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方法文章

壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒介导的病媒蚊虫幼虫基因沉默

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DOI：

10.3791/52523

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2015年3月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过使用可被幼虫摄食的壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒来抑制疾病媒介蚊虫基因功能的方法。

摘要

传播疾病的蚊子给人类带来的痛苦超过任何其他生物—每年导致超过一百万人死亡。蚊子基因组计划推动了蚊子生物学多个新领域的研究，包括对主要非洲疟疾传播媒介进行功能基因研究 Anopheles gambiae 登革热和黄热病的传播媒介 埃及伊蚊RNA干扰（RNAi）介导的基因沉默技术已用于上述两种疾病传播媒介蚊虫中靶向特定基因。本文描述了一种制备壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒的方法，该纳米颗粒可与食物混合后被幼虫摄食。该方法技术简便、通量高且相对经济，适用于长片段双链RNA（dsRNA）或小干扰RNA（siRNA）分子，已成功用于多种不同基因的敲低 A. gambiae 和 A. aegypti 幼虫. 幼虫饲喂后，通过qRT-PCR验证基因敲低效果 原位 杂交, 可至少持续到蛹期晚期。该方法可能适用于多种蚊虫及其他昆虫物种，包括农业害虫，以及其它非模式生物。除了在科研实验室中具有应用价值外，未来几丁质（chitosan）——一种廉价、无毒且可生物降解的聚合物——还可能被用于实地应用。

引言

按蚊属和伊蚊属的吸血媒介蚊子传播着多种严重危害人类健康的病原体。据估计，全球约有34亿人面临感染疟疾的风险，该疾病每年导致全球超过50万人死亡。疟疾由疟原虫感染引起。 疟原虫种 寄生虫，通过受感染的蚊子叮咬传播给人类 按蚊属 属，包括主要的非洲传播媒介 Anopheles gambiae (http://www.who.int/topics/malaria/zh/, 2014)1. Aedes aegypti 是登革病毒的主要蚊媒, 导致登革热，这是一种非特异性的发热性疾病，是目前全球分布最广且最重要的虫媒病毒病。登革病毒现已成为一种威胁 >热带地区有25亿人口，每年约发生5000万例病例，导致约24,000人死亡http://www.cdc.gov/dengue/, 2014)2尽管蚊媒疾病对人类健康造成了严重的全球性影响，但目前仍缺乏有效的预防和治疗方法。蚊虫控制是当前预防此类疾病的最佳手段。

通过遗传改造媒介昆虫来控制节肢动物传播疾病的可能性，已有四十多年的历史3。近年来，已成功构建出携带可抑制的雌性特异性飞行缺陷表型的转基因埃及伊蚊（A. aegypti）品系，使利用转基因策略进行媒介控制成为现实4-6。这些进展促使研究人员致力于发现新的媒介控制相关基因靶点，并开发在媒介蚊虫中调控基因功能的额外手段。在发育过程中改变基因表达——如雌性飞行缺陷蚊虫中所实现的那样4——可能有助于揭示新型的媒介控制策略。然而，由于技术上的挑战，迄今为止在冈比亚按蚊（A. gambiae）、埃及伊蚊（A. aegypti）或其他蚊虫物种的发育过程中，仅有极少数基因的功能得到了表征。

自在线虫C. elegans7中发现以来，RNA干扰（RNAi）作为一种在动物、植物和微生物中均保守存在的机制，已被广泛应用于多种生物体的功能基因研究，包括昆虫8,9。RNAi通路由Dicer蛋白启动，该酶将长链双链RNA（dsRNA）切割为长度为20–25个核苷酸的小干扰RNA（siRNA），后者作为序列特异性的干扰RNA发挥作用。siRNA通过促进靶标mRNA的降解、切割以及翻译抑制，使序列互补的基因沉默9。在研究实验中，可使用长链dsRNA分子（通常为300–600 bp）或针对特定序列设计的定制siRNA来沉默任意目的基因。通过控制干扰RNA的递送时间，研究人员能够调控基因沉默的启动时机。这一优势十分有用，可用于克服诸如发育致死或不育等难题，这些问题会阻碍携带可遗传突变品系的建立与维持——这是一项成本高昂且劳动密集的过程，目前尚未在所有昆虫物种中实现。尽管RNAi介导的基因沉默效率因基因、组织和个体而异，RNAi仍被广泛用于蚊虫及其他昆虫基因的功能分析8,9。

已采用三种干扰RNA递送策略用于蚊虫：显微注射、浸泡/局部施用和摄食。有关这三种技术在昆虫中应用的详细历史与比较，请参见Yu 等8我们已成功使用显微注射技术10 作为将siRNA递送至靶向发育基因的手段 埃及伊蚊 胚胎、幼虫和蛹11-14然而，这种劳动密集型的递送策略需要显微注射设备以及熟练的操作技术。此外，显微注射会对生物体造成应激，这一混杂因素在评估行为表型时尤为突出。最后，显微注射递送法无法应用于田间媒介控制。作为一种替代方法，将生物体浸泡在干扰RNA溶液中也已成为诱导基因沉默的常用手段，因其操作简便且所需设备和人力较少。浸泡法主要应用于昆虫细胞系研究。8，但在最近的一项研究中，已实现基因敲低 埃及伊蚊 幼虫浸入dsRNA溶液中15，动物似乎会摄入其中。然而，对于涉及多个实验组或表型分析的研究，浸泡法成本较高。Lopez-Martinez 等16 描述了一种由再水化驱动的RNA干扰技术，这是一种新型的干扰RNA递送方法，涉及在盐溶液中进行脱水，随后用一滴含有干扰RNA的水进行再水化。该方法虽可降低整体动物浸泡所需的成本，但仍比显微注射更为昂贵，且其应用可能受限于能够耐受高渗透压的物种。此外，难以设想浸泡或脱水/再水化浸泡方法如何能在田间媒介控制中得以实际应用。基于这些原因，在胚胎后研究中，通过摄食食物递送干扰RNA是一种可行的替代策略。

尽管基于摄食的策略并非在所有昆虫物种中都有效，尤其是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），但将干扰RNA与食物混合进行口服递送已在多种昆虫中成功诱导了基因沉默8,17，包括埃及伊蚊（A. aegypti）成虫18。我们此前已报道了在冈比亚按蚊（A. gambiae）幼虫中通过壳聚糖纳米颗粒介导的RNA干扰技术19，并已成功将该方法应用于埃及伊蚊（A. aegypti）幼虫中以降低目标基因的表达水平20,21。本文详细描述了这一RNA干扰实验方法，其核心是利用壳聚糖聚合物包裹干扰RNA。壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒通过多聚阳离子与干扰RNA之间的静电作用自组装形成，其中壳聚糖分子上的氨基所带正电荷与干扰RNA骨架上的磷酸基团所带负电荷相互吸引19。本方法适用于长片段双链RNA分子（下文简称dsRNA）以及双链siRNA（下文简称siRNA）。合成后的壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒与幼虫食物混合，通过口服摄食方式递送至幼虫体内。该方法成本相对较低，所需仪器和人力投入较少19，并可支持对多种表型（包括行为学分析）进行高通量研究20,21。该技术可进一步优化，用于其他昆虫（包括其他疾病传播媒介及农业害虫）的基因沉默研究，甚至有望拓展至多种其他动物物种。此外，壳聚糖作为一种价格低廉、无毒且可生物降解的聚合物22，未来有望在实地环境中用于特异性蚊虫种群的控制。

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方案

1. 蚊虫种类与饲养

  1. 根据标准实验室操作或如前所述的方法23,24，维持A. gambiae G3 和 A. aegypti Liverpool IB12 品系（下述代表性研究中所用）或其他关注品系的培养。

2. dsRNA 和 siRNA 的设计与制备

  1. 设计引物以构建针对目的基因的长双链RNA（dsRNA）模板。使用E-RNAi工具25。根据所选方法或先前描述的方法19制备dsRNA。
    1. 作为阴性对照，合成对应于绿色荧光蛋白（GFP）、β-半乳糖苷酶（β-gal）或其他在蚊子中不表达的基因序列的dsRNA19。如需要，可用于获得下文总结的代表性结果的dsRNA19可作为阳性对照。将dsRNA溶解于无RNase的水中，于-80 °C保存，直至使用。
  2. 或者，根据标准实验室操作或先前描述的方法10设计基因特异性的siRNA。将敲低用siRNA的序列进行随机化，以设计不对应于任何蚊子基因的阴性对照siRNA。可通过多家信誉良好的供应商定制合成siRNA。
    1. 如需要，用于获得下文总结的代表性结果的siRNAs20,21可作为阳性对照。将siRNA溶解于无RNase的水中，于-80 °C保存，直至使用。

3. 制备壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒

  1. 配制预制的 RT 100 mM 硫酸钠（100 mM Na2SO4 在去离子水中2O) 和 0.1 M 醋酸钠 (0.1 M NaC2H3O2–0.1 0.1 M 乙酸，pH 4.5，溶于去离子水2O）缓冲液。
  2. 将壳聚糖（脱乙酰度 ≥75%）溶于 0.1 M 醋酸钠缓冲液中，配制成 0.02%（w/v）的工作液，使用前于室温保存。
  3. 将dsRNA或siRNA溶解于50 µ升去离子水2O，并加入100 mM硫酸钠缓冲液中以配制成100 µ32 溶液 µ每100克dsRNA/siRNA µ50 mM 硫酸钠溶液
  4. 加入100 µ将壳聚糖溶液加入到dsRNA/siRNA溶液中，然后在55℃水浴中加热混合物 °C for 1 min。通过加入100设立对照组 µ50 mM 硫酸钠溶液加至 100 µl 的壳聚糖溶液，并遵循相同的步骤。
  5. 在室温下通过高速涡旋振荡立即混合溶液30秒，以促进纳米颗粒的形成。
  6. 在室温下以13,000 × g离心混合物10分钟，此时应可见沉淀。将上清液转移至新的1.5 ml离心管中。将沉淀在空气中干燥 ≈使用前于室温静置10分钟以制备蚊虫食物。
  7. 使用对照组的上清液（见3.5）作为空白，测定上清液中dsRNA/siRNA的浓度，以计算保留在上清液中的dsRNA/siRNA总量。通过比较dsRNA/siRNA的初始量与上清液中剩余量的差值，计算被包载到纳米颗粒中的dsRNA/siRNA百分比。该包封效率通常超过90%。
  8. 如果需要更多纳米颗粒，请重复相同步骤。请立即使用干燥后的纳米颗粒。颗粒在使用前冷藏保存的影响尚未评估。

4. 制备含有壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒的蚊虫食物

  1. 配制1 ml 2%的琼脂糖溶液（w/v，溶于去离子水），加热熔化琼脂糖，并将熔化的琼脂糖溶液置于55℃保温 ˚使用前将水浴锅预热至 C。
  2. 将鱼食薄片（粗蛋白含量47%，粗脂肪含量不低于10%，粗纤维含量不高于3%）与干酵母按2:1（重量比）混合。使用研钵和研杵将混合物研磨成细小颗粒（可通过美国标准40目试验筛）。研磨后的饲料呈棕褐色，可立即使用，或密封保存于4℃条件下。 ˚C 几周。
  3. 在1.5 ml离心管中，用牙签将6 mg研磨后的食物与第3.7节中获得的干燥纳米颗粒混合。
  4. 加入30 µ将 1 毫升 2% 预熔化的琼脂糖凝胶溶液加入食物-纳米颗粒混合物中；立即使用牙签或移液器吸头充分搅拌。
  5. 立即用含有食物和纳米颗粒的凝胶喂食蚊子幼虫。或者，在室温下待凝胶完全凝固后，将凝胶置于4℃保存 °C，并于次日使用，或在 -80 °C，以备后续使用。

5. 使用含有壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒的食物喂养蚊子幼虫

  1. 喂养 A. gambiae 蚊子幼虫：
    1. 使用牙签从1.5 ml离心管中取出一个凝胶颗粒，并用洁净的刀片或牙签将其切成6个相等的片状。
    2. 将20只三龄幼虫转移至含有100 ml去离子水的500 ml培养皿中。
    3. 每天向每个培养皿中加入一片凝胶颗粒（切成更小的碎块），持续四天，以喂养蚊子幼虫。注意观察幼虫摄食情况，颗粒应在次日明显变小或完全消失。经过一段时间后，蚊子将发育至四龄晚期幼虫阶段。
    4. 记录实验过程中任何可见的表型变化。在四天周期结束时，按照第6节所述，检测转录水平及其他表型变化。
  2. 喂养 A. aegypti 蚊子幼虫
    1. 使用干净的剃须刀片或牙签将凝胶沉淀切成6个相等的片状。
    2. 将50只年龄同步的孵化后24小时的一龄幼虫放入培养皿中 ≈40 ml 去离子水
    3. 每天每培养皿喂食幼虫一片食物，持续4小时，然后将幼虫转回常规幼虫饲料（2:1的磨碎鱼粮薄片与干酵母），供其余时间摄食。在整个四个幼虫龄期期间每日重复此操作。
    4. 在选定的发育时间点，检测转录水平及其他表型变化，具体方法见第6节。

6. 基因敲低效果的验证

  1. 通过qRT-PCR进行相对转录本定量 埃及伊蚊 和 A. gambiae 幼虫
    1. 对至少10只对照组与实验组幼虫分别进行三次生物学重复的qRT-PCR实验，并进行分析，具体步骤如前所述11,19,20 ，或按照标准实验室流程进行。以下包含代表性结果。
    2. 用于特定组织类型/身体部位的分析（即，脑组织或触角），解剖后按照6.1.1节所述进行qRT-PCR，以获取目标组织（例如，参见Mysore 等.21).
  2. 通过敲低验证 原位 杂交
    1. 根据标准实验室操作或所述方法合成地高辛标记的反义和正义对照核糖探针26. 
    2. 执行 原位 根据Haugen的杂交方法 等.27 敲低验证方案，如前所述11,20 并在下文的代表性结果部分中进行讨论。
  3. 通过免疫组织化学确认基因敲低效果
    1. 如果可获得针对目标基因蛋白产物的抗体，则按照先前所述方法进行免疫组织化学检测28，这有助于识别基因敲低程度最高的个体，以进行表型分析20 如下文代表性结果部分所示。

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结果

A. gambiae：

壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的形成源于壳聚糖的氨基与 dsRNA 的磷酸基团之间的静电相互作用。通过测定溶液中 dsRNA 的减少量，通常测得其包封效率高于 90%。原子力显微镜图像显示，壳聚糖-dsRNA 颗粒的平均直径为 140 nm，粒径范围为 100–200 nm（图 1）。

原子力显微镜图像分析，表面形貌，纳米级图案，实验结果。
图1. 壳聚糖与干扰RNA形成的纳米颗粒。壳聚糖/dsRNA纳米颗粒的原子力显微镜图像(A)，或未添加dsRNA的壳聚糖溶液图像...

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讨论

本文所述的壳聚糖/干扰 RNA 纳米颗粒方法已成功用于在冈比亚按蚊（A. gambiae）（图 2, 3）和埃及伊蚊（A. aegypti）（图 4, 5, 6，表 1, 2）的幼虫发育过程中靶向特定基因。壳聚糖纳米颗粒可使用长链 dsRNA 或 siRNA 制备，两者在蚊虫中的应用均已通过本文所述的代表性实验结果得到证实。与购买 siRNA 相比，dsRNA 的合成成本较低，但操作更为耗时。若使用壳聚糖/siRNA，可通过多个不同的 siRNA 验证表型，从而更可靠地确保所观察到的表型并非由脱靶效应引起。此外，siRNA 的大规模商业化生产可能更有助于推动壳聚糖/干扰 RNA 沉默技术在物种特异性蚊虫防控中的实地应用。当然，这需要克服成本和递送方式等方面的障碍。

尽管本方案已取得良好效果，但每种基因均需优化实验条件。因此，我们建议在新项目开始时，测试多种siRNA，或一种siRNA与一条长片...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

堪萨斯农业实验站和堪萨斯州立大学节肢动物基因组中心向 KYZ 提供的资金支持了在A. gambiae中开发壳聚糖/dsRNA介导的基因沉默技术的最初研究19。本文所述关于A. gambiae的研究工作部分由美国国立卫生研究院/过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）授予 KM 的 R01-AI095842 项目资助。在A. aegypti中开发壳聚糖/siRNA介导的基因沉默技术的研究20,21由美国国立卫生研究院/过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）授予 MDS 的 R01-AI081795 项目资助。本研究的内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.02 ml 移液器RaininPR20用于干扰 RNA 的重悬
0.2 ml 移液器RaininPR200用于干扰 RNA 的重悬及干扰 RNA/纳米颗粒的制备
0.5 ml 刻度管 Fischer Scientific05-408-120用于分装重悬后的干扰 RNA
1 ml 移液器RaininPR1000用于干扰 RNA 的重悬及干扰 RNA/纳米颗粒的制备
1.5 ml 刻度管 Fischer Scientific05-408-046用于干扰 RNA/纳米颗粒的制备
1M 乙酸钠，pH 4.5TEKnovaS0299用于配制乙酸钠缓冲液
乙酸，AIRSTAR，ACS、USP、FCC 级BDHVWR BDH3092-500MLP用于配制乙酸钠缓冲液
琼脂糖，基因技术级MP Biomedicals LLC.800668用于包被制备好的干扰 RNA/纳米颗粒
离心机Eppendorf AG5415D用于沉淀干扰 RNA/纳米颗粒
壳聚糖，来源于虾壳Sigma-AldrichC3646-25G与干扰 RNA 结合以制备干扰 RNA/纳米颗粒
干酵母Universal Food CorpNA用于制备含干扰 RNA/纳米颗粒的蚊幼虫食物
E-RNAi 工具德国癌症研究中心NA用于设计 dsRNA；http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
金鱼饲料WardleyGoldfish FLAKE FOOD用于制备含干扰 RNA/纳米颗粒的蚊幼虫食物
加热水浴锅Thermo Scientific51221048将干扰 RNA/纳米颗粒在 55oC 下加热
冰不适用不适用用于干扰 RNA 的解冻及干扰 RNA/纳米颗粒的制备
[header]
冰桶Fisher Scientific02-591-44用于存放实验过程中使用的冰
肝脏粉MP Biomedicals LLC.900396用于干扰 RNA/纳米颗粒处理后蚊幼虫的喂养
微波炉多种供应商不适用用于配制 2% 琼脂糖溶液
培养皿（100 × 15 mm）Fischer Scientific875713作为幼虫摄食干扰 RNA/纳米颗粒的容器
pH 计Mettler ToledoS220用于缓冲液的配制
剃须刀片Fischer Scientific12-640用于分割干扰 RNA/纳米颗粒沉淀以进行喂食
siRNAThermo Scientific/Dharmacon定制用于制备 siRNA/纳米颗粒
无水硫酸钠（Na2SO4）BDH/由 VWR 分销VWR BDH0302-500G用于配制 50 mM 硫酸钠溶液，干扰 RNA 将在此溶液中重悬
温度计VWR61066-046用于测量水浴温度
牙签VWR470146-908用于干扰 RNA/纳米颗粒食物制备过程中的搅拌及凝胶沉淀的切割
超低温冰箱多种供应商不适用用于在 -80oC 下保存干扰 RNA 分装样品及干扰 RNA/纳米颗粒
涡旋混合器Fischer Scientific02-216-108用于壳聚糖/干扰 RNA 的制备
称量纸Fischer ScientificNC9798735用于分割干扰 RNA/纳米颗粒沉淀以进行喂食

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