基因组编辑工具（如CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统）显著提高了在人诱导性多能干细胞（hiPSCs）中进行基因靶向的效率。本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，构建谱系特异性hiPSC报告细胞系的实验方案。
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方法文章
利用CRISPR/Cas9与Cas9双切口酶系统高效构建hiPSC神经谱系特异性敲入报告细胞系
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
基因靶向是现代生物医学研究中用于鉴定基因功能的关键方法。然而，人类细胞中基因靶向的效率较低，限制了人类细胞系以理想速度的建立。过去两年中，基因组编辑工具（如CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统）在提高基因操作效率方面取得了快速进展。本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，构建谱系特异性人类诱导多能干细胞（hiPSC）报告细胞系的实验方案。文中详细介绍了使用CRISPR/Cas系统构建神经谱系报告细胞系所需关键组分的操作步骤，重点包括靶向载体和单导向RNA的设计与构建。该方案还可拓展应用于hiPSC中的平台建立及突变修复。
引言
CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统，连同其他基因组编辑工具，在近年来彻底改变了人类基因组的操作方式1-7。CRISPR/Cas9系统的主要组分是单链向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白。Cas9是一种RNA引导的II型DNA内切酶，具有两个核酸酶结构域——HNH和RuvC，可在原间隔序列邻近基序（PAM）附近的特定基因组区域产生DNA双链断裂（DSBs）7-10。sgRNA兼具crRNA和tracrRNA的功能，这两种RNA分子是细菌（如Streptococcus pyogenes）和古菌中发现的适应性免疫RNA分子，用于抵御外源DNA的入侵9-11。当被合理设计并共导入哺乳动物细胞后，sgRNA可识别PAM序列，与靶DNA的互补链进行碱基配对，并引导及转激活Cas9蛋白，在PAM序列上游立即切割双链DNA7。随后，细胞将通过同源定向重组（HDR，存在靶向载体时）或非同源末端连接（NHEJ）机制修复这些双链断裂。外源基因如cDNA、报告基因盒或抗生素抗性片段可被整合，从而构建转基因或基因敲入细胞系。
尽管CRISPR/Cas9系统具有高效性和相对特异性，但已有报道称其存在非预期的脱靶效应12-15。为了最大限度减少脱靶事件，研究人员已开发出Cas9切口酶（Cas9n）9,10,14,16,17。Cas9n（Cas9 D10A....
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方案
1. 靶向载体的设计与载体构建
- 确定谱系特异性标记物后，查找该基因的基因组序列，并据此设计同源臂。5’同源臂长度约为1 kb，3’同源臂长度约为1.5 kb（图1）。
- 通过亚克隆将报告基因表达盒依次插入到基因组序列的下游、终止密码子之前，以确保内源性表达不受改变或破坏。使用自剪切的2A肽序列（F2A、E2A或T2A）20,21或内部核糖体进入位点（IRES）连接报告基因或双报告基因表达盒。
注意：报告基因可包括荧光蛋白（如GFP、tdTomato、tagRFP、YFP）、荧光素酶、抗生素抗性表达盒，或荧光蛋白与抗生素抗性表达盒的组合。例如，在图1中展示了针对人ALDH1L1基因的打靶载体构建，该载体在EGFP和新霉素抗性表达盒标记下进行。 - 在报告基因下游添加一个阳性筛选表达盒。该阳性筛选元件为两侧带有loxP位点的抗生素抗性表达盒，在筛选并分离出阳性克隆后，可从靶向修饰的iPSC中将其切除。
- 在3’同源臂之外包含一个阴性筛选表达盒。常用的阴性筛选表达盒包括胸苷激酶（TK）和白喉毒素A（DTA）22。
- 获取含有所述谱系标记物序列的人源BAC克隆，并通过PCR扩增验证克隆的正确性。利用重组工程技术，在含pKD46的DH5α菌株中构建打靶载体，以捕获目标位点23。必要时可采用多片段Gate....
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结果
包含同源臂、报告基因盒、阳性与阴性筛选盒等所有必要元件的靶向载体被构建 （图1）。根据内源基因组位点，设计并构建多个（2至3个）sgRNA（若使用Cas9系统）或sgRNA配对（若使用Cas9n双切口酶策略），并将其克隆至人源sgRNA表达载体MLM3636或pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) 骨架中 （图2）。在转染人诱导多能干细胞（hiPSCs）之前，通过T7E1检测在293FT细胞中评估sgRNA的切割效率 （图3）。同时预测脱靶位点。选择切割效率适中（插入缺失率在10%-30%之间）且通过in silico分析（步骤5）预测潜在脱靶位点较少的sgRNA，通过电穿孔法用于转染hiPSCs。在成功转染并完成筛选后，鉴定阳性克隆。如有需要，使用从阳性克隆中提取的基因组DNA，对潜在脱靶位点进行PCR扩增。随后通过测序或T7E1检测，确定是否存在脱靶效应。
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讨论
基因靶向是研究基因功能的重要工具。然而，由于其效率相对较低，需要耗费大量人力和时间。近年来，基因组编辑工具的发展，特别是CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统的出现，显著提高了靶向效率。本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，构建谱系特异性人类诱导多能干细胞（hiPSC）报告细胞系的实验方案。文中详细介绍了使用CRISPR/Cas系统进行基因组编辑以获得神经谱系报告细胞系所需各组分的操作步骤，重点阐述了靶向载体以及用于Cas9和Cas9n双切口酶系统的单导向RNA的构建方法。
CRISPR/Cas9 系统可用于满足人诱导多能干细胞（hiPSCs）中多种基因工程需求。该系统可用于构建基因敲除和基因敲入（例如，报告基因）细胞系、诱导型平台细胞系以及进行突变校正。根据基因修饰的目的，可设计并构建相应的靶向载体，使得在 Cas9 诱导产生双链断裂（DSB）后，发生同源定向重组（HDR），而非易错的非同源末端连接（NHEJ）。若目的是在特定基因座引入错义突变，则转染 sgRNA 和 Cas9 即可，无需使用靶向载体。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由神经外科、纪念赫尔曼基金会斯塔曼·奥格尔维基金、德克萨斯大学休斯顿健康科学中心本特森卒中中心以及使命连接蒂尔基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pStart-K | Addgene | 20346 | |
| pWS-TK6 | Addgene | 20350 | |
| pKD3 | Addgene | 45604 | |
| pKD46 | 大肠杆菌遗传保种中心，CGSC | 7634 | |
| PGK-neo-bpA 序列 | Addgene | 13442 | |
| 人类目标基因的BAC克隆 | https://bacpac.chori.org | ||
| JDS246（Cas9-003），哺乳动物密码子优化的化脓性链球菌 Cas9-3X Flag | Addgene | 43861 | |
| MLM3636，带有U6启动子的人源gRNA表达载体 | Addgene | 43860 | |
| pX335-U6-嵌合体_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Addgene | 42335 | |
| sgRNA 设计，ZiFit | http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | ||
| 脱靶预测工具 CasOT | http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php | ||
| Perl | http://www.perl.org/get.html | ||
| NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | ||
| BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | ||
| sgRNA 引物合成 | Sigma | ||
| Top10 电转感受态大肠杆菌，一管装 | Life Technologies | C4040-50 | |
| AccuPrime Pfx SuperMix | Life Technologies | 12344-040 | |
| 限制性内切酶 | NEB 和 Life Technologies | ||
| Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒 | Zymo Research | D4007 | |
| DNA快速提取缓冲液 | Epicentre | QE0905T | |
| Herculase II 融合 DNA 聚合酶 | 安捷伦科技 | 600675 | |
| 消化缓冲液2 | 新英格兰生物实验室 | ||
| 6X DNA上样缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | R0611 | |
| TeSR-E8 人胚胎干细胞/人诱导多能干细胞维持试剂盒 | 干细胞技术 | 05940 | |
| UltraPure 琼脂糖 | Life Technologies | 16500-100 | |
| 50xTAE | Life Technologies | B49 | |
| Essential 8 培养基 | Life Technologies | A1517001 | |
| 杜尔贝科’不含钙和镁的磷酸盐缓冲液 | Life Technologies | A12856-01 | |
| 含谷氨酰胺-最大量的D-MEM/F12培养基 | Life Technologies | 10565018 | |
| 含谷氨酰胺的D-MEM培养基 | Life Technologies | 10566040 | |
| 胎牛血清-胚胎干细胞级别 | Life Technologies | 10439 | |
| 无血清替代物 | Life Technologies | 10828010 | |
| 2-巯基乙醇 1000X | Life Technologies | 21985023 | |
| 非必需氨基酸 | Life Technologies | 11140050 | |
| Stempro Accutase | Life Technologies | A1110501 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Life Technologies | 25200-056 | |
| Geltrex | Life Technologies | 12760-013 | |
| ROCK抑制剂Y-27632 | Millipore | SCM075 | |
| SMC4 试剂 | BD | 354357 | |
| 新霉素抗性小鼠胚胎成纤维细胞 | Millipore | PMEF-NL | |
| 潮霉素抗性MEF | Millipore | PMEF-HL | |
| G418（遗传霉素） | LifeTechnologies | 11811 | |
| 潮霉素B | Life Technologies | 10687010 | |
| FIAU（Fialuridine，1-2-脱氧-2-氟-ßD-阿拉伯呋喃糖基-5-碘尿嘧啶 | 莫拉维克生化与放射化学公司 | M251 | |
| 电穿孔仪：Gene Pulser Xcell | 伯乐（Bio-Rad） | ||
| 0.4 cm 电穿孔比色皿 | 伯乐（Bio-Rad） | 165-2088 | |
| DIG-高效DNA标记与检测起始试剂盒II | 罗氏 | 11585614910 | |
| 杂交变性溶液 | VWR | 82021-478 | |
| PCR DIG探针合成试剂盒 | 罗氏 | 11636090910 | |
| DIG洗涤液套装 | 罗氏 | 11585762001 | |
| 抗地高辛（DIG-AP） | 罗氏 | 11093274910 | |
| CSPD 化学发光系统 | 罗氏 | 11755633001 | |
| DIG洗涤与封闭缓冲液套装 | 罗氏 | 11585762001 | |
| 50X TAE 缓冲液 | Life Technologies | 24710030 | |
| 印迹缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4， 0.15 M NaCl, 0.1% Tween20 | |||
| Hoefer 紫外交联仪 | Fisher Scientific | 03-500-308 | |
| 亚精胺 | Fisher | AC13274-0010 | |
| Tris HCl 2M (pH 7.5) | VWR | 200064-506 | |
| Denville Scientific 蓝色生物膜 8x10 | Fisher | nc9550782 | |
| DNA分子量标记物II（DIG标记） | 罗氏 | 11218590910 | |
| Amersham 印迹膜 Hybond-N+ | 罗氏 | 95038-400 | |
| Pyrex 玻璃干燥盘 | Fisher | 15-242A | |
| 金佰利C型折叠纸巾 | Fisher | 06-666-32B | |
| Whatman 3MM 滤纸 (26×41) | Fisher | 05-713-336 | |
| 杂交袋 | 罗氏 | 11666649001 | |
| 杂交管 | Fisher | 13-247-300 | |
| 杂交炉旋转架 Shake 'n' Stack | Fisher | HBMSOV14110 |
参考文献
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 8....
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重印与许可
