利用自动化图像处理方法对小鼠社交行为的实验评估

摘要

本方案描述了一种量化小鼠社交行为的方法。小鼠在特殊笼具中活动和相互作用时被录像，通过视频处理可实现对社交行为的自动化定量分析，具有极高的准确性和可靠性。

摘要

小鼠是测试旨在提高社交能力药物的首选模式生物。本文介绍一种量化小鼠社交能力的方法，将待测小鼠置于标准化装置中，并在三个不同阶段（称为第I、II、III阶段）评估其相关行为。

该装置分为三个区域（见图1），左右两个区域各有一个倒置的杯子，可用于放置一只小鼠（称为“刺激小鼠”）。

在阶段I中，将待测小鼠放入笼内，通过其在各隔间之间穿梭的次数来表征其活动能力。在阶段II中，将一只刺激小鼠置于其中一个倒置杯下，通过待测小鼠在放置有被围住刺激小鼠的杯子附近停留的时间长短来量化其社交性。 与 倒置的空杯。在第三阶段，移除倒置的杯子，两只小鼠可自由互动。通过测试小鼠在第三阶段中朝向刺激小鼠的社交接近次数，以及其回避刺激小鼠发起的社交接近的次数，来量化测试小鼠的社交性。

自动分析视频可检测测试小鼠的鼻部位置，从而确定第一阶段和第二阶段中所有描述的社会性行为指标（在第三阶段中，接近行为由系统自动识别，但需人工分类）。为定位鼻部，系统首先将空笼子的图像从视频的每一帧中进行数字减影，然后对所得图像进行二值化处理以识别小鼠的像素区域。随后自动去除小鼠尾巴部分，并确定剩余区域中距离最远的两个点，这两个点分别接近于鼻部和尾根。通过分析小鼠的运动轨迹并结合连续性判断，最终确定鼻部位置。

图 1. 三阶段社交行为评估。 阶段 I（上）：测试小鼠对笼具的适应过程。阶段 II（中）：测试小鼠在笼内自由活动，而刺激小鼠被置于倒置的杯状容器中。阶段 III（下）：测试小鼠与刺激小鼠均可自由活动并相互接触互动。

引言

社交能力受损是包括自闭症谱系障碍（ASDs）在内的多种神经发育障碍的主要症状领域之一^1,2。它严重限制了患者建立人际关系的能力，并对患者、家庭及照护者造成重大影响^2,3。

为了更好地理解社交能力受损的潜在机制并开发治疗方法，研究人员已对多种小鼠模型进行了研究^1,4–9。其中一种品系是BALB/c小鼠，这是一种近交品系，表现出显著的低社交性，类似于自闭症谱系障碍（ASD）患者所呈现的特征^8–12。例如，与Swiss Webster对照品系相比，BALB/c小鼠表现出更少的社会接近行为，且通常对刺激小鼠的社会接近行为表现出负面反应（例如，社会回避）¹⁰。

为了检验某种拟议的治疗方法是否能有效提高社交能力，需要采用客观的测量方法。一个被广泛接受的框架是使用具有三个隔室的标准装置来分析社交能力（见图1）。

左右两个隔室中各包含一个倒置的金属丝杯，用于放置具有社会显著性的刺激小鼠。将测试小鼠放入装置中，共进行三个10分钟的时间段（实验I-III）；实验I用于评估测试小鼠的运动活性，而实验II和III则用于评估测试小鼠社会行为的不同方面。

在阶段I中，让测试小鼠适应实验装置。在此阶段，记录测试小鼠在不同隔室之间穿梭的次数。需要注意的是，使用标准三隔室装置获得的社会性行为测量结果依赖于运动活动能力，而运动活动能力降低可能干扰对社会性数据的解释。

在第二阶段，测试小鼠可自由活动，而一只刺激小鼠被放置于其中一个倒置杯下（位置进行交叉平衡）。刺激小鼠为4周龄非近交系雄性ICR小鼠，与测试小鼠在年龄和性别上相匹配。刺激小鼠被置于指定为社交区一侧的倒置杯内，另一只空的倒置杯则置于指定为非社交区的一侧。在第二阶段，通过比较测试小鼠在“社交”倒置杯附近（距离小于2 cm）停留的时间，来量化其社交行为 与 其在“非社交”倒置杯附近停留的时间，以及在社交区域停留的时间 与 其在非社交区域所花费的时间。与对社交倒置杯或社交区域无显著偏好的BALB/c小鼠相比，Swiss Webster对照小鼠在社交区域及社交倒置杯附近停留的时间显著更长。¹².

在第三阶段，测试小鼠与刺激小鼠可自由互动（倒置杯被移除）。在测试小鼠与刺激小鼠自由互动的第三个10分钟阶段中，可稳定获取并分析社会性行为、刻板行为以及在各区域之间转换的指标。本报告中，测试小鼠的社会性通过以下两个指标进行量化：1）测试小鼠对刺激小鼠发起社会性接近的次数，其中社会性接近定义为测试小鼠以鼻部朝前的方式向前移动，使鼻部与刺激小鼠的距离小于2 cm；2）刺激小鼠对社会性接近的回避次数。当测试小鼠在刺激小鼠接近时转身或移开，或暂时停止移动（“僵直行为”），则判定测试小鼠回避了接近行为。与瑞士韦伯斯特对照品系相比，BALB/c小鼠对刺激小鼠的社会性接近次数减少，且对刺激小鼠社会性接近的负面反应次数增加¹⁰。

行为录像的评估传统上是手动完成的，即，通过仔细观看录像（可能以降低的速度播放），并使用秒表记录小鼠停留在特定隔室或倒置杯附近的时间¹⁰。该方法需要反复观看录像，因此非常耗时。此外，评估的准确性受限于评分者的反应时间以及判断小鼠是否位于倒置杯2 cm范围内的能力。近期研究发现，两种化合物（D-丝氨酸和D-环丝氨酸）在恢复BALB/c小鼠社交行为方面表现出有效性^9,10,12。已知这两种成分均可调节NMDA受体，而NMDA受体在社交行为中起核心作用^2,12。目前已知大量化合物能够以多种明确的方式调节NMDA受体活性，鉴于在自闭症谱系障碍（ASD）治疗方面取得突破的潜力，加快对这些化合物的评估成为优先任务，因此迫切需要一种快速、自动化的评估方法。

以下介绍了一种用于评估小鼠社交行为的自动分析流程。该流程对小鼠视频的所有帧进行图像处理，以识别单只或多只小鼠的位置。在第 I 和第 II 阶段，该方法进一步检测小鼠鼻部位置，并利用该信息计算社交行为指标。在第 III 阶段，系统可自动检测所有接近行为，但需人工对行为类型进行分类（如社交接近、社交回避或其他）。

方案

为便于说明，本方案分为两个部分：1）实验步骤和2）自动化分析。所有动物均按照《实验动物护理与使用指南》¹⁵ 进行处理，所有操作程序均经机构动物护理与使用委员会批准。

1. 实验步骤

1. 设置实验笼，该笼为一个黑色无反光的有机玻璃矩形箱（52 × 25 × 23 cm³），分为三个隔间：社交区、非社交区和中间的中性隔间（图1）。在第I阶段和第II阶段（如下所述）的实验过程中，将倒置的金属丝杯放置于两端的隔间内，并在第II阶段中将刺激小鼠安置于其中一个杯下。
2. 调整摄像机位置，使整个实验笼位于视野范围内。由于光照可能干扰小鼠行为，需通过白炽灯提供间接照明，使笼内照度不超过3.5 lux（在笼底向上测量）。同时使用小鼠无法感知但摄像机可检测的红外光源。所有视频均以720 × 480标准清晰度进行录制。
3. 录制一个空笼的单帧图像，用于后续图像处理（称为“参考帧”），并保存为灰度图像。
4. 第I阶段：将待测小鼠放入实验笼中，并在笼上方挥手示意实验开始（参见自动分析部分）。持续录制10分钟视频。10分钟后，将小鼠放回其原始饲养笼中。
5. 第II阶段：将刺激小鼠置于其中一个倒置的金属丝杯下方（左右位置需交叉平衡）。
6. 使用“社交左侧”或“社交右侧”按钮，选择刺激小鼠位于左侧还是右侧的倒置杯下。
   注：放置刺激小鼠的倒置杯称为“社交杯”，另一个杯称为“非社交杯”。放置社交杯的隔间称为社交隔间，放置非社交杯的隔间称为非社交隔间，中间的隔间称为“中性隔间”。
7. 将待测小鼠放入实验笼中，并在笼上方挥手示意实验开始。录制10分钟视频。重要的是，在移除倒置杯开始第III阶段前，应先让小鼠在社交装置中适应一段时间。
8. 第III阶段：移除两个倒置杯，释放两只小鼠，使其可自由互动。在笼上方挥手示意实验开始。录制10分钟视频。10分钟后，将两只小鼠分别放回各自的饲养笼中。

2. 自动化分析

注意：第2节中的命令通过图形用户界面（见图2）发出，该界面控制我们的软件。此处我们解释软件所支持的逐步处理流程；该软件还能够在无需用户输入的情况下以批处理模式执行分析。

1. 对于每部影片，执行以下处理步骤：
   1. 加载视频（点击“加载”按钮）。
   2. 选择笼具配置，以便向分析程序告知笼具边界、区域边界和杯子位置。可从四种已保存的配置中选择其一，或手动调整所有坐标。
      注意：该配置通常在不同实验之间保持不变，因此可重复使用。
   3. 对视频的每一帧执行以下处理步骤（2.1.3.1–2.1.3.6）。
      1. 单击“灰度”按钮，将画面转换为灰度图像。
      2. 使用“减去”按钮对灰度参考帧（见步骤 1.3）进行数字减法。注意：此步骤的目的是使帧中除小鼠位置外的所有区域像素值接近于零。
      3. 通过将低于特定阈值的所有像素设为黑色、高于该阈值的所有像素设为白色，对帧进行二值化处理（点击“Binarize”按钮）。
         注意：由于小鼠像素的灰度值通常高于其余像素，因此小鼠像素将变为白色，其余像素变为黑色。最佳阈值取决于光照条件，可通过评估整段视频中小鼠的形态来确定。若阈值设得过低，小鼠轮廓会过大，导致不属于小鼠的像素也被标记为白色；若阈值设得过高，小鼠轮廓会过小，并可能碎裂为多个不相连的区域。在所记录的视频中，最佳阈值始终介于20至35之间（灰度范围为0至255）。
      4. 侵蚀¹³ 对二值化图像进行 e 次膨胀操作¹³ 2e 次，然后再次蚀刻 e 次，通过按“Erod/Dil”按钮。
         注意：本步骤的目的是去除尾部。对于所使用的分辨率（720 x 480），在所有情况下 e = 3 均适用。
         注意：软件会自动检测图像中是否存在手部（在录制视频期间，通过在画面中挥动手来表示一个阶段的开始）。如果图像中存在手部，由于手部远大于小鼠，二值化帧中的白色像素数量会异常增多。判断手部存在的条件是二值化帧中白色像素超过10,000个。软件通过检测手部运动发生的帧范围，确定阶段I、II和III的开始。
2. 在第 I 和第 II 次实验中，按以下步骤继续进行：
   1. 检测白色像素集中最大的连通组分（点击“LComp”）。注意：此步骤的目的是去除不属于小鼠的白色像素。 例如由第二阶段中刺激小鼠的运动引起。在几乎所有帧中，最大的连通组分都是小鼠。
   2. 单击“查找末端”以确定距离最远的两个白色像素（称为小鼠的“末端”）。
      注意：该软件会建立两端的连续性， 即，将第一帧中的每个末端与后续帧中的对应末端进行匹配。其基本原理是，由于图像帧以高帧率采集，末端在相邻帧之间的位移不会很大，因此正确的末端追踪方式应使各末端在帧间移动距离的总和最小化。详见“讨论”部分的详细说明。
   3. 确定小鼠的鼻端位置。
      1. 通过观察重心（COG）在连续帧之间的变化来确定小鼠的移动方向（COG 的运动即所有小鼠像素总和的运动）。
         注意：一组像素 p 的重心（COG）₁，……，p_n  x 坐标₁, .. , x_n   由以下定义：
         
         小鼠通常向前移动（即，朝向它们的鼻子）。在数百帧的片段中，头部/尾部检测始终具有很高的置信度。
         注意：软件会自动判断小鼠朝向所检测到的两个端点中的哪一端移动；该端点被识别为鼠鼻，并在视频中以红色圆圈标记。当每一帧中检测到的鼠鼻均以红色圆圈标出时，用户可检查检测质量。
3. 在第三阶段，继续按以下步骤进行：
   1. 检测白色像素的两个最大组分。
      1. 如果这两个组分的大小均适合小鼠，并且它们的重心（COGs）与前一帧中小鼠的重心位置相兼容，则将这两个组分视为两只小鼠。
      2. 若小鼠尺寸与前一帧相比变化不超过20%，则视为可接受；若连续两帧中重心（COG）之间的差值不大于小鼠在帧间时间内所能移动的最大距离，则认为这两帧的COG相容（该距离由小鼠最大移动速度决定，可在实验系列准备阶段通过分析多只单独小鼠的运动（如第I和第II阶段）来确定）。
         注意：如果两个最大组分的尺寸不符合小鼠的可接受范围，或它们的质心（COGs）与前一帧中的差异过大，软件将自动提高二值化阈值，直至这两个最大组分的尺寸处于可接受范围内，且其质心与前一帧的质心相匹配。
   2. 单击第一帧中的测试小鼠。使用2.3.1中的分析方法，识别第III阶段每帧中的测试小鼠和刺激小鼠。
   3. 在第三阶段中识别出一只小鼠对另一只小鼠进行社交接近的帧。注：软件通过自动检测小鼠之间的距离是否小于小鼠典型的互动距离（我们采用2 cm）来实现此步骤。
   4. 当软件播放检测到的测试小鼠接近行为的短视频片段时，点击按钮以判断该行为是否属于测试小鼠的社会性接近、社会性回避，或两者皆非。
      注意：如果已知哪只小鼠为测试小鼠，步骤 2.3.4 可实现自动化。然而，当小鼠彼此靠得太近（或相互攀爬）时，该信息会丢失；此外，我们尚未找到一种标记小鼠的方法，既能被我们的软件可靠识别，又不会影响其行为。因此，目前我们仍采用人工分类方式。
4. 为评估已处理的视频，使用“加载”按钮载入视频。
   1. 单击“开始第1阶段”以显示第1阶段的第一帧（或单击“开始第2阶段”以显示第2阶段的第一帧）。
   2. 点击播放/停止以播放和停止视频。
      注意：处理后的视频将显示小鼠的头部和尾部用不同颜色的圆圈标记。所有社交行为指标均在屏幕上实时显示，并随视频播放动态更新。
   3. 单击“Export”以 Excel 格式导出社交性数据。
   4. 单击“编译数据”以将文件夹中所有视频的所有数据汇编到单个 Excel 文件中。

结果

图3 显示了一个行为录像的彩色帧，其中笼子为空。小鼠尚未被放入笼中。图中叠加了杯子（社交和非社交）的位置以及各区域的边界。如图4所示，空笼的彩色帧被转换为8位灰度图像，并用作参考帧。该参考帧将从所采集录像的每一帧中减去。

图5展示了第一次实验期间视频中的某一帧图像，同样叠加显示了隔室边界和杯子的位置。将参考帧从样本帧中减去，所得结果称为差值帧，如图6所示。

图7 是差分帧的二值化版本（参见第2.1.3.3节）。该图还显示了鼻尖位置（红色圆圈）和尾基位置（灰色圆圈），这些位置由第2.2.4节确定。

一旦确定了视频每一帧中小鼠鼻尖的位置，就可以以任何所需的方式分析小鼠的运动轨迹。图8展示了视频中约1,000帧（约30秒）时间段内小鼠鼻尖的位置（白色圆圈）。

讨论

通过结合小鼠录像和自动视频分析，我们建立了一种经济、可靠且高通量的筛选技术。

将自动化分析的准确性与超过100个视频的手动分析结果进行了比较。在绝大多数视频帧（> 99%）中，小鼠的鼻尖均被精确识别。大多数（少数）误检对社交性测量结果无影响，因此约80%的视频无需任何校正。

在包含误检的视频中，最常见的问题是头部与尾部被混淆。因此，我们在软件中提供了一种简单的方法，用于切换视频片段中的头部与尾部。即使需要查看视频以检查并纠正所有误检情况，该检查也可在约3倍实时速度下完成，从而确保评估时间极短。对于小鼠未靠近任一圆柱体的视频片段，可采用更高的速度进行浏览。

所有自动和手动测定的社交性指标之间的一致性极佳（假设已对可能的误检进行了校正）。事实上，自动测定的社交性指标质量优于手动测定的结果，因为自动方法在确定距离和时间时始终采用客观标准，而人工评估则受限于人类感知能力和反应时间的局限。当回放速度较高时，这些局限更为显著，尽管提高回放速度有助于缩短评估所需时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）笼具	Norva Plastics, Norfolk, VA	定制	尺寸与布局详见文稿， 可根据需要调整。 使用非反光聚甲基丙烯酸甲酯材料，以利于图像处理
金属丝网杯	Kitchen plus	315	一个用于安置刺激用小鼠，另一个保持空置
视频摄像机	SONY	HDR-PJ790	可由任何具备 相似规格的摄像机替代
OpenCV（图像处理库）	Willow Garage	N/A	可使用任何现代图像处理库 进行替代。