且大多数感染与大规模食源性暴发相关2,3。在人类和其他哺乳动物中，L. monocytogenes 能够穿过小肠上皮屏障，并被转运至肝脏4,5。动物模型研究表明，摄入的细菌可在肠绒毛内复制，并通过门静脉进入肝脏，或经肠系膜淋巴结扩散进入血液循环，从而通过血行播散至肝脏和脾脏6,7。在肝脏和脾脏中，该细菌能够介导其被专业吞噬细胞以及定居的实质细胞摄取，并迅速在这些器官内建立感染。随着细菌载量的增加，大量细菌重新释放进入血液，进而可进一步定植于中枢神经系统和胎盘（如存在）等易感组织。这些部位的定植导致了人类单核细胞增生李斯特菌病最常见的临床表现，包括脑膜炎、脑炎以及胎儿流产2。
最近研究发现，L. monocytogenes 的某些亚群具有更强的能力侵入并在心肌组织中复制8。心脏受累的表现多样，可从心内膜炎和心包炎，到伴有传导异常的暴发性心肌炎9-13。每年由 L. monocytogenes 引起的心脏病例总数较低，但由于此类感染表现通常未被充分认....
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方案
1. 单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）菌株的保存与培养条件
- 通过高压灭菌脑心浸出液琼脂（BHI）并将其倒入培养皿中，制备固体培养基。将平板在室温下过夜干燥，然后在37 °C下再次过夜干燥。
- 使用无菌接种环，从先前制备的冷冻保存菌种（在BHI液体培养基中含20%甘油，于-80 °C保存）或从含有已分离菌落的琼脂平板中获取少量单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）样本。
- 采用无菌操作技术，对样本进行划线以获得单菌落分离。确保在交叉划线之间对接种环进行灭菌，以防止过多的交叉污染，并确保被评估菌株的单个菌落得以分离。将平板在37 °C下培养过夜。
- 使用无菌接种环挑取一个分离菌落，接种至14 ml聚苯乙烯管中的2 ml BHI液体培养基（不含琼脂）中。
- 进行检测或感染实验时，将液体培养物在37 °C培养箱中静置（不振荡）培养过夜；若用于保存培养的分离菌株，则在37 °C下以180–200 rpm振荡培养过夜。可通过向培养物中加入甘油至终浓度20%，并将密封的试管长期保存于-80 °C，以实现菌种保藏。
2. H9c2 心肌样细胞的保存与培养条件
- 购买或获取 H9c2 细胞的冻存株，以及含高糖和丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰....
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结果
L. monocytogenes 的部分分离株在细胞培养和小鼠感染模型中表现出对心肌细胞更强的侵袭能力。图1展示了将菌液点种于琼脂培养基后细菌菌落可能呈现的形态。该方法可在不使用大量琼脂平板的前提下，准确评估样品中的菌落形成单位（CFU）。图2展示了一项基于组织培养的实验示例，比较了菌株10403S与菌株07PF0776侵入心肌细胞的能力。经庆大霉素处理后，从感染07PF0776菌株的H9c2心肌细胞中回收的细菌CFU数量是感染10403S菌株组的两倍以上。使用该实验方法，通常可观察到嗜心性菌株的侵袭能力差异达2至4倍。图3展示了感染后第3天从小鼠肝脏、脾脏和心脏组织中回收细菌的示例。用嗜心性菌株07PF0776或菌株10403S感染小鼠后，从肝脏和脾脏中回收的细菌数量相近；然而，感染07PF0776菌株的小鼠更可能从心脏中检测到细菌，且该器官中的细菌载量更高。
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讨论
单核细胞增生李斯特菌 是一种广泛存在且已被充分表征的人类病原体，能够引起多种不同的疾病表现15该细菌此前已被报道具有跨越屏障的能力，例如血脑屏障和胎盘-胎儿屏障，从而分别到达并定植于中枢神经系统和发育中的胎儿。 体内 生物体定植这些组织的能力通常由另一种能力补充 体外 侵入构成靶器官的代表性培养细胞的能力。例如，脉络丛上皮细胞的侵入与该生物体定植中枢神经系统的能力相关。16；绒毛滋养层外植体已被用于代表母胎屏障17本方案中描述的方法可用于评估细菌在体外培养的心脏细胞中的侵袭能力，以及比较不同分离株在心脏中的定植情况与在肝脏和脾脏中定植的相对水平。
本方案包含多个关键步骤，其中最为关键的是使用正确浓度的细菌菌落形成单位（CFU）感染生长在盖玻片上的组织培养细胞或感染动物。如果不同孔之间或动物之间的细菌CFU数量未得到准确控制，则无法对样品进行直接比较。为确保细菌CFU数量的准确估算，必须通过将最终稀释液直接涂布于培养基平板上进行培养，来反复核对用于制备接种物的稀释系.......
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
本研究由公共卫生服务基金 AI41816 和 AI099339（N.E.F.）以及 NIAID 资助的 F31AI094886-01（P.D.M.）支持。研究内容仅由作者负责，不一定代表资助机构的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Difco | BHI 肉汤基础培养基 | 237200 | 2 kg 脑心浸液粉末（不含琼脂） |
| Difco | 琼脂 | 214510 | 2 kg 颗粒状琼脂 |
| Difco | BHI 琼脂 | 241810 | 2 kg 脑心浸液琼脂粉（含 7.5% 琼脂） |
| in vitrogen | LB肉汤基础培养基 | 12975-084 | 2 kg LB液体培养基干粉（不含琼脂） |
| Fisher | 玻璃盖玻片 | 12-545-80 | 12 mm 玻璃盖玻片 |
| Falcon | 24孔组织培养板 | 35-3047 | 24孔，等离子处理过的组织培养板 |
| Falcon | 14 mL 聚苯乙烯管 | 352051 | 14 ml 聚苯乙烯管 |
| Falcon | 96孔U型底板 | 35-3077 | 未经组织培养处理的96孔板 |
| 康宁 | 0.05% 胰蛋白酶，0.53 mM EDTA（1×） | 25-052-CI | 组织培养用胰蛋白酶EDTA储存液 |
| 康宁 | DMEM（高糖，高丙酮酸） | 15-013-CU | 不含FBS、谷氨酰胺和抗生素的DMEM培养基 |
| 康宁 | 青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液 | 30-009-CI | 用于组织培养的青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺储备液混合物 |
| 康宁 | 庆大霉素 | 30-005-CR | 50 mg/ml 链霉素组织培养储备液 |
| Cellgro（康宁） | L-谷氨酰胺 | 25005197 | 不含抗生素的L-谷氨酰胺储备液 |
| 丹维尔 | 75 cm² 培养瓶 | T1225 | 75 cm2 组织培养处理过的锥形瓶 |
| 丹维尔 | 1.5 mL 微量离心管 | 2013004 | 1.5 ml 微量离心管 |
| ATCC | H9c2 心肌成肌细胞 | CRL-1446 | 大鼠心肌成肌细胞 |
| Hyclone | 胎牛血清 | SH30070.63 | 胎牛血清 |
参考文献
- Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
- Drevets, D. A., Bronze, M. S.
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重印与许可
