壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒介导的病媒蚊虫幼虫基因沉默

摘要

本文介绍了一种通过使用可被幼虫摄食的壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒来抑制疾病媒介蚊虫基因功能的方法。

摘要

传播疾病的蚊子给人类带来的痛苦超过任何其他生物—每年导致超过一百万人死亡。蚊子基因组计划推动了蚊子生物学多个新领域的研究，包括对主要非洲疟疾传播媒介进行功能基因研究 Anopheles gambiae 登革热和黄热病的传播媒介 埃及伊蚊RNA干扰（RNAi）介导的基因沉默技术已用于上述两种疾病传播媒介蚊虫中靶向特定基因。本文描述了一种制备壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒的方法，该纳米颗粒可与食物混合后被幼虫摄食。该方法技术简便、通量高且相对经济，适用于长片段双链RNA（dsRNA）或小干扰RNA（siRNA）分子，已成功用于多种不同基因的敲低 A. gambiae 和 A. aegypti 幼虫. 幼虫饲喂后，通过qRT-PCR验证基因敲低效果 原位 杂交, 可至少持续到蛹期晚期。该方法可能适用于多种蚊虫及其他昆虫物种，包括农业害虫，以及其它非模式生物。除了在科研实验室中具有应用价值外，未来几丁质（chitosan）——一种廉价、无毒且可生物降解的聚合物——还可能被用于实地应用。

引言

按蚊属和伊蚊属的吸血媒介蚊子传播着多种严重危害人类健康的病原体。据估计，全球约有34亿人面临感染疟疾的风险，该疾病每年导致全球超过50万人死亡。疟疾由疟原虫感染引起。 疟原虫种 寄生虫，通过受感染的蚊子叮咬传播给人类 按蚊属 属，包括主要的非洲传播媒介 Anopheles gambiae (http://www.who.int/topics/malaria/zh/, 2014)¹. Aedes aegypti 是登革病毒的主要蚊媒, 导致登革热，这是一种非特异性的发热性疾病，是目前全球分布最广且最重要的虫媒病毒病。登革病毒现已成为一种威胁 >热带地区有25亿人口，每年约发生5000万例病例，导致约24,000人死亡http://www.cdc.gov/dengue/, 2014)²尽管蚊媒疾病对人类健康造成了严重的全球性影响，但目前仍缺乏有效的预防和治疗方法。蚊虫控制是当前预防此类疾病的最佳手段。

通过遗传改造媒介昆虫来控制节肢动物传播疾病的可能性，已有四十多年的历史³。近年来，已成功构建出携带可抑制的雌性特异性飞....

方案

1. 蚊虫种类与饲养

1. 根据标准实验室操作或如前所述的方法^23,24，维持A. gambiae G3 和 A. aegypti Liverpool IB12 品系（下述代表性研究中所用）或其他关注品系的培养。

2. dsRNA 和 siRNA 的设计与制备

1. 设计引物以构建针对目的基因的长双链RNA（dsRNA）模板。使用E-RNAi工具²⁵。根据所选方法或先前描述的方法¹⁹制备dsRNA。
   1. 作为阴性对照，合成对应于绿色荧光蛋白（GFP）、β-半乳糖苷酶（β-gal）或其他在蚊子中不表达的基因序列的dsRNA¹⁹。如需要，可用于获得下文总结的代表性结果的dsRNA¹⁹可作为阳性对照。将dsRNA溶解于无RNase的水中，于-80 °C保存，直至使用。
2. 或者，根据标准实验室操作或先前描述的方法¹⁰设计基因特异性的siRNA。将敲低用siRNA的序列进行随机化，以设计不对应于任何蚊子基因的阴性对照siRNA。可通过多家信誉良好的供应商定制合成siRNA。
   1. 如需要，用于获得下文总结的代表性结果的siRNAs^20,21可作为阳性对照。将....

结果

A. gambiae：

壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的形成源于壳聚糖的氨基与 dsRNA 的磷酸基团之间的静电相互作用。通过测定溶液中 dsRNA 的减少量，通常测得其包封效率高于 90%。原子力显微镜图像显示，壳聚糖-dsRNA 颗粒的平均直径为 140 nm，粒径范围为 100–200 nm（图 1）。

图1. 壳聚糖与干扰RNA形成的纳米颗粒。壳聚糖/dsRNA纳米颗粒的原子力显微镜图像(A)，或未添加dsRNA的壳聚糖溶液图像.......

讨论

本文所述的壳聚糖/干扰 RNA 纳米颗粒方法已成功用于在冈比亚按蚊（A. gambiae）（图 2, 3）和埃及伊蚊（A. aegypti）（图 4, 5, 6，表 1, 2）的幼虫发育过程中靶向特定基因。壳聚糖纳米颗粒可使用长链 dsRNA 或 siRNA 制备，两者在蚊虫中的应用均已通过本文所述的代表性实验结果得到证实。与购买 siRNA 相比，dsRNA 的合成成本较低，但操作更为耗时。若使用壳聚糖/siRNA，可通过多个不同的 siRNA 验证表型，从而更可靠地确保所观察到的表型并非由脱靶效应引起。此外，siRNA 的大规模商业化生产可能更有助于推动壳聚糖/干扰 RNA 沉默技术在物种特异性蚊虫防控中的实地应用。当然，这需要克服成本和递送方式等方面的障碍。

尽管本方案已取得良好效果，但每种基因均需优化实验条件。因此，我们建议在新项目开始时，测试多种siRNA，或一种siRNA与一条长片.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.02 ml 移液器	Rainin	PR20	用于干扰 RNA 的重悬
0.2 ml 移液器	Rainin	PR200	用于干扰 RNA 的重悬及干扰 RNA/纳米颗粒的制备
0.5 ml 刻度管	Fischer Scientific	05-408-120	用于分装重悬后的干扰 RNA
1 ml 移液器	Rainin	PR1000	用于干扰 RNA 的重悬及干扰 RNA/纳米颗粒的制备
1.5 ml 刻度管	Fischer Scientific	05-408-046	用于干扰 RNA/纳米颗粒的制备
1M 乙酸钠，pH 4.5	TEKnova	S0299	用于配制乙酸钠缓冲液
乙酸，AIRSTAR，ACS、USP、FCC 级	BDH	VWR BDH3092-500MLP	用于配制乙酸钠缓冲液
琼脂糖，基因技术级	MP Biomedicals LLC.	800668	用于包被制备好的干扰 RNA/纳米颗粒
离心机	Eppendorf AG	5415D	用于沉淀干扰 RNA/纳米颗粒
壳聚糖，来源于虾壳	Sigma-Aldrich	C3646-25G	与干扰 RNA 结合以制备干扰 RNA/纳米颗粒
干酵母	Universal Food Corp	NA	用于制备含干扰 RNA/纳米颗粒的蚊幼虫食物
E-RNAi 工具	德国癌症研究中心	NA	用于设计 dsRNA；http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
金鱼饲料	Wardley	Goldfish FLAKE FOOD	用于制备含干扰 RNA/纳米颗粒的蚊幼虫食物
加热水浴锅	Thermo Scientific	51221048	将干扰 RNA/纳米颗粒在 55oC 下加热
冰	不适用	不适用	用于干扰 RNA 的解冻及干扰 RNA/纳米颗粒的制备
[header]
冰桶	Fisher Scientific	02-591-44	用于存放实验过程中使用的冰
肝脏粉	MP Biomedicals LLC.	900396	用于干扰 RNA/纳米颗粒处理后蚊幼虫的喂养
微波炉	多种供应商	不适用	用于配制 2% 琼脂糖溶液
培养皿（100 × 15 mm）	Fischer Scientific	875713	作为幼虫摄食干扰 RNA/纳米颗粒的容器
pH 计	Mettler Toledo	S220	用于缓冲液的配制
剃须刀片	Fischer Scientific	12-640	用于分割干扰 RNA/纳米颗粒沉淀以进行喂食
siRNA	Thermo Scientific/Dharmacon	定制	用于制备 siRNA/纳米颗粒
无水硫酸钠（Na2SO4）	BDH/由 VWR 分销	VWR BDH0302-500G	用于配制 50 mM 硫酸钠溶液，干扰 RNA 将在此溶液中重悬
温度计	VWR	61066-046	用于测量水浴温度
牙签	VWR	470146-908	用于干扰 RNA/纳米颗粒食物制备过程中的搅拌及凝胶沉淀的切割
超低温冰箱	多种供应商	不适用	用于在 -80oC 下保存干扰 RNA 分装样品及干扰 RNA/纳米颗粒
涡旋混合器	Fischer Scientific	02-216-108	用于壳聚糖/干扰 RNA 的制备
称量纸	Fischer Scientific	NC9798735	用于分割干扰 RNA/纳米颗粒沉淀以进行喂食