本实验方案的目的是利用荧光激活细胞分选（FACS）技术分选出特定类型的神经细胞，以便后续分析细胞类型特异性的基因表达、表观遗传标记和/或蛋白质表达。
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摘要
摘要
大脑主要由四种细胞类型组成，包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞。尽管神经元并非大脑中最丰富的细胞类型，但由于其在影响行为方面具有直接作用，因此是这些细胞类型中被研究得最为广泛的一类。大脑中的其他细胞类型也通过其产生的信号分子影响神经元功能和行为。神经科学家必须理解大脑中不同细胞类型之间的相互作用，以更深入地认识这些相互作用如何影响神经功能和疾病。迄今为止，分析蛋白质或基因表达最常用的方法是将整个组织样本（通常包含血液）进行均质化处理，且不考虑细胞类型的差异。这种方法有助于研究可能影响神经功能和行为的基因或蛋白质表达的总体变化；然而，该分析方法难以深入揭示特定细胞类型的基因表达特征以及细胞间通讯对神经功能的影响。行为表观遗传学是近年来日益受到关注的研究领域，旨在探讨脱氧核糖核酸（DNA）结构的修饰如何影响长期的基因表达和行为；然而，由于不同谱系的神经细胞类型在特定基因上可能具有不同的表观遗传标记，因此只有在按细胞类型特异性方式进行分析时，这些信息才具有实际意义。下文所述的荧光激活细胞分选（FACS）技术提供了一种简单而有效的方法，用于分离单个神经细胞，以便后续分析其基因表达、蛋白质表达或DNA的表观遗传修饰。该技术还可进一步优化，用于分离大脑中更特定的神经细胞类型，从而实现细胞类型特异性的分析。
引言
以下方案的目的是从异质性的神经组织群体中分离出特定的细胞类型，以便后续分析细胞类型特异性的基因表达、蛋白质表达，甚至表观遗传标记。大脑由多种细胞类型组成，这些细胞来源于不同的前体细胞，并具有细胞类型特异性的特性与功能。尽管存在这些差异，不同类型的神经细胞可能表达相似的受体和细胞内信号分子，这使得利用传统方法以细胞类型特异性的方式检测或解释这些广泛存在的蛋白质变得困难。神经科学家必须明确大脑中这些不同细胞类型的机能与激活状态，以及它们如何各自影响行为，因为这最终将是发现更特异的药物和神经系统疾病及神经精神疾病治疗靶点的第一步。尽管这是神经科学研究的总体目标，但从大脑中分离出特定的神经细胞类型仍存在困难，从而限制了对基因或蛋白质表达、信号分子激活状态，或DNA上表观遗传标记修饰的分析。目前常用的技术中，免疫组织化学可结合细胞类型特异性标记物的额外染色，以细胞类型特异性方式检测蛋白质的表达，但该方法依赖于能够有效染色目标蛋白质的特异性抗体，且定量分析较为困难。原位杂交技术可用于确定脑内单个细胞中信使核糖核酸（mRNA）的精确定位，但该过程耗时较长，且难以实现多种特定细胞类型的共分析，通常仅能分析一个或少数几个目标基因。激光捕获显微切割技术利用激光分离在显微镜下可视的细胞亚群，但该过程耗时且产量相对较低，若目标分子本底表达水平较低，则会显著限制后续对蛋白质或mRNA水平的分析。荧光激活细胞分选（FACS）是神经科学领域中一种相对较新的技术，可用于从脑组织中分离特定细胞类型，以进行后续的基因表达1和/或表观遗传靶点2分析。该技术还可用于分选特定类型的神经细胞，以进一步分析其细胞类型特异性的基因表达、蛋白质表达或表观遗传标记。FACS已在癌症和免疫学等多个医学研究领域应用数十年，用于根据细胞的物理或生化特性进行细胞计数与分选3。此外，流式细胞术传统上被用于基于单个细胞分析蛋白质表达，依赖于特异性抗体。下述方案利用经典的流式细胞术技术，分离特定细胞类型，以进行后续分子生物学终点的分析。流式细胞仪每秒可分析数千个细胞，使其成为上述技术的一种快速且高效的替代方法。此外，细胞可根据特定蛋白质（例如神经递质受体）的细胞表达，或两种及以上蛋白质的共表达（特定细胞类型中多个蛋白质的共定位）进行分选。这使得研究者能够基于细胞的分子特性，高度选择性地分离特定神经细胞类型，从而明确其在大脑中的功能。
进行流式细胞术（FACS）时，需将神经细胞制备成单细胞悬液，使其通过流动池，流动池可携带并排列细胞，使其依次单列通过光束和激光进行分析。计算机采集每个细胞的数据，并将其绘制在直方图上，以分析特定参数（如细胞大小、颗粒度和荧光强度）。根据这些参数，细胞可立即被分选至不同的试管中，以便回收并进行后续任意终点指标的分析。以下所述方案使用三种抗体分别分选神经元（使用胸腺细胞抗原1，Thy1抗体）、星形胶质细胞（使用胶质细胞谷氨酸转运体GLT1抗体）以及小胶质细胞（使用分化簇分子11B，CD11b抗体）。该方案可按如下所述直接使用，也可根据实验需求更换不同抗体以分离特定类型的细胞。
在确定本方案是否适用于特定实验时，需考虑一些注意事项。其中一个主要注意事项可能涉及希望分离的特定细胞类型。在本方案中，所使用的三种抗体均为细胞外抗体，这使得实验者能够在染色过程中保持细胞类型的完整性，从而保护细胞内RNA、DNA和蛋白质的完整性。然而，有时可能需要使用识别仅在特定细胞内部表达蛋白的抗体来分离某种特定的神经细胞类型。例如，可能希望使用酪氨酸羟化酶抗体来分离多巴胺能神经元，或使用胆碱乙酰转移酶抗体来分离乙酰胆碱能神经元。这些蛋白位于细胞内，因此需要对细胞膜进行固定和通透处理，以便后续使用相应抗体进行染色。尽管此前已有相关报道4,5，但该过程可能会显著降低从这些通透化细胞中提取的RNA或DNA产量。另一个注意事项是，并非所有抗体都适用于荧光激活细胞分选（FACS）。例如，目前可能正在使用一种在蛋白质印迹（western blot）中效果良好的抗体，而该技术需要对蛋白质进行变性处理。然而，这种抗体可能并不适合用于FACS鉴定细胞类型，因为在本方案中蛋白质不会经历任何变性步骤，因此抗体可能无法与其天然抗原结合。各公司提供的抗体说明书会标明其已验证适用的实验应用。如果某抗体未被批准用于流式细胞术，这不应完全阻止研究者尝试将其用于本方案；但应意识到其在FACS中的有效性无法得到保证。本方案的第三个注意事项与希望分离的细胞数量有关。FACS是一种极为有效的技术，即使从少量组织中也能获得尽可能多的细胞。然而，若希望从相对较小的脑区分离出数量稀少的细胞群体，则单个动物所提供的细胞产量本质上会较低。在此情况下，可能需要将同一处理组中多个动物的脑组织合并，以获得后续分析所需的足够细胞数量；不过，最近有研究报道，通过对少量活化神经元（占分选神经元总数的5–6%）的cDNA进行基因靶向预扩增，实现了基因表达分析，表明即使不合并大量动物样本，也有可能对小群神经细胞进行基因表达分析6。本技术的最后一个注意事项是，操作者应能够方便地使用细胞分选仪。细胞分选仪是一种复杂的设备，需要经过充分培训才能正确操作。因此，这类仪器通常由核心设施中的合格技术人员负责运行。此外，本实验的目标是在解离神经组织并完成特异性抗体染色后，尽快（可能在半天内）将样品送至分选仪。这一时间框架有助于提高分离细胞的存活率和得率，并维持细胞完整性，以便后续处理与分析。若上述所有条件均能满足，则FACS是一种分析神经组织中细胞类型特异性基因与蛋白表达的优良方法。
所有实验均依照特拉华大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）以及美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的规定进行。
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方案
1. 组织采集前准备（15–30 分钟）
- 将三组玻璃巴斯德吸管用火焰抛光，使其直径依次减小，并编号为：“1”号约1 mm直径，“2”号约0.75 mm直径，“3”号约0.50 mm直径。
- 根据神经解离试剂盒（见材料表）提供的说明，用全部缓冲液A重悬冻干的酶A。切勿涡旋震荡。将溶液分装为每份50 µl ，于-20 ºC保存以备后续使用。
- 配制1 L去髓鞘缓冲液，并通过真空过滤进行灭菌[去髓鞘缓冲液 = 1,000 ml 0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）、2 ml 500 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和10 g牛血清白蛋白（BSA）]。
- 将尼龙筛网剪成若干1 ×1英寸（2.5×2.5 cm）的小方块，用于过滤细胞碎片，并将其放入覆有铝箔的小烧杯中进行高压灭菌。
- 配制1 L洗涤缓冲液[洗涤缓冲液 = 1,000 ml 0.1 M PBS、2 ml 500 mM EDTA和10 g BSA]。
2. 组织采集
- 将水浴锅预热至 37 ºC。
- 通过向 Buffer X 中加入 β-巯基乙醇，配制 Neural Dissociation Kit 中的 Buffer X，使其终浓度为 0.067 mM（处理 4 个样本时，向 10 ml Buffer X 中加入 13.5 µl 的 50 mM β-巯基乙醇）。
- 按照 Neural Dissociation Kit 的说明书，通过将每份样本 50 µl 的 Enzyme P 与 1,900 µl 的 Buffer X 混合，制备 Enzyme Mix 1。例如，处理 4 个样本时，将 200 µl Enzyme P 与 7,600 µl Buffer X 混合。
- 将 Buffer X 置于 37 ºC 水浴中预热。
- 在无菌 6 孔培养板的每个待处理样本孔中加入 2 ml 冷的不含 Ca++ 和 Mg++ 的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS），并将培养板置于冰上，用于组织解离。
3. 组织解剖（45 分钟 – 1 小时）
- 根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南，向动物注射适当体积的安乐死溶液（商用巴比妥酸盐溶液，例如，Euthasol），并用冷的0.9%生理盐水灌注以清除全部血液。
- 给予大鼠过量的安乐死溶液。
- 通过呼吸和脚趾夹捏反应监测麻醉状态。当动物已充分麻醉（对脚趾夹捏无反应且呼吸深慢）时，即可进行灌注。
- 为进行灌注，使用一把结实的剪刀切开胸腔。剪开膈肌以暴露至心脏区域。沿两侧肋骨向上剪至胸部顶端，以充分暴露心脏。此时可用止血钳将肋骨向两侧固定。
- 通过将连接电动泵的18 G针头（适用于成年大鼠）插入心脏左心室进行心脏灌注。电动泵用于吸取冷的0.9%生理盐水。
- 然后用小剪刀剪开右心房，以便血液和灌注液从体内排出。
- 用约10 ml（成年大鼠）的0.9%生理盐水灌注大鼠，以清除所有外周免疫细胞和因子。
- 使用无菌剃刀片和适当的解剖方法分离所需脑区组织，然后将组织块放入不含Ca2+和Mg2+的冷HBSS中。
注意：本方案早期步骤需使用不含Ca2+和Mg2+的HBSS，因为这些离子可能干扰神经细胞解离所需的酶活性。 - 在收集完所有组织样本后，返回超净台或无菌培养罩中进行后续组织处理。
4. 神经组织解离（1 小时）
- 使用无菌剃刀片在6孔培养板的盖子上将每份组织样本切成小块。本方案适用于约30–100 mg的组织样本，但也可用于最大达400 mg的组织样本。对于超过400 mg的组织样本，需按比例增加试剂体积。
- 用1 ml不含Ca2+和Mg2+的新鲜HBSS，通过移液器将切碎的组织块转移至无菌的2 ml离心管中。对所有样本重复步骤4.1和4.2，直至所有样本均转移至2 ml离心管中。
- 在室温下以300 × g离心2分钟，随后吸除上清液。
- 向每份样本中加入1,900 µl温热的酶混合液1（按步骤2.2和2.3配制），并盖紧管盖。
- 将样本置于37 ºC水浴中孵育15分钟，每隔5分钟轻轻倒置管子数次，以重新悬浮沉降的组织碎片。
- 同时，通过将20 µl缓冲液Y与10 µl解冻后的酶A混合来配制酶混合液2（对于4个样本，将80 µl缓冲液Y与40 µl解冻后的酶A混合）。
- 向每份样本中加入30 µl酶混合液2，并轻轻倒置混匀。切勿涡旋震荡。
- 使用Pasteur移液管“1”对每份组织样本进行解离，上下吹打30次。
- 将样本置于37 ºC水浴中继续孵育15分钟，每隔5分钟倒置管子数次，以重新悬浮沉降的组织碎片。
- 使用Pasteur移液管“2”对每份组织样本进行解离，上下吹打30次。避免产生气泡。
- 使用Pasteur移液管“3”对每份组织样本进行解离，上下吹打30次。避免产生气泡。
- 将样本置于37 ºC水浴中孵育10分钟，每隔5分钟倒置管子数次，以重新悬浮沉降的细胞。
- 将单细胞悬液通过置于15 ml Falcon管顶部的80微米细胞滤网过滤，以去除任何大块碎片，并用10 ml含Ca2+和Mg2+的HBSS冲洗滤网和细胞，以终止酶反应。重复操作，直至每份样本均转移至洁净的15 ml Falcon管中。
- 在室温下以300 × g离心10分钟，随后吸除上清液。
5. 髓鞘耗竭（45 分钟）
- 用 400 µl 去髓鞘缓冲液充分重悬细胞沉淀。
- 加入指定量的去髓鞘磁珠，用移液器吹打混匀，确保充分混合。
注意：所用去髓鞘磁珠的体积取决于组织大小、动物年龄以及特定脑区预期的髓鞘含量。例如， 对于成年大鼠海马组织样本（约 300 mg），需与 100 µl 去髓鞘磁珠共同孵育。 - 在 4 ºC 冰箱中孵育 15 分钟。
- 每份样本用 5 ml 去髓鞘缓冲液洗涤一次。
- 在室温下以 300 × g 离心 10 分钟。
- 离心过程中，将每份样本对应的分离柱置于磁力分选仪的磁场中，并在每根柱子上方放置一个洁净的 80 微米滤网。
- 用 1 ml 去髓鞘缓冲液冲洗每根柱子 3 次（共 3 ml），以预处理柱子和滤网。将所有流出液收集至废液容器中，例如空枪头盒底部。
- 将 5 ml 聚苯乙烯圆底管直接放置于每根柱子下方，用于收集样本。
- 细胞离心结束后，吸除上清液，并用 500 µl 去髓鞘缓冲液充分重悬。立即将细胞悬液加至柱子中，并用下方的收集管收集细胞。
- 用 1 ml 去髓鞘缓冲液洗涤滤网和柱子 4 次（共 4 ml）。
- 将收集的细胞在室温下以 300 × g 离心 10 分钟。
- 吸除上清液，细胞即可用于染色。
6. FACS 染色活细胞（染色需 1 小时）
- 轻轻涡旋振荡细胞（2秒）以重悬沉淀，立即加入5 µl Fc阻断剂（抗分化簇32，CD32），再次涡旋振荡，于4 ºC冰箱中孵育5分钟。
- 同时，配制一抗混合液：按以下比例将三种一抗加入洗涤缓冲液中，每 100 µl 洗涤缓冲液中加入 0.125 µl 别藻蓝蛋白（APC）标记的 CD11b 抗体（1:800）、1 µl 抗 GLT1 抗体（1:100）和 0.4 µl 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的 Thy1 抗体（1:250）。每个样本将加入 100 µl 一抗混合液进行孵育；但如果样本组织量远超过 400 mg，则可相应增加一抗混合液的体积。
- 为单染对照准备试管，从每个样本管中取出 2 µl 细胞，分别加入各单染对照管中。“单染”对照包括：仅 APC-CD11b、仅 GLT1、仅 FITC-Thy1、仅 PE 二抗，以及“空白”或未染色对照。
注意：所有样本均应出现在每种染色对照中，因此需从每个样本中取 2 µl 细胞加入每支染色对照管。 - 短暂涡旋振荡各管（2秒），向每个样本管中加入100 µl一抗混合液，向每个染色对照管中加入100 µl相应的一抗，再次涡旋振荡各管，用铝箔包裹管子以避光保护荧光抗体，并将管子置于4 ºC冰箱中孵育20分钟。后续操作过程中应始终保持样品处于低温（4 ºC），以维持样品和抗体的完整性。
- 短暂涡旋振荡各管，然后向每管中加入2 ml洗涤缓冲液。
- 在 4 ºC 条件下，以 350 × g 离心 5 分钟。
- 同时，通过在每100 µl洗涤缓冲液中加入0.2 µl PE标记的山羊抗兔二抗来配制二抗混合液。每个样品将加入100 µl二抗混合液；然而，如果您的样品组织量远超过400 mg，则可能需要相应增加一抗混合液的体积。
- 离心结束后，将每个样品的上清液倒入水槽，并将离心管倒置在纸巾上吸去残留液体。
- 短暂涡旋混匀各管，向每个样本管中加入100 µl二抗混合液，向每个染色对照管中加入相应的二抗，再次涡旋混匀各管，用铝箔纸包裹管子，于4 ºC冰箱中避光孵育15 min。
注意：仅用于 GLT1 染色的对照管应加入二抗混合液。 - 孵育后，短暂涡旋振荡各管，然后向每管中加入2 ml洗涤缓冲液。
- 在 4 ºC 条件下，以 350 x g 离心 5 分钟。
- 离心结束后，将每个样品的上清液倒入水槽，并将离心管倒置在纸巾上吸干残留液体。
- 涡旋混匀各管，向每管中加入 0.25 ml 无菌 PBS。样品即可用于分选。
注意：细胞数量较多时可能需要0.5 ml无菌PBS；但最好先使用较低体积，因为如果细胞浓度过高，后续可随时稀释样本。
注意：可选择性地向管中加入DNase，以防止细胞聚集，从而避免堵塞分选仪。分选前也可使用无菌的80微米滤膜过滤样品，以防止分选仪堵塞。 - 将细胞置于冰上送至分选仪。用含有0.5 ml无菌PBS的2 ml无核酸酶离心管收集细胞群体。
- 分选后，在4 ºC条件下以300 x g离心2分钟。吸除大部分PBS，将细胞在-80 ºC冰箱中快速冷冻，直至进行后续处理，用于RNA提取（详见步骤1的实验方案细节）、DNA提取（详见步骤2的实验方案细节）或细胞裂解以进行蛋白质分析。
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结果
髓鞘耗竭与组织灌注的重要性
图1展示了髓鞘去除的重要性。当单细胞悬液与髓鞘去除磁珠孵育、洗涤后，再通过磁性分选柱时，即完成了髓鞘去除（上述方案中的步骤5.1至5.12）。这些步骤的目的是减少每个样本中细胞碎片的含量。由于神经元在解离和吹打过程中，其原本被髓鞘包裹的突起可能被剪切下来，因而可能对Thy1抗体呈阳性染色。这会产生髓鞘碎片，最终干扰抗体染色和细胞分选效果，同时也会降低从每个样本中回收的细胞相对数量。在图1中，各图面板中绘制的多边形代表将被设门并用于后续分选分析的活细胞。该活细胞设门依据前向散射光（FSC，反映细胞大小）和侧向散射光（SSC，反映细胞颗粒度）进行划定，从而排除死细胞和/或细胞碎片。因此，活细胞应具有较低的颗粒度（低SSC）以及适中的大小（FSC，既不过小也不过大）。样本1（图1A）和样本2（图1B）代表两个分别使用上述全部步骤独立制备的海马样本。在样本1中，被设门的细胞占分析总事件数的53.9%（9,656个细胞/17,91...
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讨论
与许多其他组织和系统类似，大脑由多种异质性细胞群体组成，这些细胞共同作用以影响行为。对这种异质性细胞群体中单个细胞的基因表达、蛋白质表达或表观遗传修饰进行分析，有望揭示有关整个系统功能的信息，识别调控正常行为和疾病过程的细胞机制，并为潜在的治疗提供细胞类型特异性的靶点。未来有可能通过调控大脑中某一特定细胞类型的功能，更精确地治疗神经退行性疾病或神经精神疾病，从而减少因影响多种细胞类型而引起的非特异性副作用。因此，未来神经科学研究的一个关键方向必须是深入理解大脑中不同细胞类型之间的相互作用，以及它们如何影响行为和疾病状态。本文所述的FACS技术的目标是快速分离出特定的细胞群体，以便进行后续分析。该技术也可根据具体研究需求进行调整，用于分析更为特定的细胞类型。
在本方案中，有几个关键步骤有助于提高使用该技术分离神经细胞的成功率。首先需要说明的是，上述方案已针对从新鲜大鼠脑组织中分离特定细胞类型进行了优化。尽管这些步骤中的许多可能也适用于处理和分离先前冷冻或固定的组织中的单个细胞类型，但这些操作的具体条件必须另行优化。我们发现，用冷的生理盐水灌注神经组织以清除其中的血液，有助于减少神经细...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢特拉华大学海伦·F·格雷厄姆癌症中心转化研究中心的Lynn Opdenaker在技术方面提供的协助，感谢杜克大学癌症研究所流式细胞术共享资源中心的Nancy Martin，以及Susan H. Smith博士在实验方法和数据收集方面给予的指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 神经组织解离试剂盒（P型） | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| 髓鞘去除磁珠II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | |
| LS型分离柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS细胞分选器 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS多功能支架 | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 尼龙筛网片 | Amazon | CMN-0074-10YD | 宽度40英寸，孔径80微米 |
| Fc阻断剂／抗CD32抗体 | BD Biosciences | BDB550270 | 适用于大鼠 |
| APC标记的CD11b抗体 | Biolegend | 201809 | 适用于大鼠 |
| 兔抗GLT1抗体 | Novus Biologicals | NBP1-20136 | 适用于大鼠或人 |
| PE标记的抗兔二抗 | eBioscience | 1037259 | 用于抗GLT1抗体的二抗 |
| FITC标记的抗大鼠CD90（Thy1）小鼠抗体 | Biolegend | 202504 | 适用于大鼠 |
参考文献
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