Method Article

的hiPSC神经细胞系特异性敲开记者代高效使用CRISPR / Cas9和Cas9双切口酶系统

DOI:

10.3791/52539

⸱

May 28th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3The Senator Lloyd & B. A. Bentsen Center for Stroke Research, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 4Summer Research Program, Office of Educational Programs, The University of Texas Health Science Center at Houston, 5Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical University, 6Department of Oncology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 7Biology Department, University of West Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基因组编辑工具，如 CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR 相关）系统，大大提高了人类诱导多能干细胞 （hiPSC） 中的基因靶向效率。本手稿描述了使用 CRISPR/Cas 系统辅助同源重组生成谱系特异性 hiPSC 报告基因的方案。

Abstract

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基因靶向是现代生物医学研究表征基因功能的一个重要方法。然而，基因在人类细胞靶向效率一直较低，从而防止人细胞系的产生在所需的速率。近两年来，在提高遗传操纵基因组编辑工具效率的快速进展，如CRISPR（聚集定期短相互间隔重复回文）/ CAS（CRISPR相关）系统。这份手稿描述了一个协议，用于使用辅助同源重组的CRISPR / CAS系统沿袭特定的人类诱导多能干细胞（hiPSC）记者。为获得必要的组件制造神经系记者行使用CRISPR / CAS系统，重点建设目标向量和引导单RNA的过程，进行了描述。该协议可以扩展到平台建立和突变校正在人iPS细胞。

Introduction

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CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas（CRISPR 相关）系统与其他基因组编辑工具一起，近年来彻底改变了人类基因组作1-7。CRISPR/Cas9 系统的主要成分是单向导 RNA （sgRNA） 和 Cas9。Cas9 是一种 RNA 引导的 II 型 DNA 核酸内切酶。它有两个核酸酶结构域 HNH 和 RuvC，负责在前间隔区相邻基序 （PAM） 旁边的特定基因组区域制造 DNA 双链断裂 （DSB）7-10。sgRNA 具有 crRNA 和 tracrRNA 的组合功能，crRNA 和 tracrRNA 是两种适应性免疫 RNA 分子，在细菌（如化脓性链球菌）和古细菌中鉴定出来，用于对抗外源来源的 DNA 入侵9-11。当设计得当并共同引入哺乳动物细胞时，sgRNA 可识别 PAM 序列，与靶 DNA 的互补链形成碱基对，并引导和反式激活 Cas9 以在 PAM7 上游的两条 DNA 链处切割。随后，将发生同源定向重组（HDR，在存在靶向载体的情况下）或非同源末端连接 （NHEJ） 以修复 DSB。可以整合转基因，如 cDNA、报告基因盒或抗生素抗性片段，并制备转基因或敲入系。

尽管 CRISPR/Cas9 系统高效且相对特异性，但已报道了不需要的脱靶活性12-15。为了最大限度地减....

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Protocol

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1. 目标向量的设计和向量构造

  1. 一旦确定了谱系特异性标记，就定位基因的基因组序列并相应地设计同源臂。5' 同源臂的长度为 ~1 kb，3' 同源臂的长度为 ~1.5 kb（图 1）。
  2. 通过亚克隆，在终止密码子之前，在基因组序列下游依次标记报告盒，这样内源性表达就不会改变或破坏。将报告基因或双报告基因盒与自裂解的 2A 肽序列（F2A、E2A 或 T2A）20,21 或内部核糖体进入位点 （IRES） 连接起来><。 注意：报告基因可能包括荧光蛋白，如 GFP、tdTomato、tagRFP、YFP、荧光素酶或抗生素抗性盒，荧光蛋白和抗生素耐药盒的组合。图 1 显示了一个示例，用于构建由 EGFP 和新霉素抗性盒标记的人 ALDH1L1 基因的靶向载体。
  3. 在报告基因的下游添加阳性选择盒。阳性选择是絮凝的抗生素耐药盒，在选择和分离阳性克隆后，将从靶向 iPSC 中切除。
  4. 在 3' 同源臂之外包括一个阴性选择盒。常见的阴性选择盒是胸苷激酶、TK 和白喉毒素 A （DTA） 22。
  5. 获得包含谱系标记序列的人 BAC 克隆，并通过 PCR 扩增验证克隆。使用重组在含有 DH5α 的 pKD46 中构建靶向载体，以拉下靶向位点 23。必要时应用多站点网关、Golden gate 策略23,24

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Results

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构建

具有所有必要成分的靶向载体，包括同源臂、报告基因盒、阳性和阴性选择盒（图 1））。基于内源性基因组位点，将多个（2 到 3 个）sgRNA（如果使用 Cas9 系统）或 sgRNA 对（如果使用 Cas9n 双切口酶策略）设计并构建到人 gRNA 表达载体 MLM3636 或 pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n （D10A） 骨架中（图 2）。在转染 hiPSC 之前，通过 T7E1 测定在 293FT 细胞中评估 sgRNA（图 3）。预测脱靶位点。通过计算机模拟程序（步骤 5）预测的具有适度切割效率（插入缺失% 在 10-30% 之间）和较少潜在脱靶位点的 sgRNA 将用于通过电穿孔转染 hiPSC。成功转染和筛选后，可鉴定出阳性克隆。如果需要，使用从阳性克隆中分离的基因组 DNA 对潜在的脱靶位点进行 PCR。将进行测序或 T7E1 测定以确定是否存在脱靶事件。

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Discussion

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基因靶向是表征基因功能的重要工具。然而，效率相对较低，需要劳动密集型且耗时的工作。近年来，基因组编辑工具的发展，如CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas（CRISPR相关）系统，大大提高了靶向效率。本手稿描述了一种使用 CRISPR/Cas 系统辅助同源重组生成谱系特异性人类诱导多能干细胞 （hiPSC） 报告基因的方案。描述了使用 CRISPR/Cas 系统介导的基因组编辑获取制作神经谱系报告基因系所需成分的步骤，重点是构建用于 Cas9 和 Cas9n 双切口酶系统的靶向载体和单引导 RNA。

CRISPR/Cas9系统可以满足hiPSCs的各种基因工程需求。可用于制作敲除和敲除（例如报告基因）系、诱导平台系以及突变校正。根据基因修饰的目的，可以设计和构建相应的靶向载体，以便在Cas9诱导DSB后发生除易出错的非同源末端连接（NHEJ）之外的同源定向重组（HDR）。如果目的是在某些位点产生错义突变，则转染 sgRNA 和 Cas9 就足够了，不需要靶向载体。

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作得到了神经外科、纪念赫尔曼基金会 Staman Ogilvie 基金、德克萨斯大学休斯顿健康科学中心本特森卒中中心和 Mission Connect TIRR 基金会的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
pStart-KAddgene20346
pWS-TK6 Addgene20350
pKD3 Addgene45604
pKD46大肠杆菌遗传库存中心，CGSC7634
PGK-neo-bpA 序列 Addgene13442
目标基因的人类 BAC 克隆 
JDS246 （Cas9-003），哺乳动物密码子优化的化脓性链球菌 Cas9-3X FlagAddgene43861
MLM3636，含 U6 启动子的人 gRNA 表达载体 Addgene43860
pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n（D10A）Addgene42335
sgRNA 设计，ZiFithttp://zifit.partners.org/ZiFiT/
脱靶预测工具 CasOThttp://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php
Perlhttp://www.perl.org/get.html
NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAThttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start
sgRNA 引物合成Sigma
One shot Top10 Electrocomp 大肠杆菌感受态细胞Life TechnologiesC4040-50
AccuPrime Pfx SupperMixLife Technologies12344-040
限制性内切酶NEB 和 Life Technologies
Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒Zymo ResearechD4007
DNA 快速提取缓冲液 EpicentreQE0905T
Herculase II 融合 DNA 聚合酶Agilent Technologies600675
消化缓冲液 2New England Biolab
6X DNA 上样染料Thermo ScientificR0611
TeSR-E8 试剂盒，用于 hESC/hiPSC 维持干细胞技术05940
UltraPure 琼脂糖 Life Technologies16500-100
50xTAELife TechnologiesB49
Essential 8 培养基 杜
'不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水 Life TechnologiesA12856-01
D-MEM/F12 含 Glutamax Life Technologies10565018
含 Glutamax 的 D-MEM Life Technologies10566040
牛血清-ES 细胞合格 Life Technologies10439
Knockout 血清替代物 Life Technologies10828010
2-巯基乙醇 1000X Life Technologies21985023
必需氨基酸 Life Technologies11140050
Stempro Accutase Life TechnologiesA1110501
分散 Life Technologies17105-041
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 Life Technologies25200-056
Geltrex Life Technologies   12760-013
ROCK 抑制剂 Y-27632Millipore  SCM075
SMC4 试剂 BD354357
新霉素耐药 MEF MilliporePMEF-NL
潮霉素耐药 MEF MilliporePMEF-HL
G418 （Geneticin）LifeTechnologies11811
霉素B Life Technologies10687010
FIAU （Fialuridine， 1-2-Deoxy-2-fluoro-ß-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘呋喃啶 Moravek 生化和放射化学  M251
电穿孔仪：Gene Pulser Xcell Bio-Rad
0.4 cm 电穿孔比色皿 Bio-Rad165-2088
DIG-High 引物 DNA 标记和检测入门试剂盒 II Roche11585614910
杂交变性解决方案 VWR82021-478
PCR DIG 探针合成试剂盒 罗氏11636090910
DIG 洗碗套装 罗氏11585762001
抗地高辛 （DIG-AP）罗氏11093274910
CSPD 化学发光系统 Roche11755633001
DIG 洗涤和封闭缓冲液套装 Roche11585762001
50X TAE 缓冲液 Life Technologies24710030
印迹缓冲液（25 mM Tris pH 7.4，  0.15 M NaCl，  0.1% Tween20）
Hoefer 紫外线交联剂 Fisher Scientific03-500-308
亚精胺 FisherAC13274-0010
Tris HCl 2M （pH 7.5）VWR  200064-506
Denville Scientific 蓝色生物膜 8x10 Fishernc9550782
DNA分子量标记II（DIG标记的）罗氏11218590910
Amersham印迹膜Hybond-N+ 罗氏95038-400
Pyrex 玻璃干燥盘 Fisher15-242A
Kimberly-Clark C 型折叠纸巾 Fisher06-666-32B
Whatman 3MM 纸 （26X41）Fisher  05-713-336
杂交袋 Roche11666649001
杂交管 Fisher13-247-300
杂交烤箱烤肉店 Shake 'n' Stack 费舍尔HBMSOV14110
https://bacpac.chori.org尔贝科A1517001 Life Technologies胎非潮

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  2. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 8....

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CRISPR Cas9Double Nickase SystemhiPSC Neural LineageKnockin Reporter GenerationTargeting Vector ConstructionSingle Guide RNA DesignT7 Endonuclease AssayOff Target Site PredictionHomologous RecombinationPlasmid Preparation

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