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方法文章

利用小鼠乳腺肿瘤细胞讲授核心生物学概念：一个简单的实验模块

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DOI：

10.3791/52528

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2015年6月18日

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Marymount Manhattan College

本文内容

摘要

本文介绍了一种适用于生物专业本科生的可行实验课程模块，该模块利用动物细胞培养技术探讨高级的细胞与分子生物学概念。学生通过化疗药物处理，培养、鉴定并操控一种乳腺癌细胞模型。通过传统和新型两种方法进行细胞计数，以检测细胞活力。

摘要

本科生物专业学生需要学习、理解并应用多种细胞与分子生物学概念和技术，为进入生物医学、研究生教育、专业课程或从事科学相关职业做好准备。为此，设计了一个简单的实验模块，通过动物细胞培养技术来教授细胞分裂、细胞通讯以及癌症相关的知识。本实验采用小鼠乳腺肿瘤（MMT）细胞系作为乳腺癌的模型。学生将学习如何在体外培养并鉴定这些动物细胞，并测试传统与非传统化疗药物对细胞增殖的影响。具体而言，学生需确定铺板和培养细胞的最佳细胞浓度，掌握药物溶液的配制与稀释方法，筛选抗增殖剂的最佳剂量和处理时间，评估不同处理条件下细胞死亡的速率。该实验模块既采用了血细胞计数板进行细胞计数的标准方法，也引入了基于显微镜软件的新型细胞计数技术。实验设计具有开放性探究的特点，学生可对实验方案中的关键步骤进行修改，例如测试顺势疗法制剂或非处方药物的效果。总之，该实验模块要求学生运用科学探究过程，综合应用其在细胞周期、细胞信号通路、癌症及其治疗方式方面的知识，同时培养一系列通常在本科课堂教学中较少涉及的实验技能，包括细胞培养和实验数据分析能力。

引言

在本科阶段的普通生物学课程中，细胞周期调控和癌症等主题通常只是被简要提及，而无法深入探讨，因为这些课程内容广泛，难以兼顾深度。此外，本科生通常很少接触与动物细胞培养相关的高级技术。为了帮助学生更深入地理解这些概念，并应用和分析所学知识，本实验活动是在Walter Reed Army Institute of Research（WRAIR）扩展实验活动的基础上改进而设计的1。该实验模块采用逐步推进的实验策略，包括培养和鉴定一种癌细胞模型、建立并实施细胞计数方法、确定使用抗增殖剂处理细胞的最佳时间进程和剂量，以及识别异常的细胞信号通路。该实验还支持开放式探究。

完成本实验活动所需的大多数技术均可在典型的生物学教学实验室中实现。活动开始时，学生将对小鼠乳腺肿瘤（MMT）细胞系的形态和生长速率进行表征，该细胞系是人类乳腺癌的模型2 . 选择乳腺癌作为模型癌症，是因为其在人群中的高发病率、大学生群体对其的熟悉程度，以及可获取的广泛研究数据。MMT细胞系被特别选用，是因为其易于获取、特征明确、倍增时间短且易于培养。此外，MMT细胞具有雌激素依赖性，这与大多数女性乳腺癌的特性一致。随后，学生通过使用作用机制明确的化疗药物处理细胞，识别MMT细胞中异常的细胞信号通路。通过改变药物浓度和处理时间，学生可评估这些变量对细胞分裂速率的影响。本实验活动的关键检测指标是细胞活力的测定，该测定仅需通过两种方法之一进行细胞计数即可完成。每种方法均依赖于扎实的显微镜操作技能。学生将采用标准的血细胞计数板法和一种新型的显微摄影法测定细胞活力，并基于实验结果提出改进方案。随后，学生将对数据进行可视化表达，并解读结果以修正假设，进而设计新的实验策略。

本实验活动适用于生物科学专业大一或大二水平的学生，浓缩为一个可在第一学年普通生物学或第二学年细胞/分子生物学课程中完成的为期一周的实验模块。顺利完成本活动所需技能包括基础算术与代数知识，以及对一系列核心实验技能的掌握（例如移液、溶液配制、无菌操作）、数据分析、基础光学显微镜使用和时间管理，以及教师对细胞培养和电子表格软件的掌握。所需试剂包括一种用于癌症研究的动物细胞系模型（例如，小鼠乳腺肿瘤细胞，MMT2），化疗药物（例如，他莫昔芬、姜黄素、二甲双胍和阿司匹林），台盼蓝及细胞培养基例如, Eagle's 最低必需培养基；EMEM）并添加适当的补充物（例如，供体马和胎牛血清）。所需仪器包括配备数码相机的倒置显微镜、计算机、100 mm 和 24 细胞培养板，CO₂2 培养箱（或同等设备）、生物安全柜（BSC；II级）、血细胞计数板、数字显微成像软件。

已有不少优秀的实验教学案例，利用动物细胞培养向本科生讲授细胞生物学的相关概念3。然而，许多实验需要不易获取的材料或技术（例如，放射性同位素、活体动物组织、高级成像设备1,4,5），或所描述的实验方案较为复杂（例如，适用于高年级课程6），或需持续数周甚至整个学期的项目周期6,7。本文所述的实验教学活动操作简便，仅需常规实验设备，可在一周内完成。

总之，本实验模块在教授基本和高级实验技能、实验数据分析、动物细胞培养方法以及科学探究过程的同时，有效引入或强化了细胞周期、细胞信号通路和癌症等相关概念。该实验模块设计简洁、成本低廉，具有良好的可及性，同时提供了灵活性和开放式探究的机会。本活动通过提供一个作为指导而非固定步骤的实验策略模板，鼓励学生的创造性思维。最重要的是，该活动涵盖了布鲁姆教育目标分类法8的全部学习层次，要求学生进行记忆、理解、应用、分析、评价和创造，使学生参与到真实的科学研究过程中，从而脱离教科书的局限，进入科学研究的真实世界。

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方案

注意事项：所有涉及细胞及细胞培养试剂的操作均须在II级生物安全柜（BSC）中进行9MMT细胞被归类为生物安全一级，因其具有较低至中等的生物风险。每次使用生物安全柜（BSC）前后应实施适当的清洁和去污程序。例如，紫外光，70% 乙醇擦拭）

1. 培养 MMT 细胞

  1. 在10 cm组织培养皿中培养细胞，培养皿内含10 ml富含营养的培养基，该培养基由添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺和1%抗真菌/抗生素（10单位青霉素、100 µg链霉素、0.25 µg两性霉素B）的Eagles最低必需培养基（EMEM）组成。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。以3.6 x 106 cells/cm2的密度接种细胞（参见步骤2中的细胞计数方法）。
  2. 除非另有说明，每48小时更换一半的细胞培养基，补充新鲜培养基。通过倒置相差显微镜观察检查细胞活力和形态。
    1. 在100–200倍放大倍数下观察并记录细胞的大小、结构、形状、排列方式及估计数量。在此密度下，细胞应呈单层分布，不重叠成团，彼此紧密相邻。每个细胞包含一个厚实的球形核心，并从核心延伸出细长、分支状的突起，末端呈尖状（见图1）。
  3. 当细胞密度达到7.2 x 106 cells/cm2时进行传代。细胞每24小时增殖速率为1.8 x 106 cells/cm2。将细胞标记为第X代（Px），以表示其已被传代的次数。
    1. 在第3代（即，经过三次传代后，P3），收获细胞，计数后以3.6 x 106 cells/cm2的密度接种至24孔组织培养板中。
  4. 每天观察细胞，并记录数字显微图像。记录并描述细胞形态（即，大小、形状、光反射特性）。通过定期计数细胞并将细胞数量与经过时间关联，确定细胞倍增时间。

2. 计数 MMT 细胞

注意：计数细胞以确定是否需要传代培养、为实验做准备或评估细胞活力。此处提供了两种方法。

  1. 使用血细胞计数板，一种标准的细胞计数技术。
    1. 获取亮线血细胞计数板、0.2%台盼蓝染液、光学显微镜、无菌试管、移液器及手动细胞计数器。
    2. 在生物安全柜中，使用10 ml移液管从10 cm组织培养皿中吸出细胞。若细胞培养于24孔板中，则使用1 ml移液管或1,000 µl微量移液器移除培养基。
    3. 将细胞培养基吸入移液器，将移液器枪头紧贴培养皿底部，在沿培养板表面滑动枪头的同时排出培养基。重复此操作4至5次，以帮助脱离细胞、分散细胞团块，从而获得更准确的细胞计数。
    4. 将所得的细胞悬液置于15 ml无菌离心管中（或1 ml微量离心管或其他小体积离心管）。否则，可将细胞保留在原组织培养板/孔中。
    5. 在生物安全柜内，取10 µl细胞悬液与10 µl台盼蓝溶液（1:1比例）混合于非无菌微量离心管或其他小体积管中。
      注意：台盼蓝是一种活体染色剂，健康活细胞不会吸收该染料。当细胞受损或死亡时，台盼蓝可进入细胞内，从而可对死细胞进行计数（又称 染料排除法因此，在显微镜下，死细胞呈深紫色，而活细胞颜色明亮且浅淡。
    6. 室温孵育5分钟。
    7. 将盖玻片置于血细胞计数板上。取10 µl台盼蓝-细胞悬液混合物加入槽中。在100–200倍显微镜下观察血细胞计数板，可见四个角的方格区域（见 图2).
    8. 统计每个带网格区域中活细胞（未染色）与总细胞的数量。取四个网格的平均值，乘以 1 × 104 获得细胞/毫升。
      1. 推算每皿细胞总数（或每平方厘米细胞数）2）。使用此数值确定为新培养板接种细胞时所需细胞悬液体积，以达到每平方厘米 3.6 × 10⁴ 个细胞的接种密度6 细胞/厘米²2 或测定培养板或孔中活细胞的总数。
        注：有关血细胞计数板使用的更多指导，请参见10.
  2. 使用软件和数码相机对活细胞进行计数。
    1. 获取一台数码相机及其配套软件、0.4%台盼蓝染液、一台复式光学显微镜、无菌试管、移液器和一台计算机。
      注意：此处使用配备相应 Motic 软件的 Moticam 2,000 数字相机。任何性能相当的相机及软件均可满足要求。请确保数字相机软件已根据制造商的协议预先完成校准。
    2. 在生物安全柜中，使用1 ml移液器或1,000 µl微量移液器，移除在24孔组织培养板中生长的MMT细胞的培养基。通过轻轻加入少量（约500 µl）未添加补充物的培养基，清洗贴壁细胞。 即，将10 µl 0.2%台盼蓝（用未添加任何补充物的EMEM按1:1稀释配制）直接加入孔中，然后更换新鲜培养基（即不含任何补充物的EMEM）。
    3. 室温孵育平板5分钟。
    4. 使用数码相机在显微镜下以100 - 200倍放大倍数观察培养板。 若使用2%台盼蓝染色过深，可用未添加补充物的培养基洗涤培养板。
    5. 打开计算机上的软件 and 并通过设置选项卡验证软件是否已针对所用物镜进行校准。视野（FOV）图像应出现。
    6. 选择 网格 来自 测量 一个宽度约为 0.005 cm 的方格网格将出现。选择 网格信息 以确认每个方格的面积。
    7. 选择网格中的特定区域进行细胞计数（即，5个方格 × 9个方格）。选择 矩形 来自 测量 点击方格的角落并拖动光标以选中所需方格。
      注意：所选方格区域将被绿色覆盖，角落处会出现一个白色框，显示所选网格区域的宽度、高度、面积和周长（参见 图3).
    8. 在已确定的区域内计数活细胞数量。通过在显微镜下移动培养板，在同一孔或培养板中的另外两个位置重复相同操作。
    9. 确保测量区域相同且放大倍数未发生变化。计算该区域内活细胞的平均数量。根据孔的面积（对于24孔板，每孔面积为2 cm²）2，对于直径为100毫米的培养皿，其表面积为78.6 cm²2），根据网格中划定区域的细胞数量，推算出孔内细胞的总数（细胞/cm²）2).

3. 使用抗增殖剂处理 MMT 细胞

  1. 在生物安全柜中配制所选的抗增殖治疗药物（他莫昔芬、 姜黄素和二甲双胍）以及可选药物阿司匹林的溶液。
    1. 将姜黄素和他莫昔芬溶解于100%乙醇中，配制成27 mM的储备液。将二甲双胍和阿司匹林分别溶解于未添加补充物的EMEM培养基中，配制成500 mM和15 mM的储备液。
  2. 建立剂量反应曲线。
    1. 用三种抗增殖治疗药物（他莫昔芬、姜黄素和二甲双胍）以及可选药物（阿司匹林）以不同浓度处理MMT细胞，持续96小时，以生成剂量反应曲线。初始时根据已发表文献1,11-16中报道的浓度范围给药，随后可尝试高于或低于文献报道的浓度。
      注：剂量反应实验用于确定产生预期效果所需的最低药物浓度。此处的预期效果是指与对照组相比，细胞增殖受到抑制。
      1. 对于他莫昔芬和姜黄素，使用以下浓度（及相应体积）：0.054 mM（1 µl）、0.108 mM（2 µl）、0.162 mM（3 µl）和0.216 mM（4 µl）。
      2. 对于二甲双胍，使用以下浓度（及相应体积）：2 mM（2 µl）、4 mM（4 µl）、6 mM（6 µl）、8 mM（8 µl）和10 mM（10 µl）。
      3. 对于阿司匹林，使用以下浓度（及相应体积）：0.030 mM（1 µl）、0.060 mM（2 µl）、0.099 mM（3.3 µl）、0.150 mM（5 µl）和0.216 mM（6.7 µl）。
    2. 将10 cm培养皿中的MMT细胞以3.6 × 106 个细胞/cm2的密度接种至24孔板中。通过两种细胞计数方法（步骤2）确定初始细胞浓度。将此新接种的24孔板细胞称为“分板日”。
    3. 细胞接种24小时后，用上述抗增殖治疗药物（他莫昔芬、姜黄素、二甲双胍和阿司匹林）以步骤3.2.1中所述浓度处理MMT细胞。将此时间点记为“第0天”。
      1. 由于每孔最多可容纳500 µl培养基，需使用带无菌吸头的微量移液器，并在处理每个新孔时更换新吸头，以避免交叉污染。设置两个对照孔：未接受任何药物处理的细胞（阴性对照）和在含100%乙醇环境中培养的细胞（溶剂对照）。
    4. 在96小时内（直至第4天），按照每隔一天换液时重新给药的方案，在指定浓度下继续培养细胞并重复给药（参见步骤1.2）。在治疗的第1至第4天期间，于显微镜下观察细胞，并采用步骤2.2中的方法进行计数（见图4）。
    5. 至少重复实验三次。
    6. 通过绘制整个实验过程中细胞活力与药物剂量之间的关系图，确定每种药物的最佳浓度（见图5）。
  3. 建立时间进程实验。
    1. 用三种抗增殖治疗药物（他莫昔芬、姜黄素和二甲双胍）以固定浓度处理MMT细胞，处理时间长短不一。所用浓度应为剂量反应实验中确定的最佳浓度（见步骤3.2）。
      1. 使用以下浓度：0.216 mM他莫昔芬、0.216 mM姜黄素和10 mM二甲双胍。
        注：时间进程实验用于确定药物产生最佳预期效果所需的时间。此处的预期效果是指与对照组相比，细胞增殖受到抑制。
    2. 将10 cm培养皿中的MMT细胞以3.6 × 106 个细胞/cm2的密度接种至24孔板中。通过两种细胞计数方法（步骤2）确定初始细胞浓度。将此新接种的24孔板细胞称为“分板日”。
    3. 细胞接种24 小时后，用在步骤3.2中确定的最佳浓度分别处理MMT细胞中的抗增殖治疗药物（他莫昔芬、姜黄素、二甲双胍和阿司匹林）。将此时间点记为“第0天”。
      1. 由于每孔最多可容纳500 µl培养基，需使用带无菌吸头的微量移液器，并在处理每个新孔时更换新吸头，以避免交叉污染。
      2. 设置两个对照孔：未接受任何药物处理的细胞（阴性对照）和在含100%乙醇环境中培养的细胞（溶剂对照）。
  4. 在96小时内（直至第4天），按照每隔一天换液时重新给药的方案，在选定浓度下继续培养细胞并重复给药（参见步骤1.2）。在治疗的第1至第4天期间，于显微镜下观察细胞，并采用步骤2.2中的方法进行计数（见图4）。
  5. 至少重复实验三次。
  6. 通过绘制在选定浓度下细胞活力与药物处理时间（时长）之间的关系图，确定MMT细胞对每种药物的最佳暴露时间（见图6）。

4. 实验室模块

注意：以下是本实验模块的5天实验安排。图7展示了在5天内该安排所包含的流程。要在五天内完成本实验，需选择生成时间过程曲线或剂量反应曲线之一；时间不足以同时完成两条曲线。下文描述的是剂量反应实验，时间过程实验可据此方便地替换进行

  1. 将班级分成小组：一组建立剂量反应曲线，另一组选择拟议剂量反应浓度范围中的中间浓度进行时间过程实验。
    1. 保持足够量的培养物和适当浓度的药物储备。除非另有说明，所有操作均应在生物安全柜内进行。
  2. 第1天
    1. 指导学生制备培养基并培养细胞（同步骤1）。
    2. 当学生在10 cm培养皿中获得MMT细胞后，指导其准备细胞培养基，并讲授血细胞计数板、数码显微镜及数码相机显微成像软件的使用方法（如步骤2所示）。
    3. 校准软件以匹配显微镜上使用的物镜例如， 4X、10X、20X）按照生产商的方案进行。
  3. 第2天
    1. 让学生确认总细胞数和细胞活力（如步骤2所述）。
    2. 让学生使用显微镜软件和血细胞计数板两种方法对100 mm培养皿中的细胞进行计数，以确认获得相似的结果。
    3. 指导学生取一个24孔板，将100 mm培养皿中的细胞按所需的起始接种密度分种到24孔板中（同步骤1）。此操作视为 日间分割将24孔板置于细胞培养箱中孵育24小时。
  4. 第3天
    1. 在24孔板中培养MMT细胞24小时。让学生在显微镜下观察细胞，并使用显微镜成像软件（如同步骤2）进行计数。
    2. 为学生/团队提供癌症治疗药物的储备液样本，让他们配制并稀释原始储备液（如步骤3所述），将不同浓度的药物加入细胞中，以建立剂量-反应曲线。这称为 第0天.
    3. 将细胞（步骤1.2）与药物共同孵育，最长时间不超过48小时。
  5. 第4天
    1. 让学生在处理24小时后观察细胞。这是 第1天.
    2. 使用显微成像软件对每个孔进行计数。拍摄每个孔的图像，以便可在实验室外进行计数（如步骤2所示）。
    3. 将细胞（步骤1.2）与药物共同孵育额外24小时。
      注：教师提供数据分析与图形展示的额外教程和复习内容。学生将学习为第二天的数据采集制作图表、绘图及进行统计分析。
  6. 第5天
    1. 让学生在48小时后处理细胞， 第2天
    2. 使用显微镜软件对每个孔进行计数。拍摄每个孔的显微照片，以便在实验室外进行计数（如步骤2所述）。
    3. 采用传统血细胞计数板法收获并收集细胞进行计数，以验证学生有效使用显微镜软件计数方法的能力（如步骤2所述）。
      注意：收集数据并据此得出结论或修正假设。

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结果

培养 MMT 细胞并比较计数方法。

小鼠乳腺肿瘤细胞成功培养并进行了表征（图1），并利用Motic软件（一种与显微镜配套的数码相机软件程序）开发了一种新的细胞计数方法。该新方法与使用血细胞计数板的传统计数方法进行了比较（图2），结果表明，两种方法在测定细胞数量方面具有同等的准确性（表1）。为排除不同培养条件或细胞类型对细胞数量的影响，两种细胞计数方法的比较分别在存在和不存在抗增殖剂的条件下进行，并采用了另一种细胞系——神经元模型PC1217。

图3展示了使用具有规定尺寸的叠加网格来界定该方法中细胞计数区域的结果。将网格覆盖在视野（FOV）上，然后在网格的指定长和宽（例如9×5个方格）处应用一个绿色框。在绿色框内计数细胞，并按照实验方案中的说明对外推细胞数量。

处理 MMT 细胞：确定抗增殖剂...

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讨论

本文介绍了一种实验课程模块，旨在通过动物细胞培养的先进技术，讲授细胞生物学中的多个主题。该模块通过分析多种抗增殖化学物质对模拟人类乳腺癌细胞复制的影响来实现这一目标。主要检测方法依赖于细胞计数这一基本技术，并引入了一种利用显微镜软件进行细胞计数的新方法。该模块所包含的各项实验活动可使用大多数生物学专业常见的仪器和设备完成。该模块可在5天内完成，所需耗材价格低廉且易于获取。尽管本实验使用了特定品牌的数码显微镜相机及显微成像软件（Motic Software），但任何性能相当的相机和软件均可替代使用。

本实验模块采用 MMT 细胞作为人类乳腺癌的模型。学生首先学习在培养条件下生长和鉴定这些细胞。需要特别强调的是，要成功完成本实验模块，研究人员（即学生）必须充分了解健康 MMT 细胞的形态和行为特征，尤其是因为未处理的 MMT 细胞将作为对照组。因此，若要获得准确的剂量反应和时间进程数据，必须对 MMT 细胞的生长模式、倍增时间以及总体形态进行充分 的表征分析。

在完成特征鉴定后，利用MMT细胞检测其对多种抗增殖药物的反应...

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披露

作者未从 Motic 获得任何财务或其他形式的支持.

致谢

本工作由 Joseph Alexander 基金会、ASBMB 本科生研究奖（2013-2014 年）以及玛丽芒特曼哈顿学院 2012-2013 年的 科学奖 资助项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
组织培养罩ESCO Labculture ReliantII级A2型生物安全柜
Waterjactor CO2 培养箱CEDCO型号 1510
亮线型血细胞计数板American Optical含两个独立网格
Motic Images PlusMac OSX 版本 2.0 或更高
Gilson 移液器Rainin instrument co. incP-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 培养显微镜Olympus带相机的4物镜倒置光学显微镜
200 μl 移液器吸头MidSci40200C
1,000 μl 移液器吸头MidSciAVR4
10 ml 血清移液管TPPTP94010
24孔板CoStar- 组织培养板352424孔，孔径16 mm，经辐射灭菌
台盼蓝溶液 0.4%SigmaT8154100 ml，经细胞培养测试，无危害
亮线型血细胞计数板替换盖玻片，无危害SigmaZ375357
小鼠乳腺肿瘤（MMT）细胞ATCCCCL-51
伊格尔最低必需培养基（EMEM）ATCC30-2003500 ml
胎牛血清SigmaF0926500 ml
盐酸二甲双胍SigmaPHR1084500 mg
他莫昔芬SigmaT5648白色或淡黄白色粉末
姜黄素SigmaC1386黄橙色粉末
阿司匹林SigmaA2093符合美国药典（USP）检测标准

参考文献

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