利用荧光蛋白酶保护法（FPP）测定膜蛋白拓扑结构

摘要

本文介绍了一种用于确定活细胞中整合膜蛋白取向和拓扑结构的实验方案。该简单方案依赖于目标蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）融合形成的嵌合体对蛋白酶的选择性敏感性。

摘要

完整膜蛋白的正确拓扑结构和取向对其正常功能至关重要，然而目前许多膜蛋白的此类信息尚未明确。本文介绍了一种称为荧光蛋白酶保护法（FPP）的简单技术，可在活细胞中测定膜蛋白的拓扑结构。该方法相较于其他测定蛋白拓扑结构的技术具有多项优势：无需针对膜蛋白不同结构域的多种抗体，无需大量蛋白样品，且可在活细胞中直接进行。FPP 方法利用蛋白酶在空间上受限的作用，选择性降解与绿色荧光蛋白（GFP）融合的膜蛋白，从而判断其膜拓扑结构和取向。该方法适用于多种细胞类型，可用于测定线粒体、高尔基体、内质网以及内体/再循环系统等不同亚细胞器中膜蛋白的取向。将 GFP 融合标签标记于膜蛋白的 N 末端或 C 末端后，在目标细胞中表达，并使用去污剂皂苷进行选择性透化。皂苷可特异性地透化细胞质膜，而细胞内细胞器保持完整。暴露于胞质中的 GFP 片段可被蛋白酶选择性降解，而位于细胞器腔内的 GFP 片段则受到保护，不被降解并保持完整。FPP 检测方法操作简便，结果可快速获得。

引言

细胞质膜以及众多的细胞内膜结构作为屏障，分隔了两个水相区室。对于质膜而言，其分隔的是细胞外环境与细胞内环境；而对于细胞内细胞器，则是分隔了细胞质与细胞器腔内的空间。例如，内质网（ER）膜将内质网腔内氧化性环境与细胞质中的还原性环境分隔开来。¹膜蛋白在内质网相关的核糖体上合成，并在内质网膜内形成其最终的拓扑结构²蛋白质获得适当的膜取向和拓扑结构对其正常功能至关重要。正确的拓扑结构可使膜蛋白的相关结构域与其结合伴侣相互作用，确保关键的翻译后修饰得以发生，而对于质膜蛋白而言，还能使细胞与其所处环境进行相互作用并作出响应。要充分理解膜蛋白的功能，明确该蛋白在其所处膜中的取向显得尤为必要。 即其膜拓扑结构。除了获取基础科学知识之外，理解膜蛋白的拓扑结构以及蛋白质表面哪些区域暴露于不同环境之中，还具有显著的临床意义，因为膜蛋白构成了大多数药物靶点的主体。³直到最近，确定膜蛋白拓扑结构的方法仍需要投入大量时间和资金，或需要难以获得的试剂。

已采用实验方法和in silico方法来确定定位于质膜中的蛋白质的膜拓扑结构。自从首次基于单个氨基酸的疏水性评估来预测跨膜结构域以来³，目前互联网上已提供大量预测算法，仅需已知蛋白质的氨基酸序列即可进行预测。然而，这些建模程序通常依赖若干假设，而这些假设可能导致拓扑结构的错误指认^4,5。此外，尽管基于计算机的预测可初步确定跨膜区域，但并不总能判断蛋白质的氨基末端或羧基末端位于细胞质、细胞器腔内还是细胞外侧。即使计算能力不断提升，并采用了机器学习算法⁶，此类数据仍仅为模型预测，必须通过实验获得的数据加以验证。已有研究使用一组已知表位分布于整个蛋白质序列的单克隆抗体，通过比较细胞通透化前后抗体的免疫反应性，直接实验性地测定膜蛋白的拓扑结构。但该方法需要一系列特异性抗体，而这些抗体可能无法获得针对目标蛋白的适用版本。

另一种策略是在蛋白质的不同位置引入表位标签，例如 myc 或血凝素（HA），然后检测膜通透化前后免疫反应性的变化。除了免疫原性标签外，还曾采用酶标签（包括碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或 β-内酰胺酶）以及半胱氨酸扫描等化学修饰方法来确定膜蛋白的拓扑结构^7,8。另一种用于质膜蛋白拓扑作图的方法则采用了略有不同的表位标签策略。该方法使用的标签序列为 N-连接糖基化的共识序列 NXS/T。由于糖基化仅在该序列位于生物合成途径腔内时才会发生，因此可通过 SDS-PAGE 凝胶上分子量的偏移，轻松判断标签位于腔内还是胞质区室。该方法已应用于多跨膜离子通道 CFTR 的研究⁹。尽管上述所有方法均已被使用，但显然这些方法都需要投入大量分子生物学工作，以构建并测序多种不同的重组体。

确定位于细胞内细胞器中的跨膜蛋白的拓扑结构信息一直更具挑战性。然而，基于荧光的技术的应用使得膜拓扑结构的测定变得简单得多。双分子荧光互补（BiFC）技术依赖于荧光蛋白的两个非荧光片段之间的相互作用，从而恢复该荧光蛋白的荧光特性¹⁰。尽管该方法最初被用于在体内（in vivo）检测蛋白质-蛋白质相互作用¹⁰，但也已被用于测定植物细胞中膜蛋白的拓扑结构¹¹。然而，该方法同样耗时，因为它不仅需要构建目标蛋白的融合蛋白，还需要构建一系列靶向细胞质或细胞器腔的融合蛋白，并且需要事先了解目标蛋白所处的细胞内膜系统。

已有文献描述了一种测定膜蛋白拓扑结构的替代性且更简单的方法¹²。该检测方法称为荧光蛋白酶保护法（Fluorescence Protease Protection, FPP），需要构建绿色荧光蛋白（GFP）与目的基因的融合蛋白。该方法的原理基于非特异性蛋白酶对GFP部分的相对可及性：当GFP位于细胞器腔内时，其受到保护而免于蛋白水解；而当其位于细胞质中时，则暴露于蛋白酶作用之下。因此，若目的蛋白上的GFP部分朝向细胞质，则会暴露于蛋白酶活性中，导致荧光信号丧失；反之，若目的蛋白上的GFP部分朝向蛋白酶无法进入的“受保护”环境（如高尔基体腔内），则荧光信号将得以保留。

为了使蛋白酶进入细胞，但不进入细胞内膜性细胞器，可使用胆固醇结合药物皂苷（digitonin）。胆固醇是脊椎动物中最主要的甾醇，相对于细胞内其他膜性结构，其在质膜中的含量尤为丰富。皂苷（digitonin）是一种从毛地黄（Digitalis purpurea）植物中提取的糖苷类毒素，对富含胆固醇的膜结构具有特异性亲和力，可导致膜的选择性通透化^14,16 （图1）。除了允许小分子胞质成分释放外，经皂苷处理后的细胞膜还可允许外源性分子进入，例如蛋白酶K或胰蛋白酶。FPP实验正是基于质膜含有高达80%的细胞总胆固醇¹⁷，而其他细胞器（如内质网、高尔基体、内体、线粒体）胆固醇含量极低，因而保持完整¹⁴的特性而设计。质膜中胆固醇的选择性富集现象在多种真核细胞中均被观察到，因此皂苷依赖性的质膜通透化技术可广泛应用于从酿酒酵母（S. cerevisiae）到人类等多种真核生物^14,18。FPP检测法提供了一种简单、快速且相对稳健的方法，用于判断：（a）某蛋白是膜结合/膜相关蛋白，还是在胞质中自由扩散；（b）膜蛋白的哪个结构域朝向胞质，哪个朝向细胞器腔内。若某膜蛋白存在多种取向，则检测信号主要来自占主导地位的构型，次要构型通常无法被检测到。尽管有人担忧将GFP基团融合到目标蛋白上可能影响其功能和/或亚细胞定位，但这种情况更多属于理论上的顾虑而非实际问题。事实上，大量研究已明确表明，GFP标签并不会改变蛋白本身的性质^19,20。

方案

1. 荧光蛋白嵌合体的构建与验证

1. 使用标准的重组 DNA 技术，将绿色荧光蛋白（GFP）添加至目标蛋白的氨基端或羧基端¹³。
   注意：尽管我们广泛使用 GFP，但也可采用其他变体，如青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、DsRed 和 mCherry。荧光团的折叠效率、亮度和光稳定性正在不断改进，研究者应采用最新一代的构建体。
   1. 确认正确的 DNA 序列，并确保 GFP 片段与目标蛋白的读码框一致。使用标准的重组 DNA 技术进行测序²¹。
      注意：许多机构设有核心 DNA 设施，建议研究者联系以获取更多信息。
   2. 对于单次或双次跨膜蛋白，构建融合蛋白的氨基端和羧基端两种版本¹⁹。
   3. 对于多次跨膜蛋白，将 GFP 插入假定的膜外环区域以及蛋白末端。在构建氨基端连接荧光融合蛋白的跨膜嵌合体时需特别注意，因为信号序列在蛋白通过内质网转运子后常被蛋白水解酶切割。
   4. 若存在已知的信号序列，应将荧光融合蛋白插入切割位点的远端，以确保生成的成熟蛋白包含完整的氨基端标记荧光蛋白。采用标准的重组 DNA 技术构建嵌合体²¹。
2. 确定在目标细胞系中是否存在足够且定位正确的荧光信号。
   1. 在落射荧光显微镜下，使用适当的滤光片组条件观察 GFP 的内在荧光。若使用覆盖 510–560 nm 波长范围的 GFP 滤光片组，需确认所用滤光片与所采用的荧光团匹配。
      注意：当肉眼观察到的信号足够强，能够清晰分辨出信号所在细胞结构且明显高于背景时，即为足够信号。此外，GFP 融合蛋白的染色模式应与相应细胞器标志物一致，并最好与未标记的天然蛋白的分布模式相同。
3. 根据待评估蛋白的特性，确定采用稳定转染或瞬时转染策略。
   注意：稳定转染细胞通常表达水平低于瞬时转染系统。虽然瞬时表达可实现高水平的蛋白表达并增强信号强度（转染后约 5–24 小时，具体取决于蛋白），但也可能导致过表达相关的人工假象，例如蛋白聚集或蛋白靶向通路饱和，从而引起错误的亚细胞定位。

2. 细胞转染与细胞培养

注意：多种细胞适用于FPP分析，包括Hek293、HeLa、COS-7和CHO细胞¹⁴。以下描述基于在Hek293细胞中表达膜蛋白的实验。

1. 在含有5%胎牛血清（FBS）、1%丙酮酸钠和250 µg/ml青霉素/链霉素的6 ml杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO₂条件下，以贴壁单层方式培养人胚胎肾细胞（Hek293）。所有细胞操作均须在层流组织培养罩内进行。在T-75培养瓶中培养细胞，直至细胞融合度达到约80%。
2. 采用任何标准的高效、低毒转染方法（包括基于脂质、病毒或电穿孔的技术）转染细胞，以实现瞬时或稳定表达。通常每1 × 10⁶个细胞转染2 µg质粒DNA，可获得良好且可重复的蛋白表达。将细胞置于适当的组织培养基中，在37 °C、具备CO₂控制功能的组织培养孵箱中维持培养5–48小时。
3. 使用落射荧光显微镜，根据制造商提供的方案选择合适的滤光片组，通过GFP的内在荧光信号监测GFP融合蛋白的表达情况。荧光信号通常在转染后24–72小时内达到峰值。当荧光信号达到最大水平时即可使用细胞。通过免疫印迹分析，使用针对目标蛋白或GFP部分的特异性抗体，监测蛋白表达水平。
4. 用于实验分析时，将细胞接种于包被的盖玻片上。可在活细胞状态下观察，或在固定后封片于显微镜载玻片上进行观察。接种细胞，使其在24–48小时内达到60%–80%的融合度。
   1. 用多聚赖氨酸溶液（0.1 mg/ml）包被盖玻片，确保整个表面被覆盖。室温下在紫外灯中孵育30分钟，随后在37 °C细胞培养孵箱中孵育60分钟。去除多余的多聚赖氨酸，并用PBS清洗盖玻片3次。
   2. 或者，将细胞接种于带有光学玻璃底的腔室盖玻片培养板中，以便使用油浸物镜直接成像。实际的显微镜配置取决于研究人员可用的设备，但应具备快速更换溶液的能力。根据细胞类型和细胞形态，进行FPP检测时细胞融合度应约为60%–90%。

3. 荧光显微镜设置

1. 使用高数值孔径（NA）油浸物镜以实现最大信号收集和空间分辨率，例如 60X、1.42 NA 油浸物镜。使用以下激光激发荧光染料：氩气 488 nm（GFP 和 YFP）以及 561 二极管激光（RFP、mCherry）。
2. 针对每种构建体确定最佳曝光时间、增益和图像采集速率。调节激光强度和曝光时间以最小化光漂白（参见步骤 7.1.2）。
3. 对于使用多种荧光染料的研究（e.g.，用于膜通透性的可溶性标记物与膜蛋白标记物联合使用），应选择合适的滤光片组，以最小化信号串扰并最大化信噪比。

4. 建立细胞质膜通透化的最佳条件

1. 移除仅表达可溶性荧光蛋白的细胞中的细胞培养基例如 EGFP、DsRed）。用KHM缓冲液（110 mM醋酸钾，3 mM MgCl₂）洗涤细胞3次，每次1分钟。₂，20 mM HEPES-NaOH，pH 7.2）。在室温下进行细胞及所有试剂的实验操作。
2. 将细胞置于盖玻片上（见步骤 2.4），放入荧光显微镜载物台的 KHM 缓冲液中，采集第一张图像，代表对照“未透化”状态。
3. 为选择性通透细胞膜，将皂苷（30 µM）加入KHM缓冲液并孵育细胞。以5 ml/min的速度用该缓冲液（缓冲液 + 皂苷）灌注细胞，持续10–60秒。
4. 通过逐步增加皂苷（digitonin）浓度，确定其最佳作用浓度。当施加皂苷后10–60秒内可完全消除可溶性EGFP的荧光信号时，即达到最佳皂苷浓度。对于多数细胞，使用10–50 μM皂苷足以实现细胞膜的通透化。
   1. 在所有应用中均应使用最低可能浓度的皂苷（digitonin）。在皂苷透化后采集图像，以获取透化条件下的背景信号。
5. 通过用皂苷对细胞质膜进行透化处理后，检测荧光信号是否仍保留在细胞内，以确认目标GFP-蛋白嵌合体已整合至膜结构中¹⁶.
   1. 表达一种细胞器特异性的荧光蛋白²³线粒体蛋白在这方面效果良好¹⁶, 例如，pDsRed2-Mito 载体。按照步骤 2.1 中所述确定最佳表达条件。
   2. 通过确保细胞内细胞器的形态在长时间（长达60分钟）暴露于皂苷（digitonin）后保持不变，来验证所用细胞类型下皂苷浓度的适宜性。
      注意：使用针对各种细胞区室（如溶酶体）的抗体，采用标准的免疫荧光显微镜检测方案例如，LAMP1），高尔基体（例如，TGN38），内质网（例如，钙连蛋白），内体（例如，Rab5），线粒体（例如，细胞色素c）。如果细胞内细胞器的形态/完整性在60分钟内发生显著变化，则表明皂苷浓度可能过高，需降低皂苷浓度和/或缩短作用时间。
      注意：皂苷（digitonin）通过吸入和皮肤接触具有毒性。操作时应佩戴适当的个人防护装备（PPE）。

5. 荧光蛋白的蛋白酶处理

1. 用 KHM 缓冲液洗涤细胞，然后直接将蛋白酶（蛋白酶 K；50 μg/ml 溶于 KHM 缓冲液）加入细胞中。使用重力驱动的灌流系统，以 5 ml/min 的流速对细胞进行灌流，持续灌注样本。
   1. 将溶液储存于 50 ml 注射器中，并通过聚乙烯管连接至独立的储液罐，再汇集到一个具有单个出口（通向灌流槽）的多通管路系统（流速为 5 ml/min）。放置一根吸液移液管以维持灌流槽内恒定体积（0.5 ml），并通过手动切换不同灌流储液罐实现溶液更换。
2. 采集图像以判断荧光信号是否持续存在或发生降解。若在 30–60 秒内荧光信号强度损失超过 >90%，则表明 GFP-蛋白融合体发生了蛋白水解降解（参见代表性结果）。
3. 若使用蛋白酶 K 未观察到信号降解，而预期应发生降解时，可将蛋白酶 K 溶液替换为胰蛋白酶（4–8 mM 溶于 KHM 缓冲液）。必要时，可使用蛋白酶 K 与胰蛋白酶的混合溶液。无需淬灭蛋白酶活性。

6. 具有胞外结构域的质膜蛋白的替代方法

1. 对于质膜蛋白，在使用皂苷（digitonin）进行透化处理之前，先对外源性荧光蛋白融合体进行检测。用KHM缓冲液以每分钟5 ml的流速冲洗盖玻片上的细胞3分钟，拍摄蛋白酶处理前的图像，并按照步骤7的方法定量处理前的荧光信号。
2. 在不添加皂苷的情况下，通过向细胞灌注含有蛋白酶的KHM缓冲液（蛋白酶K，50 μg/ml；或胰蛋白酶，4–8 mM，流速为5 ml/min），使细胞暴露于蛋白酶中。持续采集荧光蛋白图像，以确定荧光信号消失的速度或持续的时间。
3. 在进行皂苷透化处理前，用含10%血清（FBS）的细胞培养基洗涤细胞三次（每次1分钟），彻底淬灭所有蛋白酶活性。
4. 用KHM缓冲液以每分钟5 ml的流速灌注细胞，洗涤2分钟。采集透化前图像，并按照步骤4所述方法对细胞膜进行透化处理。
5. 按照步骤5所述方法，在添加蛋白酶后采集图像。

7. 图像分析

1. 使用能够进行“活细胞”成像的倒置显微镜，实时监测荧光信号的丢失情况。为实现持续监测，应采用相同的参数（曝光时间、增益、激光强度， 等等。).
   1. 在对照条件下，通过观察目标GFP蛋白的荧光信号来确定实验参数（即，仅KBH缓冲液）。在计算机控制的显微镜上调整增益、激光强度和曝光时间设置，以确保在10-20分钟内无明显信号强度损失。
      注意：信号强度并非绝对值，而是取决于各课题负责人所用显微镜系统及设置。请监测相对荧光强度的变化。
2. 或者，在预设的时间点用皂苷处理细胞，随后进行蛋白酶处理，并在将细胞铺至盖玻片成像前进行固定。根据第4和第5步中的操作流程，通过实验确定处理时间点。初次实验时，可从加入皂苷或蛋白酶后0、30、60、120和300秒开始。
   1. 使用足量固定液（PBS 中含 3.7% 多聚甲醛）完全浸没细胞，在室温下固定 20 分钟。
   2. 用含20 mM甘氨酸的PBS缓冲液洗涤细胞以淬灭残留的多聚甲醛（每次5分钟，共3次）。
   3. 将盖玻片上的多余液体去除，然后将盖玻片倒置在载玻片上50 µl封片剂中，用于成像。封片后载玻片需避光过夜干燥后再进行成像。
3. 使用计算机控制的荧光显微镜，通过其视频图像采集功能，在与所用荧光染料相匹配的滤光片组下采集荧光显微图像。
4. 根据孵育条件定量荧光信号强度。获取包围单个细胞的感兴趣区域（ROI）内的平均像素强度。

结果

细胞膜通透化

高效的质膜通透性取决于可溶性荧光蛋白的使用（例如，GFP，DsRed）（步骤4）。这些蛋白在细胞中表达后可自由扩散于细胞质中，当使用皂苷（digitonin）对质膜进行透化处理时，这些蛋白会流失图2）。加入皂苷后10-60秒内，荧光信号应完全消失。若在皂苷透化后仍观察到荧光信号保留，则可证实目标蛋白与细胞内细胞器相关联。

蛋白酶处理

在成功构建目标蛋白与荧光蛋白（GFP、YFP）的荧光融合蛋白后 等等。）（步骤1）以及细胞中荧光蛋白的表达（步骤2），对透化细胞进行蛋白酶处理，可提供信息以判断荧光基团（及其相邻的蛋白结构域）是位于胞质溶胶中并可被蛋白酶降解，还是位于细胞器腔内因而受到保护而不被蛋白酶降解（步骤4）。LMTK2是一种膜锚定激酶¹⁵，已采用荧光蛋白酶保护实验来确定其膜拓扑结构¹⁶LMTK2 的羧基末端...

讨论

膜蛋白的正确取向和拓扑结构对其正常功能至关重要。尽管了解膜蛋白拓扑结构具有重要意义，但目前仍有大量蛋白缺乏相关数据。FPP方法为确定膜蛋白拓扑结构提供了一种简便高效的手段，且大多数实验室均可开展。相较于以往的拓扑结构测定方法，FPP具有显著优势。例如，该方法无需针对目标蛋白不同结构域的一系列多种抗体³¹。而在许多情况下，这类抗体组合并不可得，对于新近克隆的蛋白尤其如此。由于该检测可在单细胞水平上进行，因此下游生化分析（如蛋白酶解或SDS-PAGE）无需大量生化级别的蛋白。事实上，仅需相对少量的转染细胞即可明确确定目标蛋白的拓扑结构。这一点在研究者评估难以转染的细胞（如上皮细胞或神经元）中的拓扑结构时尤为重要。通过多种市售的含GFP质粒，可轻松地在目标蛋白的羧基端或氨基端添加GFP基团；在大多数情况下，添加GFP基团不会影响蛋白的正确折叠或亚细胞定位。然而，研究者必须验证其目标蛋白是否确实不受影响，因为GFP仍有可能干扰目标蛋白的功能^23,24。目前已有大量蛋白以GFP融合蛋白的形式存在，因此开展拓扑学研究所需额外工作极少。虽然持续荧光监测可快速高效地确定蛋白拓扑结构，但对于无法获得活细胞成像设...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
洋地黄皂苷	Calbiochem	300410
蛋白酶K	Sigma	P2308
胰蛋白酶	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 高尔基体	Clontech	632464
多聚赖氨酸	Sigma	P4707
封片介质	Dako	cS704