在大鼠脑组织用荧光活化细胞分选，以检查细胞类型特异性基因表达

Summary

该协议的目标是使用荧光激活细胞分选 （FACS） 技术对特定类型的神经细胞进行分类，以便随后分析细胞类型特异性基因表达、表观遗传标记和/或蛋白质表达。

Abstract

大脑是由四个主要类型的细胞，包括神经元，星形胶质细胞，小胶质细胞和少突胶质细胞。虽然它们不是在大脑中最丰富的细胞类型，神经元是最广泛研究因为它们在影响行为直接作用这些细胞类型。在大脑中的其它细胞类型也影响通过它们产生的信号分子的神经元功能和行为。神经科学家必须了解的细胞类型之间的相互作用在大脑更好地了解这些相互作​​用如何影响神经功能和疾病。迄今为止，分析蛋白质或基因表达的最常见方法是利用整个组织样品均质化，通常是用血，而不考虑的细胞类型。这种方法是用于检查基因或可能影响神经功能和行为表达一般的变化信息的方式;然而，这种分析方法不适合于电池的更深入的了解-type特异性基因表达和细胞 - 细胞通信的对神经功能的影响。行为表观遗传学分析已经日益焦点其中审查的区域如何的脱氧核糖核酸（DNA）的结构影响长期基因表达和行为的修改;然而，该信息可以仅是相关的，如果在给定的鉴别谱系，从而后生标记可存在于个体的神经细胞类型的某些基因的细胞类型特异性的方式进行分析。荧光激活细胞分选如下所述（FACS）技术提供了一种简单而有效的方法，以分离单个神经细胞的基因表达，蛋白质表达，或DNA的表观遗传修饰的随后的分析。这种技术也可以被修改，以在脑中为随后的细胞类型特异性分析隔离更具体的神经细胞类型。

Introduction

下面描述的方案的目的是从异质的神经组织群体中分离出单个细胞类型，用于随后分析细胞类型特异性基因表达、蛋白质表达甚至表观遗传标志物。大脑由许多细胞类型组成，这些细胞类型来源于不同的祖细胞，并具有细胞类型特异性的特性和功能。尽管存在这些差异，但这些不同的神经细胞类型可以表达相似的受体和细胞内信号分子，这使得使用传统方法难以以细胞类型特异性方式测量或解释这些更普遍的蛋白质。神经科学家必须确定大脑中这些不同细胞类型的功能和激活，以及它们如何单独影响行为，因为这最终将是确定神经和神经精神疾病更具体药物和治疗靶点的第一步。尽管神经科学研究有这一总体目标，但从大脑中分离出单个神经细胞类型以分析基因或蛋白质表达、信号分子的激活或 DNA 表观遗传标记的修饰可能很困难。在目前使用的技术中，免疫组化可以与细胞类型特异性标记物的额外染色相结合，以细胞类型特异性方式鉴定蛋白质的表达，尽管这依赖于可以正确染色目标蛋白质的特异性抗体，并且可能难以量化。原位杂交可以识别信使核糖核酸 （mRNA） 在大脑中单个细胞中的特异性定位，但这是一个费力的过程，也限制了特定细胞类型的共分析，并且只允许分析一个或几个感兴趣的基因。激光捕获显微解剖使用激光分离通过显微镜观察的细胞亚群;然而，这个过程的耗时性和相对较低的产量会显着限制蛋白质或 mRNA 水平的后续分析，尤其是在这些分子的表达开始时就很低的情况下。荧光激活细胞分选 （FACS） 是神经科学领域中一种相对较新的技术，用于从大脑中分离单个细胞类型，以便随后分析基因表达¹ 和/或表观遗传靶^{标 2}。该过程还可用于对特定类型的神经细胞进行分选，以便随后分析细胞类型特异性基因表达、蛋白质表达或表观遗传标志物。几十年来，FACS 已被用于癌症和免疫学等许多医学研究领域，以根据物理或生化特征对不同的细胞进行计数和分类³。此外，流式细胞术通常用于使用特异性抗体分析每个细胞的蛋白质表达。下面描述的程序利用经典的流式细胞术技术来分离单个细胞类型，以便随后分析分子生物学终点。流式细胞仪可以在一秒钟内分析数千个细胞，这使其成为上述技术的快速有效替代方案。此外，可以根据特定蛋白质（例如神经递质受体）的细胞表达或两种或多种蛋白质的组合（特定细胞类型中多种蛋白质的共定位）来分离细胞。这允许用户根据其分子特性分离出非常有选择性的神经细胞类型，以确定它们在大脑中的功能。

为了进行 FACS，将神经细胞制备成单细胞悬液，该悬液通过携带和对齐细胞的流动池，以便它们通过光束和激光进行单列分析。计算机从每个细胞中获取数据并将其绘制在直方图上，以分析指定的参数（大小、粒度和荧光）。根据这些参数，细胞可以立即分选到单独的试管中，以便它们重新收集和随后分析所需的任何终点。下面描述的方案利用三种抗体对神经元（使用胸腺细胞抗原 1、Thy1 抗体）、星形胶质细胞（使用神经胶质谷氨酸转运蛋白、GLT1 抗体）和小胶质细胞（使用分化分子簇 11B、CD11b 抗体）进行分类。该方案可以如下所述使用，也可以根据想要分离用于自己实验的细胞类型使用不同的抗体进行修饰。

在确定此方案是否适用于特定实验时，需要考虑一些注意事项。一个主要的警告可能涉及要分离的特定细胞类型。在该方案中，使用的三种抗体是细胞外抗体，它允许实验者在染色过程中保持细胞类型完整，从而保持内部 RNA、DNA 和蛋白质的完整性。人们可能希望使用识别仅在该特定细胞内表达的蛋白质的抗体来分离特定的神经细胞类型。例如，您可能希望使用酪氨酸羟化酶抗体分离多巴胺能神经元，或使用胆碱乙酰转移酶抗体分离乙酰胆碱神经元。这些蛋白质在细胞内，因此需要固定和透化细胞膜，以便随后用适当的抗体进行染色。虽然这在 ^4,5 之前已经完成，但这个过程可能会显着降低这些透化细胞中 RNA 或 DNA 的产量。另一个需要注意的是，并非所有抗体都适用于 FACS。例如，目前可能使用一种对 western blot 非常有效的抗体，这是一种需要蛋白质变性的技术。该抗体可能不一定适合使用 FACS 鉴定这些细胞类型，因为蛋白质在该方案中的任何时候都没有变性，因此抗体可能无法与其固有抗原结合。公司提供规格表，用于确定抗体已获批准的应用。如果抗体尚未被批准用于流式细胞术，则不应阻止人们使用特定抗体尝试此方案;但是，应该知道，它不能保证对FACS有效。该协议的第三个警告与试图分离的细胞数量有关。FACS 是一种出色的技术，甚至可以从一小块组织中产生尽可能多的细胞，但也有可能，如果想从相对较小的大脑区域分离出相对稀疏的细胞群，一只动物的产量本质上会很低。在这种情况下，可能需要汇集来自同一治疗组中的几只动物的脑组织，以产生后续分析所需的细胞数量;然而，最近的一篇出版物使用基因靶向预扩增 cDNA 来随后分析来自较大分类神经元的少量活化神经元 （5-6%） 的基因表达，这表明可以分析来自神经细胞的小亚群的基因表达，而无需汇集大量动物⁶这项技术的最后一个警告是，应该可以使用不太远的细胞分选仪。细胞分选仪是一台复杂的机器，需要大量培训才能正确使用。因此，这些机器通常由核心设施的合格技术人员作。此外，该程序的目标是解离神经组织，对其进行特异性抗体染色，并立即在短时间内（可能是半天）将这些样品带到分选仪。这个时间范围将有助于提高分离细胞的存活率和产量，并保持细胞的完整性以进行后续处理和分析。如果满足上述所有这些参数，FACS 是分析神经组织中基因和蛋白质的细胞类型特异性表达的极好方法。

所有实验均按照特拉华大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 和美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。

Protocol

1. 组织采集的准备工作 （15 – 30 分钟）

1. 将三组玻璃巴斯德移液器按直径递减的方式进行火抛光，并编号为"1" = 约 1 mm 直径，"2" = 约 0.75 mm 直径，"3" = 约 0.50 mm 直径。
2. 根据神经解离试剂盒提供的方案，用所有缓冲液 A 重悬冻干的酶 A（参见材料表）。不要涡旋。将溶液分装成 50 μl 等分试样，并储存在 -20 ºC 以备后用。
3. 制作 1 L 髓鞘去除缓冲液和真空过滤器进行灭菌 [髓鞘去除缓冲液 = 1,000 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、2 ml 500 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 和 10 g 牛血清白蛋白 （BSA）]。
4. 将尼龙网片切成 1 x 1 英寸（2.5 x 2.5 厘米）的小方块，用于过滤细胞碎片，并在覆盖有铝箔的小烧杯中高压灭菌。
5. 准备 1 L 洗涤缓冲液 [洗涤缓冲液 = 1,000 ml 0.1 M PBS、2 ml 500 mM EDTA 和 10 g BSA]。

2. 组织采集

1. 将水浴打开 37 ºC。
2. 通过将 β-巯基乙醇添加到缓冲液 X 中至终浓度为 0.067 mM，从神经解离试剂盒中制备缓冲液 X（对于 4 个样品，将 13.5 μl 50 mM β-巯基乙醇添加到 10 ml 缓冲液 X 中）。
3. 按照神经解离试剂盒方案中的说明，为每个样品混合 50 μl 酶 P 与 1,900 μl 缓冲液 X 来制备酶混合物 1例如，对于 4 个样品，将 200 μl 酶 P 与 7,600 μl 缓冲液 X 混合。
4. 将缓冲液 X 置于 37 ºC 的水浴中。
5. 将 2 ml 冷的 Hank's 缓冲盐溶液 （HBSS）（不含 Ca⁺⁺ 和 Mg⁺⁺）放入无菌 6 孔培养板的一个孔中，用于收集每个样品，并保持在冰上进行组织解剖。

3. 组织解剖 （45 分钟 – 1 小时）

1. 根据机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 指南，向动物注射适量的安乐死溶液（商业巴比妥酸盐溶液，例如 Euthasol），并用 0.9% 冷盐水溶液灌注所有血液。
   1. 用过量的安乐死溶液给大鼠给药。
   2. 通过呼吸和脚趾捏监测麻醉。当动物被充分麻醉时（对脚趾捏和深而缓慢的呼吸没有反应），可以给大鼠灌注。
   3. 要灌注大鼠，请用一把重型剪刀切开胸腔。切开隔膜以允许进入心脏。沿两侧切开肋骨，直至胸部顶部，以便完全进入心脏。此时，可以使用一对止血钳将肋骨固定在一侧。
   4. 通过将连接到电动泵的 18 G 针头（用于成年大鼠）插入心脏左心室进行心脏灌注。泵正在吸入 0.9% 的冷盐水溶液。
   5. 然后用一把小剪刀剪开右心房，让血液和液体灌注液从体内排出。
   6. 用大约 10 ml （对于成年大鼠） 0.9% 盐水灌注大鼠，以去除所有外周免疫细胞和因子。
2. 使用无菌剃须刀片和适当的解剖解剖大脑区域的所需部分，然后将组织块放入不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的冷 HBSS 中><。 注：该方案要求在方案的早期步骤中使用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS，因为这些离子可能会干扰神经解离所需的酶。
3. 收集完所有组织样品后，返回超净工作台或无菌培养罩进行组织处理。

4. 神经解离 （1 小时）

1. 使用 6 孔培养板盖子上的无菌剃须刀片将每个组织样品切成小块。该方案已用于约 30 - 100 mg 的组织样品，但已获准用于高达 400 mg 的组织样品。对于大于 400 mg 的组织样品，必须适当放大试剂体积。
2. 使用 1 ml 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的新鲜 HBSS，用移液管将切碎的组织块转移到无菌的 2 ml 离心管中。对所有样品重复步骤 4.1 和 4.2，直到所有样品都转移到 2 ml 离心管中。
在
3. RT 下以 300 x g 离心样品 2 分钟并吸出上清液。
4. 向每个样品中加入 1,900 μl 温热的酶混合物 1，如步骤 2.2 和 2.3 中制备的，并关闭试管。
5. 将样品在 37 ºC 水浴中孵育 15 分钟，每 5 分钟倒置试管数次，以重新悬浮沉淀的组织块。
6. 同时，通过将 20 μl 缓冲液 Y 与 10 μl 解冻的酶 A 混合来制备酶混合物 2（对于 4 个样品，将 80 μl 缓冲液 Y 与 40 μl 解冻的酶 A 混合）。
7. 向每个样品中加入 30 μl 酶混合物 2 并轻轻倒置。不要涡旋。
8. 用巴斯德移液管"1"解离每个组织样品，上下研磨 30 次。
9. 将样品在 37 ºC 水浴中孵育 15 分钟;每 5 分钟将试管倒置数次，以重新悬浮沉淀的组织块。
10. 用巴斯德移液器"2"解离每个组织样品，上下研磨 30 次。避免产生气泡。
11. 用巴斯德移液管"3"解离每个组织样品，上下研磨 30 次。避免产生气泡。
12. 将样品在 37 ºC 水浴中孵育 10 分钟;每 5 分钟倒置试管数次，以重新悬浮沉淀的细胞。
13. 将单细胞悬液涂在放置在 15 ml falcon 管顶部的 80 微米细胞菌株中，以去除任何大块碎片，并用 10 ml HBSS（含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）洗涤过滤器和细胞以停止酶反应。重复直到每个样品转移到干净的 15 ml Falcon 管中。
14. 在 RT 下以 300 x g 离心样品 10 分钟，然后吸出上清液。

5. 髓鞘耗竭（45 分钟）

1. 用 400 μl 髓鞘去除缓冲液彻底重悬细胞沉淀。
2. 加入指定量的髓鞘去除珠，并上下移液以充分混合。
   注意：使用的髓鞘去除珠的体积将取决于组织的大小、动物的年龄以及该特定大脑区域预期的髓鞘量。例如，对于成年大鼠海马体样品（约 300 mg），将样品与 100 μl 髓鞘去除珠一起孵育。
3. 在 4 ºC 的冰箱中孵育 15 分钟。
4. 用 5 ml 髓鞘去除缓冲液洗涤每个样品。
在
5. RT 下以 300 x g 离心样品 10 分钟。
6. 离心样品时，将每个样品的 1 根色谱柱置于磁选仪的磁场中，并在每根色谱柱的顶部放置一个干净的 80 微米过滤器。
7. 准备色谱柱并通过用 1 ml 髓鞘去除缓冲液冲洗每根柱子 3 次（总共 3 ml）来过滤。将所有流出物收集在废液容器中，例如空吸头盒的底部。
8. 将 5 ml 聚苯乙烯圆底管放在每根柱子的正下方，以准备样品收集。
9. 当细胞完成离心后，吸出上清液并彻底重悬于 500 μl 髓鞘去除缓冲液中。立即将细胞悬液涂在色谱柱上，并将细胞收集在下面的试管中。
10. 用 1 ml 髓鞘去除缓冲液洗涤过滤器和色谱柱，洗涤 4 次（总共 4 ml）。
11. 在 RT 下以 300 x g 离心细胞收集物 10 分钟。
12. 吸出上清液，细胞现在可以进行染色了。

6. 活细胞 FACS 染色（染色 1 小时）

1. 短暂涡旋（2 秒）细胞以分离沉淀，并立即加入 5 μl Fc 阻滞剂（抗分化簇 32、CD32），再次涡旋，并在 4 ºC 的冰箱中孵育 5 分钟。
2. 同时，通过在洗涤缓冲液中加入三种一抗来制备一抗混合物，如下所示：0.125 μl 别藻蓝蛋白 （APC） 偶联的 CD11b 抗体 （1：800），1 μl 抗 GLT1 抗体 （1：100） 和 0.4 μl 异硫氰酸荧光素 （FITC） – 偶联的 Thy1 抗体 （1：250） 每 100 μl 洗涤缓冲液。每个样品将接受 100 μl 一抗混合物进行孵育;但是，如果您的样品远大于 400 mg 组织，您可能需要考虑相应地增加一抗混合物的体积
3. 从每个样品管中取出 2 μl 细胞并将其添加到每个单染色对照管中，制备用于单次染色对照的试管。"单染色"对照包括：仅 APC-CD11b、仅 GLT1、仅 FITC-Thy1、仅 PE 二抗以及"空白"或未染色对照。
   注：所有样品都应在所有染色对照中表示，因此应将来自每个样品的 2 μl 细胞添加到每个染色对照管中。
4. 短暂涡旋试管（2 秒），向每个样品管中加入 100 μl 一抗混合物，向每个染色对照管中加入 100 μl 适当的一抗，再次涡旋试管，用铝箔覆盖试管以保护荧光抗体免受任何光线照射，并将试管在 4 ºC 的冰箱中孵育 20 分钟。在手术的剩余时间内，样品应保持凉爽（4 ºC），以保持样品和抗体的完整性。
5. 短暂涡旋试管并向每个试管中加入 2 ml 洗涤缓冲液。
6. 在 4 ºC 下以 350 x g 离心管 5 分钟。
7. 同时，通过向每 100 μl 洗涤缓冲液中加入 0.2 μl PE 偶联的抗兔二抗来制备二抗混合物。每个样品将获得 100 μl 二抗混合物;但是，如果您的样品远大于 400 mg 组织，则可能需要考虑相应地增加一抗混合物的体积。
8. 离心完成后，将每个样品的上清液倒入水槽中，然后用纸巾将试管倒置吸干。
9. 短暂涡旋试管，向每个样品管中加入 100 μl 二抗混合物，向每个染色对照中加入适当的二抗，再次涡旋试管，用铝箔盖住试管，并将试管在 4 ºC 的冰箱中孵育 15 分钟
   注：仅 GLT1 染色对照管应获得二抗混合物。
10. 孵育后，短暂涡旋试管并向每个试管中加入 2 ml 洗涤缓冲液。
将
11. 试管在 4 ºC 下以 350 x g 离心 5 分钟。
12. 离心完成后，将每个样品的上清液倒入水槽中，然后用纸巾将试管倒置吸干。
13. 涡旋试管并向每个试管中加入 0.25 ml 无菌 PBS。样本已准备好进行排序。
    注：更多细胞可能需要 0.5 ml 无菌 PBS;但是，最好从较小的体积开始，因为如果样品与细胞浓度过高，则始终可以稀释><样品。 注：可选择将 DNase 添加到试管中，以防止细胞结块，从而堵塞分选仪。也可以在分选前使用无菌 80 微米过滤器过滤样品，以避免堵塞分选仪。
14. 将细胞放在冰上送到分选仪中。将细胞群收集在 2 ml 无核酸酶离心管中，每管中含有 0.5 ml 无菌 PBS。
15. 分选后，在 4 ºC 下以 300 x g 的速度旋转细胞 2 分钟。吸出大部分 PBS，并在 -80 ºC 冰箱中快速冷冻细胞，直到进一步处理以进行 RNA 提取（更多方案详情见 1）、DNA 提取（更多方案详情见 2）或用于蛋白质分析的细胞裂解。

Results

髓鞘耗竭和组织灌注的重要性

图 1 描述了髓鞘耗竭的重要性。当单细胞悬液在髓鞘去除珠中孵育、洗涤并随后通过磁选仪上的色谱柱时，会发生髓鞘耗竭（上述方案的步骤 5.1 至 5.12）。这些步骤的目的是减少每个样品中存在的细胞碎片的数量。当神经元解离和研磨时，它可以剪掉通常有髓鞘化的突起，因此可能会用 Thy1 抗体染色呈阳性。这会导致有髓碎片，最终会干扰抗体染色和细胞分选。此外，它还可以减少从每个样品中检索的细胞的相对数量。在图 1 中，图中每个面板中绘制的多边形描绘了活细胞，这些细胞将被门控和分析以进行后续排序。活细胞的这个门是根据前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 绘制的，前向散射 （FSC） 是粒度的量度，光通过该粒子，最终排除死细胞和/或细胞碎片。因此，活细胞应具有低粒度（低 SSC）和合理（不太小或不太大）的大小 （FSC）。样品 1（图 1A）和样品 2（图 1B）代表两种不同的海马样品，它们是使用上述方案的所有步骤单独制备的。...

Discussion

与许多其他组织和系统类似，大脑由异质细胞群组成，这些细胞群共同发挥作用以影响行为。对异质群体中单个细胞的基因表达、蛋白质表达或表观遗传修饰的分析有可能揭示有关整个系统功能的信息，识别调节正常行为和疾病过程的细胞过程，并为潜在的治疗提供细胞类型特异性靶点。未来，改变大脑内单一细胞类型的功能可能会解锁以更特异性的方式成功治疗神经退行性或神经精神疾病的钥匙，减少因影响多种细胞类型而引起的非特异性副作用。因此，未来神经科学研究的一个关键焦点必须寻求了解大脑中不同细胞类型的相互作用以及它们如何影响行为和疾病状态。此处描述的FACS技术的目标是快速分离单个细胞群以进行后续分析。还可以根据感兴趣的研究对其进行修改以分析更具体的细胞类型。

该协议中有几个关键步骤将有助于提高使用该技术分离的神经细胞的成功产量。首先，应该提到的是，上述方案已针对从新鲜大鼠脑组织中分离单个细胞类型进行了优化。其中许多程序可能可用于从先前冷冻或固定的组织中处理和分离单个细胞类型，但必须优化这些程序的细节。我们发现，用冷生理盐水灌注神经组织中的血液将有助于减少神经细胞死亡，提高分离细胞的特异性，从而提高分选神经细胞的产量。...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
神经解离试剂盒 （P）	Miltenyi Biotec	130-092-628
髓鞘去除珠 II	Miltenyi Biotec	130-096-733
LS 色谱柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
尼龙网片	Amazon	CMN-0074-10YD	40 英寸宽，80 微米尺寸网眼
Fc 块/抗 CD32	BD Biosciences		对大鼠
APC 偶联的 CD11b 抗体	Biolegend	201809对	大鼠
兔抗 GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	对大鼠或人
PE 偶联的抗兔的反应性二抗	eBioscience	1037259	用于抗 GLT1
FITC 偶联的抗大鼠 CD90 （Thy1） 小鼠抗体	Biolegend	202504	对大鼠的反应