用于实验性脊髓损伤中脊髓血流评估的超声造影成像

摘要

超声造影成像是一种可靠的 体内 一种用于量化实验性大鼠脊髓损伤模型中脊髓血流量的工具。本文包含该技术与胸段脊髓挫伤模型联合应用的完整操作方案。

摘要

脊髓血流量（SCBF）降低（即， 缺血在创伤性脊髓损伤（SCI）的病理生理过程中起着关键作用，因此是神经保护治疗的重要靶点。尽管已有多种技术用于评估脊髓血流（SCBF），但均存在显著局限性。为克服这些局限，我们提出采用实时对比增强超声成像（CEU）技术。本文描述了该技术在大鼠挫伤型SCI模型中的应用。首先植入颈静脉导管，以便重复注射对比剂——六氟化硫微泡的氯化钠溶液。随后使用定制的三维支架固定脊柱，并通过ThIX-ThXII节段的椎板切除术暴露脊髓硬脊膜。将超声探头置于硬脊膜后方（涂有超声耦合剂）。为评估基础状态下的SCBF，经静脉单次注射对比剂（400 µl），记录其通过完整脊髓微血管的过程。随后使用重物坠落装置建立可重复的实验性挫伤型SCI模型。损伤后15分钟再次注射对比剂，以评估SCI后的SCBF变化。CEU可实现对脊髓血流的实时、 体内 评估SCI后SCBF的变化。在未受伤的动物中，超声成像显示完整的脊髓沿其长度存在不均匀的血流。此外，在SCI后15分钟，损伤中心水平出现严重的缺血，而较远端完整区域的SCBF仍得以保留。在损伤中心相邻区域（包括头侧和尾侧），SCBF显著降低，这对应于先前所描述的“缺血半暗带区”。该工具对于评估旨在减轻SCI后缺血及其所致组织坏死的治疗手段具有重要意义。

引言

创伤性脊髓损伤（SCI）是一种导致运动、感觉和自主功能严重受损的毁灭性疾病。迄今为止，尚无任何疗法在患者中显示出确切疗效。因此，寻找新技术以改善潜在治疗方法的评估，并进一步阐明损伤的病理生理机制显得尤为重要¹。

脊髓损伤（SCI）分为两个连续的阶段，即原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤对应于最初的机械性损害；而继发性损伤则包括一系列相继发生的生物学事件（如炎症、氧化应激和缺氧），这些事件进一步导致初始病灶的进行性扩展、组织损伤以及神经功能缺损^2,3。

在脊髓损伤（SCI）的急性期，神经保护治疗旨在减轻继发性损伤病理过程，从而改善神经功能预后。在众多继发性损伤事件中，缺血起着关键作用^4,5。在SCI损伤中心区域，受损的实质微血管阻碍了有效的脊髓血流（SCBF）。此外，在损伤中心周围区域，脊髓血流也显著降低，该区域特称为“缺血半暗带”。如果这些区域内的脊髓血流不能迅速恢复，缺血可导致进一步的实质坏死和神经组织损伤。由于即使是最轻微的组织保存也可能对功能产生显著影响，因此研发能够减轻SCI后缺血的药物和治疗方法具有重要意义。为突出这一现象，既往研究显示，SCI后仅保留10%的有髓轴突就足以使猫恢复行走能力⁶。

尽管已有多种技术被用于评估脊髓血流（SCBF），但这些方法均存在显著局限性。例如，放射性微球法的使用^7,8 以及C14-碘吡啉放射自显影⁹ 需要后续牺牲动物，且无法在后续时间点重复进行。氢清除技术¹⁰ 依赖于脊髓内电极的植入，这可能会进一步损伤脊髓。而激光多普勒成像、光电容积描记法^14,15 和 体内 光学显微镜¹⁶ 测量的深度/范围非常有限^11-13.

我们的研究团队先前已证实，对比增强超声（CEU）成像可用于实时评估 体内 大鼠脊髓实质中的脊髓血流变化¹⁷需要注意的是，Huang 也采用过类似的技术。 等 在一种猪的脊髓损伤模型中¹⁸CEU 采用一种特定的超声成像模式，可将通过常规 B 模式获取的灰阶形态学图像与血流的空间分布相关联。 ¹⁹. SCBF 成像与定量依赖于血管内注射超声造影剂。该造影剂由六氟化硫微泡组成（平均直径约 2.5 μm，90% 的微泡直径小于 6 μm），由磷脂稳定。微泡可反射探头发射的超声束，从而增强血液回声信号，根据组织血流情况提高组织对比度。因此，可根据反射信号的强度评估特定感兴趣区域的血流情况。这些微泡安全性良好，已在临床中应用于人体。六氟化硫可迅速清除（平均终末半衰期为 12 min），注射后 2 min 内超过 80% 的给药量可通过呼出气体排出。本方案提供了一种利用 CEU 成像评估大鼠 SCBF 变化的简便方法。

方案

注意：本论文中描述的方法已获得法国巴黎拉里布瓦西耶医学院生物伦理委员会（CEEALV/2011–08-01）的批准。

1. 仪器准备

1. 准备并清洁用于导管插入的以下器械：显微镊子、显微剪刀、微血管夹、大剪刀、手术缝线（黑色编织丝线 4-0）和 14 G 导管。使用肝素溶液（5,000 U/ml）对导管进行肝素化处理。
2. 准备并清洁用于椎板切除术的以下器械：大剪刀、手术刀和骨剪。使用定制的骨剪进行椎板切除术，该骨剪设计用于降低椎板切除过程中损伤脊髓的风险（图 1）。
3. 安装用于动物体位固定和稳定的三维框架。该定制框架由外固定器 Hoffmann 3 的组件结合显微镊子构成，镊子经过弯曲处理以适配动物腰椎的解剖结构。
4. 准备用于脊髓生物力学损伤的重物坠落装置（撞击器）。
   注：该定制撞击装置采用 3D 软件设计，并通过 3D 打印制成。
5. 打开超声设备。
6. 准备造影剂的复溶试剂盒。
   注：试剂盒包含 1 个含有 25 mg 冻干粉末的小瓶、1 支预充有 5 ml 氯化钠溶液的注射器以及 1 个迷你穿刺转移系统（图 2）。造影剂的复溶步骤详见下文第 5 节。

2. 颈静脉插管（图3）

1. 使用 4% 异氟烷 对动物进行麻醉。将动物置于仰卧位。通过用镊子夹捏动物足部并确认其无反应，以验证麻醉效果充分。在麻醉期间，于动物眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
2. 剃除颈部毛发并清洁皮肤。沿颈部正中线做一皮肤切口。牵开胸锁乳突肌以暴露颈内静脉。在静脉的头端部分结扎一道缝线。
3. 在结扎线下方约 1 cm 处的静脉上夹闭微型血管夹。在血管夹下方再绕静脉穿一根缝线，打结并留置，待松开血管夹时即可收紧该结。
4. 在血管夹与头端结扎线之间的静脉壁上切开（静脉切开术）。将一根 14 G 导管插入静脉管腔，并向心脏方向推进。
5. 当导管遇到血管夹阻力时，松开血管夹并继续推进导管。将导管保留在静脉内，并通过在导管外收紧预留的缝线结将其牢固固定。
6. 通过从导管回抽少量静脉血，随后用肝素化生理盐水冲洗，以评估导管通畅性。此操作可防止潜在的血凝块阻塞导管。
7. 将柔性导管连接至导管，以便后续注射造影剂（微泡）。在使用前保持其关闭（密封）状态。

3. 暴露脊柱、椎板切除及大鼠在三维固定架中的定位

1. 将动物置于平坦的俯卧水平位置。剃除并清洁动物背部（胸段区域）的毛发。
2. 通过触诊确定最后一根肋骨（大鼠为第XIII根肋骨）（图4），由此可估算第XIII胸椎（ThXIII）的位置。
3. 在正中线上做一长度为4 cm的皮肤切口，中心对准ThXIII。切开皮肤及下方的滑囊。观察背部肌肉的腱膜以及椎体棘突的尖端。
4. 通过触诊第XIII根肋骨，仔细定位ThXIII的棘突。
   注意：第XIII根肋骨与ThXIII相连，因此是识别ThXIII的易于定位的解剖标志。此步骤有助于定位ThXII至ThIX的棘突以及L1和L2（第一和第二腰椎）。
5. 切开肌肉腱膜，并向两侧剥离肌肉，暴露从ThIX到L2的棘突、椎板和关节突关节。通过从横突上剥离肌肉，暴露L1和L2的外侧部分。
6. 将动物的门齿钩挂在三维固定架上以固定其位置（图5）。用改良镊子夹住L1和L2椎体，并将改良镊子连接至三维固定架，以稳定动物体位。
7. 轻柔地向尾侧牵拉夹持腰椎的镊子，以拉紧整个脊柱，并使胸段略微抬离操作台面。
   注意：在上述固定装置下，动物应能正常呼吸。此外，尽管胸廓存在呼吸运动，脊柱和脊髓仍应保持稳定不动。
8. 切除ThIX至ThXII的棘突。将骨剪的下叶轻轻插入ThXII左侧椎板下方，然后闭合骨剪以切断椎板（图6）。
9. 对右侧椎板重复相同操作，并依次切除后部椎弓。对ThXI至ThIX各椎体重复前述步骤，完成四节段椎板切除术。切除每个椎体的双侧关节突关节。
   注意：在整个手术过程中，应及时清除术区局部出血。可使用棉签 并以温盐水冲洗。通常数分钟内即可实现止血。

4. CEU 探头定位

1. 在硬脑膜上覆盖超声耦合剂，以有效传递超声探头与脊髓之间的超声波（图7）。
2. 使用可连接至三维支架的关节臂将超声探头固定于夹具上，并手动调整探头位置。确保探头方向正确，以获得斜矢状位的纵向切面。当位置正确时，图像中脊髓呈严格水平走向，且脊髓中央管在整个脊髓节段中均清晰可见。
   注意：探头定位应依据超声设备屏幕上实时显示的B型图像进行引导。超声探头的焦距应与脊髓中央管对齐。此时，脊髓后部区域可被充分暴露，从而为后续撞击器的定位提供条件。
3. 当达到最佳位置后，锁定关节臂以固定探头位置。

5. 对比剂的制备——微泡重构

1. 使用商用复溶试剂盒中的组分，将推杆顺时针方向紧密旋入注射器中完成连接。打开转移系统包装袋，取下注射器针帽。打开转移系统盖子，将注射器连接至转移系统（旋紧）。
2. 取下小瓶上的保护垫片。将小瓶滑入
3. 转移系统的透明套管中，并用力按压以固定小瓶。
4. 推动推杆，将注射器中的全部内容物注入小瓶中。剧烈振摇20秒 ，使小瓶内所有成分充分混合，得到白色乳状均匀液体。
5. 将整个系统倒置，小心地将造影剂抽回注射器中。将注射器从转移系统上拧下。按说明完成复溶后，所得混悬液每1 ml含有8 µl微泡中的六氟化硫。将微泡混悬液吸入一支100 ml注射器中。将该100 ml注射器装入电动泵中，合上盖子。
6. 开始对复溶后的微泡进行持续振荡。通过注射器缓慢旋转实现持续振荡，以维持微泡悬液状态。通过软管将泵与颈静脉导管连接。将超声设备设置为“谐波模式”。
   注：此模式专用于特异性检测和显示微泡，其机械指数较低，不会破坏微泡，而B模式则会破坏微泡。
7. 通过注入第一剂造影剂（400 µl）来冲洗导管。在首次注射过程中，确认超声屏幕上可见微泡信号。这表明整个通路（从注射器到大鼠血液）通畅无阻。
8. 将超声设备切换至“B模式”，以观察脊髓实质及清除血液中残留的少量微泡。B模式发射高频超声波，能量较高，可使微泡破裂。
9. 让动物静置约30分钟。此阶段有助于血流动力学参数的稳定。

6. 完整脊髓中脊髓血流量的评估

1. 将超声设备设置为“谐波模式”。同时开始（1）注入造影剂（400 µl）和（2）计时器。
   注意：在注射过程中，血液中微泡的浓度应逐渐升高，从而实现对脊髓的增强成像（图8）。由于微泡会迅速被破坏，注射结束后血液中的微泡浓度即开始下降，导致脊髓增强显像逐渐减弱。
2. 1分钟后，选择（按下）超声设备上的“Clip Store”按钮。此操作可保存1分钟的原始超声数据以及成像视频记录（即此前在超声屏幕上显示的内容）。
3. 将超声设备设置为“B模式”，以清除残留的微泡。

7. 实验性SCI

1. 使用连接至三维框架的显微操作器，将重物下落撞击装置定位，使撞击头接触脊髓正中线处的硬脑膜，位置位于胸椎第十节（ThX）与第十一节（ThXI）交界处（图9）。
   注意：该位置应与超声设备观察到的脊髓节段中点相对应。撞击装置的撞杆和主体直径为 8 mm，用于造成损伤的撞击头尖端直径为 3 mm。
2. 将撞击装置的撞杆置于距撞击点 10 cm 高的位置。通过释放撞杆来诱导实验性脊髓损伤（SCI）。撞杆下落并释放撞击头，从而对脊髓造成损伤。该定制撞击装置所产生的冲击力相当于一个 10 g 的重物从 10 cm 高度自由下落所产生的冲击。

8. 脊髓损伤后5分钟脊髓血流量的评估

1. 重复第6节（SCBF评估）中描述的步骤。微泡将无法通过受损的微血管，损伤中心将保持黑暗状态（图10）。

9. 动物安乐死

1. 通过腹腔注射戊巴比妥（100 mg）实施安乐死。

10. 通过离线分析定量测量皮层脑血流

1. 启动用于定量的 Ultra-Extend 软件（在超声设备上）。选择“文件”，然后选择先前保存的原始数据并打开相关文件。通过按（选择）“Chi Q”按钮激活“定量模式”。选择“设置 ROI”（按钮），并选择圆形形状。
2. 选择“绘制 ROI”（按钮），在脊髓上绘制七个相邻的圆形感兴趣区域（ROI）（图 11）。打开“拟合”菜单，并选择“曲线值”函数。观察软件显示的多条曲线，每条曲线对应一个 ROI 内微泡浓度的变化。
   注意：每条曲线均呈现“灌注-去灌注”特征。曲线的第一阶段呈平坦状，对应微泡到达前的时期；第二阶段中，由于输注，微泡浓度迅速上升；第三阶段始于输注结束后，微泡在血液中逐渐崩解，浓度随之逐步下降。
3. 将第一条垂直线置于曲线第二阶段的起始处，并选择“设定”，以告知软件分析的起始位置。
4. 将第二条垂直线置于记录的结束位置，再次选择“设定”，以告知软件分析的终止位置。
5. 查看“Cv”菜单，并记录“AUC”值，该值对应所分析的“曲线下面积”。该数值与相应 ROI 内的脊髓血流量（SCBF）成正比。

结果

通过上述方案，可沿脊髓矢状面长轴段绘制脊髓血流灌注图。

在完整的脊髓中，实质内似乎存在脊髓血流（SCBF）的不规则分布（图12）。这可归因于不同动物之间根髓动脉（RMA）分布的变异性。RMA是指到达脊前动脉（ASA）的节段性动脉，因此为脊髓实质提供血液供应。相比之下，根动脉则是指未能到达ASA的节段性动脉，因此不参与脊髓的血液供应。因此，在RMA与ASA吻合的脊髓节段，血流量更大（如我们的结果所示）。

脊髓损伤（SCI）后，实时CEU成像显示损伤中心区域血流循环存在缺陷。损伤中心区域呈暗色（无对比剂信号），表明无主动血流。通过多个感兴趣区域（ROI）对血流进行更详细的分析，可识别出三种独特的血流区域。首先，在损伤中心层面，血流最低，平均下降约-90%。其次，在中心区域相邻的区域（包括头侧和尾侧），脊髓血流（SCBF）也显著降低（下降范围为-50%至-80%）。第三，在对应于未受损组织的最远端区域，SCBF得以保留。第二个区域对应于“缺血半暗带区”，应是潜在神经保护治疗的目标区域。能够便捷地可视...

讨论

尽管我们已描述了如何在大鼠脊髓损伤（SCI）挫伤模型中使用CEU，但该方案可根据其他实验目的或SCI模型进行调整。我们仅选择在两个时间点（损伤前和SCI后15分钟）测量脊髓血流（SCBF），但时间点的数量以及SCBF测量之间的间隔可根据其他研究的需求进行调整。例如，在我们之前的研究¹⁷中，我们在SCI后第一个小时内连续测量了五个时间点的SCBF。值得注意的是，在假手术组（无SCI）中，我们意外观察到SCBF呈进行性下降。虽然我们最初担心重复注入微泡可能损害脊髓血管系统，但进一步的实验（未发表数据）证实，这些变化是由椎板切除术引起的局部组织生理条件（温度、水合状态）的进行性改变，以及硬脊膜和周围组织长时间暴露于空气和超声耦合剂所致。这些问题在所有涉及微循环的研究中均较为常见，因为微循环对多种参数极为敏感，容易发生血管收缩或血管舒张。因此，我们建议尽量缩短手术切口开放的时间。如果需要在较长时间内进行多次SCBF测量，则最好在每次测量之间关闭动物的手术切口，以恢复脊髓周围及内部的生理环境。

还可以修改用于脑血流（SCBF）分析的感兴趣区域（ROI）的形状、大小、位置...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
外固定架 Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		用于构建定制的三维框架及固定超声探头的关节臂的模块化系统
东芝 Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		超声成像设备
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		造影剂：微泡
Vueject 泵	Bracco, Milan, Italy		用于注射微泡团注的电动泵
Aquasonic 超声耦合剂	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		用于传导超声波的超声耦合凝胶
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		用于麻醉的异氟烷
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		用于量化脊髓血流的软件
Mastercraft 五件套迷你钳子套装，产品编号 #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		适用于自行操作的钳子套装