多器官芯片——一种用于长期多组织共培养的微流控平台

摘要

本文介绍了一种在微流控多器官芯片中对原代细胞、组织模型和打孔活检样本进行共培养的实验方案，培养时间可长达28天。人皮肤微血管内皮细胞、肝细胞聚集体和皮肤活检组织已成功在共同培养基循环系统中实现联合培养。

摘要

新投放市场的物质数量不断增长，而现有方法的预测能力却十分有限 体外 测试系统的发展导致了对物质测试新解决方案的迫切需求。许多因药物性肝损伤而被撤市的药物，其毒性潜能仅在人体经过多次长期给药测试后才显现。然而，长期多次给药实验的关键在于可控的微环境。 因为细胞外环境的微小变化都可能显著影响细胞生理状态。在我们的研究项目中，重点是构建一种微加工生物反应器，该反应器可通过芯片集成泵实现动态灌注，并至少整合两个培养区域，用于多器官应用。该循环系统模拟了 体内 原代细胞培养条件更佳，并确保更稳定、 更可量化的细胞外信号向细胞的传递。

为演示目的，将分化后的 HepaRG 细胞与人肝星状细胞在悬滴培养板中聚集成类人肝脏等效物，并在微流控生物反应器内与人皮肤穿孔活检组织共培养长达 28 天。使用细胞培养插入物可使皮肤在气液界面条件下培养，从而实现物质的局部暴露。该微流控生物反应器系统能够在接近生理状态的液体流速和液量比条件下支持此类共培养，确保稳定且具有器官特性的培养环境。长期培养的可能性使得可对物质进行重复暴露。此外，利用人真皮微血管内皮细胞对微流控通道回路进行血管化，可获得生理相关性更高的血管模型。

引言

目前用于药物开发的单层或悬浮细胞培养检测方法无法模拟人类细胞微环境，因此导致原代人类细胞培养中细胞快速去分化并丧失功能。在将化合物推进至临床试验之前，亟需具有更高生理相关性的组织模型，以更准确地预测其有效性和安全性。近年来，标准化 体外 细胞培养技术已从二维单层培养发展为三维多细胞模型，旨在模拟 体内 组织微环境。这些系统已在更准确地预测化合物作用机制方面展现出显著改进 ^1,2此外，调整 体外 将培养条件与细胞的高度特化需求相匹配具有重要意义。

在标准的体外条件下，许多重要的培养参数通常难以在大多数情况下得到充分控制，例如营养物质和氧气的供应、代谢产物的清除以及作用于细胞的机械力。许多器官在生理上具有相关物质和溶解氧的浓度梯度。然而，这些高度调控且优化的条件与体外条件下组织周围不可控的扩散梯度明显相悖，导致环境高度不稳定，并限制了细胞的发育³。因此，需要更稳定且特别是更可量化的体外条件，以在较长时间内维持细胞的存活和分化状态。灌注系统通过定期移除和替换培养基成分，通常比静态培养更能明确表征并实现对组织微环境的控制。在静态条件下，细胞分泌物和培养基营养物质的扩散梯度可能包围培养的细胞³。通过在组织周围引入明确设定的培养基流速，可使细胞分泌物通过灌注与富含营养的培养基充分混合。这能够形成定义明确的细胞微环境，确保在整个实验过程中细胞表型及代谢酶表达的稳定性⁴。

基于多器官芯片（MOC）系统的最新进展，结合了工程化组织周围受控培养基流动的优势与微尺度生物反应器对培养基和细胞量需求较小的特点，从而在测试过程中显著减少了所需物质的用量。迄今为止，已有多种用于组织培养的微流控系统被报道^5,6。在这些系统中，组织与液体的比例在模拟生理条件下细胞间的相互作用方面起着尤为关键的作用。然而，由于技术限制，例如使用外部泵和培养基储液池，大多数系统的总体循环培养基体积相对于组织体积而言过大。Shuler et al. 率先开发出一种系统，可确保物质在细胞培养腔室内的停留时间以及组织与液体比例达到与体内相关的生理水平^7,8。该目标通过将外部储液池缩小至96孔板规模实现，该孔板同时也代表“其他组织”腔室。为了最小化我们MOC平台内的循环培养基体积，我们集成了一个片上蠕动微泵，从而无需外部培养基回路。该微泵能够以可调节的流速和剪切应力运行系统⁹。一个横截面为500 µm宽、100 µm高的微流控通道系统连接两个标准化的组织培养空间，每个空间的尺寸相当于一个96孔板的单个孔。遵循工业标准孔板的尺寸规范，使得已有的、以Transwell形式构建的组织模型可直接整合到本系统中。此外，Transwell细胞培养插件的垂直位置可调节，从而不仅可培养直接暴露于流体剪切的组织模型，还可将其抬升并屏蔽底层液流的影响。类似地，该系统也适用于气液界面培养。

MOC 平台由一层高 2 mm 的聚二甲基硅氧烷（PDMS）和一块尺寸为 75 × 25 mm² 的玻璃显微镜载片构成，两者通过低压等离子体氧化永久键合，形成密封的微流控回路。含有相应通道和细胞培养腔室的 PDMS 层通过标准软光刻和复制 molding 技术制备⁹。本研究中使用的 MOC 芯片微流控设计包含两个独立的微流控回路，每个回路包含两个细胞培养腔室，由高 100 µm 的通道系统相互连接。这使得单个多功能器官芯片可同时进行两个独立的双组织共培养实验。通过调节泵送频率，使培养基流速达到 40 µl/min。

这种双组织器官芯片设计实现了在独立的培养空间内共培养肝类球体和皮肤穿孔活检组织，同时在生理流动条件下通过共用的培养基回路进行灌注。将分化后的HepaRG细胞与人肝星状细胞（HHSteC）按24:1的比例混合聚集，形成均一的类球体。该比例经前期实验验证为最佳比例。 ¹⁰，尽管所用的肝细胞数量几乎是之前的两倍 体内 该皮肤模型在Transwell细胞培养插件内的气液界面进行培养，从而实现物质的局部暴露。这些组织模型在MOC中共同培养28天，以验证该系统的综合性。此外，芯片中的微流控通道完全覆盖人真皮微血管内皮细胞（HDMEC），以更接近模拟血管系统。

方案

注意：人类幼年包皮组织在符合相关法律规定的前提下，经知情同意及伦理批准（德国柏林夏里特医学院伦理委员会），于小儿外科常规包皮环切术后获得。

1. 在MOC中培养用组织等效物的制备

1. 在悬滴板中聚集 HepaRG 和 HHSteC 细胞以生成肝类球体。
   1. 为了实现贴壁培养于细胞培养瓶（75 cm²）中的 HepaRG 细胞的胰酶消化，移除完全分化且融合的单层细胞培养基，用 PBS 洗涤两次，加入 3 ml 0.05% 胰蛋白酶/EDTA。在 37 °C 下孵育 3 至 5 分钟，并通过加入 6 ml 胰蛋白酶抑制剂终止反应。
   2. 将 HepaRG 细胞以 150 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml HepaRG 细胞培养基中并计数细胞。细胞活力应>90%。
   3. 为了实现 HHSteC 细胞的胰酶消化，移除单层细胞的培养基，用 PBS 洗涤两次，加入 3 ml 0.05% 胰蛋白酶/EDTA。在 37 °C 下孵育 5 分钟，并通过加入 6 ml 胰蛋白酶抑制剂终止反应。
   4. 将 HHSteC 细胞以 150 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml HepaRG 细胞培养基中并计数细胞。
   5. 以 24:1 的比例在 HepaRG 细胞培养基中混合 HepaRG 和 HHSteC 细胞。为此，通过在 HepaRG 细胞培养基中稀释细胞悬液来调整细胞数量，并将 1 × 10⁵ 个细胞/ml 的 HHSteC 加入 4.8 × 10⁶ 个细胞/ml 的 HepaRG 细胞中。轻轻混匀。
   6. 通过向悬滴板和接收板中各加入 2 ml PBS 来准备悬滴板。
   7. 用移液器将 20 µl 细胞悬液加入悬滴板的每个孔中。为确保获得足够的类球体，应比实际所需数量多准备约 10% 的悬滴，因为在操作过程中会损失部分类球体。小心地将板放入 37 °C 培养箱中。等待 48 小时以形成类球体。
   8. 为回收类球体，务必使用具有宽口末端的移液器吸头，或用无菌刀片剪去 1 ml 移液器吸头的尖端，以扩大开口至约 2 至 3 mm。使用此类移液器吸头操作类球体，避免破坏其结构。
   9. 使用移液器反复向悬滴板各孔顶部加入 1 ml 培养基，轻柔冲洗下类球体。持续冲洗直至所有类球体脱落。此时类球体呈轻微扁平状，中等直径为 300 至 400 µm，高度为 200 至 300 µm。
   10. 将类球体收集至接收板中，并使用已准备好的移液器吸头将其转移至超低吸附 24 孔板中，每孔最多放置 20 个类球体。将每孔培养基体积调整为 0.5 ml。使用 20 个类球体接种一个 MOC 回路，以实现相对于in vivo细胞数量的 1/100,000 微型化比例。
   11. 将类球体在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育，直至在 MOC 中进一步使用。为保证可比性，类球体使用前存放时间不得超过三天。在超低吸附板中至少培养类球体一天，以获得均一的类球体。
2. 采用以下两种方法之一生成皮肤组织等效物：使用穿孔活检组织（1.2.1）或使用现成的in vitro组织模型（1.3.1）。
   1. 使用烧热的刀片在支架下方切割 transwell，制备 96 孔细胞培养插件，并在无菌条件下保存至后续使用。
   2. 将包皮样本在 80% 乙醇中灭菌 30 秒，切开环状组织。样本平均高度应为 2 mm。
   3. 使用活检打孔器切割直径为 4.5 mm 的活检组织，以确保肝脏和皮肤具有相同的微型化比例。用镊子将活检组织装载至已准备好的 96 孔 transwell 插件中。注意将组织的表皮侧朝上放置。
   4. 将带有活检组织的细胞培养插件放入含有 HepaRG 细胞培养基的接收板中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下保存，直至在 MOC 中进一步使用。样本存放时间不得超过 2 至 3 小时。
3. 将从不同供应商购买的现成in vitro皮肤模型整合至 MOC 中，确保其为 96 孔 transwell 格式。使用供应商提供的细胞培养基；若后续计划与其他组织共培养，则使用可同时支持两种组织的最低限度培养基。在进行动态实验前，应通过静态实验测试该最低限度培养基对组织的支持能力。
   1. 从载体板中取出皮肤模型，并使用烧热的刀片在支架下方切割 96 孔插件。
   2. 将插件放回接收板中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下保存，直至在 MOC 中进一步使用。样本存放时间不得超过一天。

2. MOC 制备

1. 按10:1（v/v）的比例混合PDMS与固化剂，并将混合物置于真空环境中15分钟，以去除气泡。
2. 同时，在80 °C条件下，用硅橡胶添加剂处理聚碳酸酯盖板20分钟。
3. 将聚四氟乙烯（Teflon）螺钉插入盖板的相应孔位，形成微泵中四个不含PDMS的细胞培养区域和六个厚度为500 µm的PDMS膜。
4. 将制备好的盖板连接至两个微血管回路的主模具上，注入已脱气的PDMS。注意避免将气泡引入系统。若出现气泡，可通过倾斜装置尝试去除。
5. 将系统在80 °C下孵育60分钟，使PDMS层固化。
6. 从装置上取下主模具和聚四氟乙烯（Teflon）螺钉，并通过低压等离子氧化法将PDMS层键合到尺寸为75 × 25 mm²的玻璃载片上。
7. 将专用螺纹MOC接头拧入盖板的四个细胞培养区域。
8. 将装有培养基的注射器连接至雌性鲁尔接头转¼-28雄性接头，并将其拧入盖板上的MOC接头。
9. 通过反复推动和拉动注射器活塞，将培养基注入微流控回路中。
10. 在显微镜下检查通道内培养基的填充情况是否正常。

3. 器官芯片的内皮化

1. 在对器官芯片（MOC）进行内皮细胞化之前，先用内皮细胞生长培养基冲洗每个MOC回路，并在37 °C和5% CO₂条件下静态培养三天。
   1. 使用乙醇擦拭对MOC进行消毒，并将其置于超净工作台下。此外，对两对镊子和两个六角扳手进行灭菌以供后续使用。
   2. 使用六角扳手松开MOC组织培养腔室的盖帽，并用镊子取下盖帽。加入培养基后，以相同方式将盖帽重新拧回MOC上。
2. 为实现人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）的消化，从单层培养物中移除培养基，用PBS洗涤两次，然后加入3 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA。在37 °C下孵育5分钟，并通过加入6 ml胰蛋白酶抑制剂终止反应。
3. 在220 × g条件下离心HDMEC细胞5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml内皮细胞生长培养基中并进行细胞计数。细胞活力应>90%。
4. 用内皮细胞生长培养基稀释细胞悬液，调整细胞浓度至最终浓度为2 × 10⁷ 个细胞/ml，并将其中250 µl转移至1 ml注射器中。采用该细胞浓度接种MOC，以保持所有器官的微型化比例为1/100,000。
5. 将注射器连接至雌性鲁尔接头与¼-28雄性接头的转换器，排出该连接件中的空气，然后将其拧接到专用螺纹MOC适配器上。将该适配器连接至每个MOC回路的两个腔室之一。
6. 以相同方式将一个空注射器连接至MOC回路的第二个腔室。
7. 通过连续多次推动和拉动两个注射器的活塞，均匀注入细胞。在显微镜下控制细胞灌注过程。
8. 将MOC在37 °C和5% CO₂条件下静态孵育3小时，使细胞贴附于通道壁上。
9. 从培养箱中取出芯片，置于超净工作台下，将注射器和MOC适配器更换为专用螺纹MOC细胞培养室。
10. 向每个MOC回路的一个腔室中加入400 µl新鲜培养基，使其在静水压作用下流经通道。随后，将两个腔室中的培养基均更换为300 µl新鲜培养基。
11. 按照步骤3.1.2所述方法，使用盖帽封闭腔室。
12. 将芯片连接至泵控单元。将泵送速度调节至频率0.475 Hz，并在37 °C和5% CO₂条件下培养芯片。
13. 每隔一至两天更换一次各MOC腔室的培养基，并通过光学显微镜监测细胞形态。

4. 芯片的加载

1. 将MOC置于超净工作台下，并按照步骤3.1.2所述方法打开。
2. 从组织培养腔室中移除培养基，并加入300 µl新鲜的HepaRG细胞培养基。
3. 使用带有宽口的移液器吸头，将20个预先形成的类球体转移至每个MOC回路的一个组织培养腔室中（见步骤1.1.8/9）。使用镊子和六角扳手拧紧盖子。
4. 使用镊子将含有皮肤等效物的96孔细胞培养小室转移至每个MOC回路中剩余的组织培养腔室。注意避免皮肤等效物膜下方产生气泡。为此，应将Transwell小室以轻微倾斜的角度插入，并轻轻下压。用移液器吸除因下压而从底部溢出的小室周围的多余培养基。
5. 使用镊子和六角扳手拧紧盖子。

5. 将芯片连接至泵控制单元

1. 将控制单元的操作参数设置为所需数值。调节气压范围为0至8,000 mbar，真空度范围为0至-800 mbar，泵送频率范围为0.24至2.4 Hz。设定泵送方向为顺时针或逆时针。
2. 从超净工作台下取出含有组织等效物的MOC，并将其连接至泵控制单元。
3. 根据管路编号，将气压管路插入MOC上对应的接口。
4. 将MOC置于37 °C和5% CO₂的培养箱中进行培养；若需进行活体组织成像，可使用MOC加热支架将芯片加热至37 °C，并在培养箱外培养芯片。使用加热支架可在标准显微镜下对MOC中的细胞进行培养。

6. 培养基更换、培养基取样及物质暴露处理

1. 根据所培养组织的类型及细胞的代谢活性，每天或每隔一天进行一次常规换液。
   1. 从培养箱中取出MOC，在显微镜下观察，以控制培养基流速并检查是否存在污染。
   2. 通过拔下气压管路将MOC与泵控制单元断开。使用乙醇擦拭MOC表面进行消毒，并将其置于超净工作台内。
   3. 打开含有肝类球体的组织培养腔室，操作方法见步骤3.1.2。
   4. 使用移液器从腔室中移除最多200 µl培养基，避免扰动类球体结构，并将培养基储存于深孔板的空孔中。可直接分析培养基样品，或封闭深孔板后将样品在-80 °C保存以备后续分析。
   5. 用最多250 µl新鲜细胞培养基替换MOC中的原有培养基，并盖上盖子。替换体积略大于移除体积，以补偿系统关闭时芯片微量泄漏造成的损失。
   6. 此时打开容纳皮肤等效物的组织培养腔室盖子，检查组织完整性。注意避免向系统中引入气泡。检查后关闭盖子。
   7. 按照步骤5.3，将泵控制单元的管路重新连接至MOC，并将MOC放回培养箱中。

7. 分析每日的培养基样品并进行在线分析

1. 使用活细胞成像在线分析组织培养性能，或通过分析每日培养基样品进行离线分析。后者采用标准常规酶学检测方法进行例如 乳酸脱氢酶（LDH）活性）或ELISA（例如 白蛋白浓度）。以下描述了在线分析方法。
2. 移除内皮化MOC的培养基，具体步骤如6.1.1至6.1.4所述，并在两个组织培养腔室中分别加入200 µl含10 µg/ml荧光标记乙酰化低密度脂蛋白（LDL）的溶液（用细胞培养基稀释）。
3. 盖上盖子。根据步骤5.3将MOC连接至泵控制单元，并以0.475 Hz的频率泵送30分钟，使溶液在微流控回路中均匀分布。
4. 停止灌流，将MOC在37 °C、5% CO₂条件下静置孵育3.5小时。₂.
5. 与步骤7.2类似，从两个区室中移除乙酰化LDL溶液，并向其中一个区室加入400 µl新鲜培养基。
6. 等待3至5分钟，使静水压力推动培养基流经微流控通道回路。
7. 将流过的培养基替换为300 µl新鲜培养基，同时向第二个组织培养室中加入300 µl新鲜培养基。
8. 根据步骤3.1.2关闭MOC，将其置于荧光显微镜下，观察细胞生长状态和存活情况。
9. 将染色后的MOC放回培养箱继续培养。每次更换培养基时，清除从细胞中渗出的染料。

8. 从微器官芯片中取出组织等效物并进行终点分析

1. 在实验结束时，从多器官芯片（MOC）中取出组织等效物，用于终点分析。
   1. 为从多器官芯片（MOC）中取出肝脏和皮肤等效物，按照步骤 6.1.1 至 6.1.4 所述方法，移除每个组织培养腔室中的培养基。
   2. 使用镊子将含有皮肤的 96 孔细胞培养小室从多器官芯片（MOC）中取出。用镊子夹住小室一侧的膜，小心地向下剥离。注意在此过程中避免丢失皮肤等效物。
   3. 将承载皮肤等效物的膜包埋于冷冻包埋剂中，并在 -80 °C 下保存，直至进一步分析。
2. 使用剪去尖端的移液器吸头（参见步骤 1.1.8/9），通过移液方式，类似地从组织培养腔室中取出肝脏等效物。
   1. 将肝类球体包埋于冷冻包埋剂中。注意避免转移过多液体，并用移液器吸除多余液体。将类球体置于包埋剂上并去除培养基后，再在类球体上方添加足够的冷冻包埋剂，使其完全包裹。
   2. 将肝脏等效物冷冻，并在 -80 °C 下保存，直至进一步分析。
3. 按照先前的实验方案¹⁰所述，使用冷冻切片机将组织等效物切成 8 µm 的切片，并进行组织特异性标志物染色，以完成终点分析。

结果

标准的体外组织培养通常在静态条件下进行，这限制了氧气和营养物质向组织的扩散。尽管流体系统具有更优的供给特性，但往往因其对培养基的大量需求而受限，导致培养基与组织的比例远高于生理水平。因此，代谢产物被稀释，细胞无法有效调控其周围微环境。本研究中介绍的多器官芯片（MOC）通过微流控通道系统连接两个独立的组织培养腔室，每个腔室的尺寸相当于标准96孔板的一个孔。该系统的微型化设计以及芯片上集成的泵结构，使其可在仅200至800 µl的培养基体积下运行。对于肝脏与皮肤组织共培养（总组织体积约为26 µl），这分别对应8:1至31:1的总体系统培养基与组织比例。一名体重73 kg的成年男性，其细胞外液总量为14.6 L，其中毛细血管间液为5.1 L，由此得出生理状态下的细胞外液与组织比例为1:4。因此，尽管MOC整个循环系统中的培养基总量仍高于生理水平，但该比例是目前多器官系统中报道的最小培养基与组织比例⁵。由于保留了工业标准的组织培养格式，研究人员能够在共用的流体环境中整合已有的、且已被验证的静态组织模型。图1展示了MOC单组织或多种组织共培养可能的实验装置示意图。原代组织活检样本，或由细胞系或原代细胞在体外构建的组织等效物，均可通过96孔细胞培养小室，或直接放置于组织培养腔室中进行培养。由于连接各细胞培养腔室的通道系统高度仅为100 µm，尺寸超过此限的组织等效物将被保留在培养腔室内。利用原代人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）对MOC回路进行内皮化，进一步构建了生物学血管结构，使培养条件更接近生理状态。

图1：MOC培养物的示意图。 组织等效物在标准条件下制备 体外 条件，在MOC中接种，并在动态条件下作为单培养或共培养进行培养。每天采集培养基样本并进行终点分析。通过从上方连接到MOC的三条蓝色管道施加气压以驱动泵。 请点击此处以查看此图的放大版本。

按照内皮化方案，在动态培养四天后，即可在微流控通道回路中获得融合的 HDMEC 覆盖，如图2所示。细胞迅速黏附于MOC通道壁，形成融合的单层结构，并沿剪切应力方向伸长（图2B）。此外，细胞覆盖了通道的整个周长，与先前报道一致⁹。在培养四天后直至培养结束，未再观察到内皮细胞形态的进一步变化。

图 2：内皮化多器官芯片通道。 人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）在微流控回路中形成融合的单层。在多器官芯片培养 23 天后，细胞经乙酰化低密度脂蛋白染色。（A）整个微血管回路均被细胞覆盖；（B）细胞沿剪切应力方向伸长。比例尺：（A）1,000 µm 和（B）100 µm。

在另一项实验中，HepaRG 和 HHSteC 细胞在悬滴培养条件下培养两天后，形成了形态一致的圆盘状肝细胞球体，该模型系统此前已被报道适用于药物代谢研究^11–13。为演示目的，每个器官芯片（MOC）回路中的一个组织培养腔室接种了 20 个球体，置于 96 孔细胞培养插件中，并在无内皮化的 MOC 中动态培养 14 天。任意数量的细胞聚集体或原代材料均可直接接种于腔室内，或通过细胞培养插件整合入系统。从器官芯片中回收球体后进行免疫荧光染色，结果显示肝细胞特异性细胞角蛋白 8/18 以及 I 相代谢酶细胞色素 P450 3A4 和 7A1 呈强阳性且均匀表达（图 3A 和 图 3B）。胆小管转运蛋白多药耐药蛋白 2（MRP-2）的染色结果表明球体具有极性表型，并形成了类似原始胆小管网络的结构（图 3C）。

图3：在MOC中培养人源人工肝微组织。 在MOC中培养14天的肝类器官分别进行以下染色：（A）细胞角蛋白8/18（红色）；（B）细胞色素P450 3A4（红色）和7A1（绿色）；（C）胆小管转运蛋白MRP-2（绿色）以及细胞核的蓝色染色。比例尺：100 µm。

由于白蛋白的产生是肝组织培养的一个基本前提，因此被选为在多器官芯片（MOC）中监测肝脏典型功能的指标。对培养基中白蛋白产量的每日分析显示，与静态培养相比，MOC培养中的白蛋白产量显著升高（图4），且高于文献报道的数值¹¹。白蛋白合成速率的提高可能归因于MOC培养中氧气和营养物质供应的增加。因此，MOC能够在14天的培养期内维持肝细胞聚集体处于代谢活跃状态，增强其肝脏典型功能，如白蛋白的产生。

图4：肝脏类球体在MOC中14天的功能表现。 MOC与静态培养中肝脏单组织培养的白蛋白生成量。数据为均值±标准误（n = 4）。

根据经济合作与发展组织（OECD）指南第410号《重复剂量皮肤毒性：21/28天研究》的规定，化学品和化妆品在动物体内的亚系统重复剂量毒性测试需要21至28天的暴露期。本文以持续长达28天的皮肤-肝脏共培养体系为例，以满足监管要求。通过在96孔细胞培养小室中培养皮肤活检组织，为后续的皮肤给药提供气-液界面。共培养实验以具有内皮化的多器官芯片（MOC）为例进行，以验证在联合培养基回路中，三组织共培养体系是否能够在28天内维持细胞活力和代谢活性。

对培养基上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性的分析显示，在培养的前8天内，LDH水平持续下降，此后稳定在约80 U/L（图5）。这表明在后期时间点，系统中存在一种人为但稳定的组织更替。与肝脏单组织培养及肝脏-内皮细胞共培养实验相比，三组织共培养中LDH水平显著降低，尤其是在未包含皮肤的培养体系的早期阶段更为明显。在LDH活性较高的最初阶段，细胞死亡主要发生在皮肤培养区，这一点由皮肤单组织MOC培养实验所证实（数据未显示）。这可能是由于皮肤穿孔造成的活检周围损伤区域所致。

图 5：MOC 中组织十五天的功能表现。 肝单组织培养（MOC Li）、内皮化 MOC 中的肝培养（MOC Li-Va）以及内皮化 MOC 中的肝-皮肤共培养（MOC Li-Va-Sk）培养基上清液中的 LDH 活性。数据为均值 ± 标准误（n = 4）。

在28天的培养期间，肝类球体附着在微器官芯片（MOC）底部，细胞向外生长，相邻类球体之间形成多层连接结构，但这并未影响组织的功能性。通过免疫荧光进行终点分析显示，肝类球体在MOC共培养28天后仍具有代谢活性，这由细胞色素P450 3A4染色结果证实（图6A）。由波形蛋白染色可见，人肝星状细胞（HHSteC）分布于整个肝等效物中（图6B）。在细胞从类球体向外生长的区域，波形蛋白染色强度有所增强。血管性血友病因子（vWF）染色显示，内皮细胞并未深入组织内部，而是与外层肝细胞保持直接的细胞-细胞接触（图6C）。

皮肤活检的免疫组织化学染色显示，在基底膜处存在腱生蛋白C（tenascin C）和IV型胶原蛋白的表达（图6D），而静态对照组染色则显示腱生蛋白C水平升高（图6E）。已有研究表明，腱生蛋白C在伤口愈合、炎症过程和纤维化过程中表达上调，提示在静态培养中存在纤维化过程的诱导，而在动态培养中则无此现象^14,15。

在MOC系统中经过28天共培养后，组织的细胞活力和功能保持稳定，证明该系统能够在共同的培养基循环中维持最多三种组织的组合。原代细胞、组织模型以及活检组织均可在MOC系统中同时进行培养。

图6：多组织培养在28天内的表现。 肝类器官和皮肤活检组织在内皮化的MOC中培养，并通过免疫染色显示细胞功能：（A）I相酶细胞色素P450 3A4（红色）、（B）波形蛋白（vimentin，红色）、（C）细胞角蛋白8/18（cytokeratin 8/18，红色）和vWF（绿色）在肝组织中的表达。共培养28天的皮肤活检组织：（D）在MOC中或（E）在静态条件下，经tenascin C（红色）和胶原蛋白IV（collagen IV，绿色）染色，细胞核呈蓝色。（F）MOC培养28天后皮肤的H&E染色。比例尺：100 µm。

讨论

本文所述的MOC平台是一种稳定且功能强大的工具，可在动态培养基流动条件下长期培养多种来源的组织^10,16。在此示例中，该平台被用于培养原代细胞（HDMEC）、由细胞系生成的组织等效物（肝脏类聚体）以及上述细胞与组织活检样本的共培养体系。MOC能够在联合培养基回路中维持三组织共培养长达28天。据作者所知，这是首次实现包含活检组织、原代细胞和细胞系的多组织共培养持续超过四周。

微流控系统的主要缺点之一是小分子容易吸附到流体回路的表面材料上。由于微流控系统具有极高的表面积与体积比，这一效应尤为显著 ¹⁷此处引入的稳定HDMEC通道覆盖层可能作为一种生物屏障，防止分子黏附于MOC。此外，它还可作为血液相容性血管用于全血循环，防止血液凝固。然而，将全血作为培养基替代物尚不可行，因为器官等效物的完全血管化尚未实现。目前关于血管化方面的研究进展 体外生成的组织具有广阔前景，为后续研究提供了方向 ^18,19.

众所周知，肝细胞在静态的二维体外培养条件下会随着时间推移逐渐丧失其肝脏特异性功能²⁰。如果需要研究某种药物的代谢过程，代谢酶（如细胞色素P450家族）尤为重要。在MOC中培养14天的肝细胞聚集体中，检测到与多种异源物质生物转化相关的细胞色素P450 3A4以及参与胆汁酸合成的细胞色素P450 7A均有表达。这表明肝细胞保持了具有代谢活性的表型，可用于开展药物代谢研究。此外，MOC中肝细胞聚集体的白蛋白生成速率高于静态培养，进一步说明该培养系统条件适宜。本研究中观察到的白蛋白生成速率与既往采用包含HepG2细胞的微流控芯片所报道的结果相当甚至更高^21–23，但仍未达到原代人肝细胞培养的水平²⁴。此外，当前MOC系统的临时结构尚无法实现胆汁的独立分离。肝细胞聚集体中的细胞发生了极化，并形成了类似胆小管的结构，MRP-2染色结果证实了这一点。然而，这些胆小管结构并未与用于收集胆汁的技术通道相连通。在未来系统重新设计中，需解决胆汁与血液腔室非生理性混合的问题。

调节流动特性具有重要意义²⁵，尤其是对于对剪切应力敏感的组织，例如肝脏。组织所承受的剪切应力可通过两种方式进行调整：首先，可降低用于推动泵膜的气压，从而降低系统中的峰值剪切应力；其次，可将组织包埋于细胞外基质层中，或在Transwell培养小室中进行培养。后者通过多孔膜使组织免受下方流体的直接冲击。在启动多器官芯片（MOC）实验之前，必须针对每种类器官个体化地进行上述调整。例如，在2.4 Hz的脉动频率下运行时，相当于人类144次/分钟的较高但仍在生理范围内心率，微血管回路通道中测得的剪切应力约为25 dyn/cm²。该数值处于微血管生理剪切应力范围的上限，因此非常适合需要对通道进行内皮化处理的实验。然而，由于当前所介绍的MOC系统微流控结构仅包含一个连接两个器官腔室的培养基回路，因此整个系统必须采用统一的泵送速度和剪切应力水平。因此，并不总是能够精确地将流动特性调节至每种单一器官的实际需求。

此外，在将细胞调整至共用培养基时需格外注意。在多器官芯片（MOC）中，细胞通过联合培养基回路进行培养，因此无法像常规操作那样为每种组织模型单独使用特定的细胞培养基。 体外 细胞培养。需要预先确定最小联合培养基配方，并逐步将细胞适应至该新培养基。我们通常采用如下适应程序：前两天使用80%/20%的旧/新培养基混合液，随后为50%/50%，再转为20%/80%，最后完全更换为新培养基，此过程始终能够获得理想的细胞活力和培养功能。

当前MOC系统的微流控布局允许最多三种组织的共培养。要达到稳态，需要至少人体十个最重要器官的共培养。因此，该系统能够预测特定的组织间相互作用，但尚不能预测物质的真实全身反应。未来计划进一步开发MOC系统，以纳入更多器官腔室。此外，拟通过一组参考化合物来验证该系统的有效性。优先选择在临床试验中失败的化合物（如曲格列酮）来测试其在MOC系统中的表现。然而，由于在功能评估的生物标志物和终点指标方面仍缺乏标准化，此类复杂系统的真正验证仍受到限制；但积累更多关于该系统及类似系统毒理学性能的数据，将有助于提高其可靠性和应用范围。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HepaRG 细胞	Biopredic International		未分化的细胞
HHSteC	ScienCell Research Laboratories		细胞及所有培养补充剂
HepaRG 培养基	Sigma-Aldrich		William's Medium E 10% FCS 100 U/ml 青霉素 100 µg/ml 链霉素 5 µg/ml 人胰岛素 2 mM L-谷氨酰胺 5 x 10-5 M 氢化可的松半琥珀酸酯
HDMEC 培养基	PromoCell		内皮细胞生长培养基 MV2，含 MV2 补充剂套装和 1% 青霉素-链霉素
二甲基亚砜	Carl Roth		在 HepaRG 培养基中添加 2%
胰蛋白酶/EDTA	Biowest
胰蛋白酶抑制剂	Carl Roth
MAXYMum Recovery Tips	Corning		1,000 µl 宽口移液吸头
384 孔悬滴板	3D Biomatrix		Perfecta 3D 384 孔悬滴板
组织培养瓶	Corning		75 cm2
超低吸附板	Corning		24 孔
Transwell 细胞培养小室	Corning		96 孔单元，0.4 µm 孔径
深孔板	Corning		96 孔，1 ml
活检打孔器	Stusche		4.5 mm
玻璃显微镜载玻片	Menzel		尺寸为 75 x 25 mm
聚二甲基硅氧烷	Dow Corning		Sylgard 184
硅橡胶添加剂	Wacker Chemie		Wacker Primer G790
气压管路	SMC Pneumatik GmbH		Polyurethan-Schlauch, metrisch
人白蛋白 ELISA	Bethyl Laboratories		人白蛋白 ELISA 定量试剂盒
乳酸脱氢酶检测	Stanbio Laboratory		LDH Liqui-UV 试剂盒
Alexa Fluor 594 标记的乙酰化低密度脂蛋白	Invitrogen		1 mg/ml