使用同源物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生

摘要

本视频文章展示了一种全面的实验方案，可在同一组织切片中检测并定量成年海马神经发生的各个阶段。我们改进了一种方法，以克服在无法获得来自不同宿主物种的合适抗体时，间接多重免疫荧光技术所存在的局限性。

摘要

成年神经发生是一个受到高度调控的多阶段过程，新的神经元由激活的神经干细胞通过一系列逐步定向分化的中间前体细胞亚型产生。这些前体细胞亚型各自表达一组特定的分子标记物，并结合特定的形态学标准，可用于其识别与鉴定。通常采用免疫荧光技术，结合亚型特异性抗体以及外源性或内源性增殖标记物进行检测。本文描述了用于检测和定量成年海马神经发生各阶段的免疫标记方法，包括胸腺嘧啶类似物的应用、经心脏灌注、组织处理、热诱导表位修复、ABC免疫组织化学、多重间接免疫荧光、共聚焦显微镜观察以及细胞定量分析。此外，我们还介绍了 一种连续多重免疫荧光染色方案，可避免因使用同一宿主物种来源的一抗而通常引发的问题。该方法能够在单个切片中同时精确定位所有海马区前体细胞亚型及增殖标志物。这些技术为并行研究不同前体细胞亚型的调控机制、其在脑部病理过程中的参与以及其在特定脑功能中的作用提供了强有力的工具。

引言

大脑中有两个区域在整个生命过程中持续产生新的神经元，分别是侧脑室的室下区和海马齿状回（DG）的颗粒下区（SGZ）。新生神经元起源于神经前体细胞，并经历多个形态学和生理学发育阶段后最终成熟^1,2。从缓慢分裂的放射状胶质样干细胞（1型）开始，依次产生一系列过渡性扩增的中间前体细胞。其中更未分化的亚型（2a型和2b型）形态不规则，具有较短的切向突起。这些细胞进一步生成神经母细胞（3型），后者逐渐退出细胞周期，转变为未成熟神经元（树突伸向分子层），最终作为成熟的颗粒细胞整合入海马神经网络。由于这些细胞具有特殊的生理特性，可为神经回路提供更强的可塑性³，提示其在海马功能中具有独特作用。事实上，过去十年的研究已积累大量证据表明，成年期神经发生参与空间记忆、模式分离以及情绪行为的调控^4,5。

成年神经发生可通过多种方法进行研究。胸苷类似物可在细胞周期S期掺入DNA，从而实现新生细胞的出生时间标记、定量分析及命运追踪^6-8。依次使用不同的胸苷类似物（例如，CldU、EdU或IdU）可用于研究细胞更替或在实验过程中不同时间点出生的细胞群体⁹。另一种内源性细胞增殖标记物是Ki67，它在细胞周期的所有分裂阶段（G1、S、G2、M）均有表达，但在静止期（G0）及G1早期除外 ^10,11。为了分析成年齿状回中新生细胞群体的表型，可使用多种阶段特异性分子标记物，如GFAP、nestin、DCX和NeuN^1,6。GFAP是成熟星形胶质细胞的标记物，但在成年前脑中的放射状胶质样细胞中也有表达；nestin是一种特异性表达于放射状胶质样细胞和早期中间前体细胞的中间丝蛋白；DCX是一种微管相关蛋白，表达于中间前体细胞、成神经细胞及未成熟神经元中。根据上述三种标记物的共表达情况以及标记细胞的形态特征，可识别出四种不同的前体细胞亚型：1型（GFAP⁺、nestin⁺、DCX^-）、2a型（GFAP^-、nestin⁺、DCX^-）、2b型（GFAP^-、nestin⁺、DCX⁺）和3型（GFAP^-、nestin^-、DCX⁺）¹。将DCX与表达于有丝分裂后神经元的NeuN进行共标记，可区分未成熟（DCX⁺、NeuN⁺）和成熟（DCX^-、NeuN⁺）颗粒细胞神经元。

上述标记物常用于免疫荧光共标记，随后通过共聚焦显微镜分析新生细胞的数量和类型。该过程通常需要使用来自不同宿主物种的抗体，以避免抗体之间发生非特异性交叉反应。然而，大多数适用于神经发生研究的初级抗体均由兔或鼠制备例如， 小鼠 α-BrdU、小鼠 α-NeuN、兔 α-Ki67、兔 α-GFAP）。这严重限制了在单一切片中可检测的抗原数量及其组合方式。进而不仅因需进行多次染色而增加染色工作量，还可能影响结果的可靠性。此外，某些抗原易受甲醛固定引起的表位遮蔽影响例如， Ki67、nestin）。本文描述了对经典单重和多重免疫标记方案的改进方法（例如， 表位修复，多重连续免疫染色，使用巢蛋白-GFP转基因小鼠¹²) 可以克服上述诸多问题。特别是，多重免疫荧光染色的顺序标记方案允许对多达四种不同抗原进行染色，即使部分抗体来源于同一宿主。该方法能够在同一组织切片中同时检测 I 型、IIa 型、IIb 型和 III 型前体细胞及其增殖活性。

方案

注意：所有涉及活体动物的操作均依照欧盟指令86/609/EEC关于实验动物护理与使用的指南进行，并经当地伦理委员会（Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz）批准。

1. 胸腺嘧啶类似物的腹腔注射

1. 在注射前一天称量动物体重。根据次日计划进行的所有注射，计算所需的胸苷类似物总量，并计算每只动物按体重调整后的注射体积（使用10 mg/ml的储备液）。
2. 配制10 mg/ml的胸苷储备液。（注意！ 胸苷类似物具有毒性。请遵循供应商提供的具体材料安全数据表（MSDS）要求，即 穿戴实验服和手套，在化学通风橱中操作）。
   1. 从冷冻保存条件下取出胸苷类似物，恢复至室温（约21 °C）。称取10 mg，加入无菌生理盐水（用于BrdU和CldU）或含0.04 N NaOH的无菌生理盐水（用于IdU），涡旋混匀。置于50 °C水浴中至少10–15分钟，每2–3分钟涡旋一次，以充分溶解粉末。
      注：溶液在室温下可使用不超过24小时，在-20 °C下可保存数周。避免光照（用铝箔包裹）。每次使用前应检查是否有沉淀，必要时重新溶解。
3. 抓住小鼠颈部皮肤固定，使用带有30 G针头的精密注射器，将适当体积（按体重调整）的储备液（室温）进行腹腔注射。
   注：若需在同一动物体内依次给予CldU和IdU，建议使用等摩尔浓度（例如，42.5 mg/kg CldU 和 57.5 mg/kg IdU，相当于50 mg/kg BrdU）。因此，应相应调整10 mg/ml储备液的注射体积。

2. 组织制备

1. 在灌注前一天配制4%多聚甲醛（溶于0.1 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液中），4 °C保存。
2. 对深度麻醉的小鼠（3.5%异氟烷）经左心室进行心脏灌注，先用10 ml冰冻PBS灌注，随后用40 ml冰冻多聚甲醛（流速5 ml/min）灌注。取出脑组织，并在相同固定液中后固定24小时（4°C）。
3. 将脑组织依次转移至10%蔗糖溶液（4°C下24小时）和30%蔗糖溶液（直至脑组织沉底，约48小时）。冷冻时，将经冷冻保护的脑组织缓慢浸入-25 °C的异戊烷中，直至组织不再产生气泡。于-80 °C保存。
4. 使用冷冻切片机对脑组织进行冠状面切片，厚度为40 µm（切片机块温度为-25至-16 °C）。将切片按顺序转移至24孔细胞培养板的抗冻液各孔中（见图1）。于-20 °C保存。

图 1. 将切片机切片转移至 24 孔板的示意图。 从 A1 开始，将后续切片依次放入 A 行，A6 之后转入下一行 B，依此类推。到达 D6 后，返回 A1 并继续。此切片排列方式可实现对整个脑组织每第 n^th 个切片进行定量。若需定量新生细胞，取每第 6^th 个脑切片（相当于一列孔中的内容）；若用于免疫荧光表型分析，取每第 12^th 个脑切片（相当于同一列中两个交替行的孔内容）。

3. 免疫染色

注意：脑片通常在配备载体板和网状插件的6孔板中自由漂浮处理。作为例外，封闭、抗体孵育和ABC反应步骤在无网状插件的12孔或24孔板中进行（每孔0.5至1 ml即可，具体体积取决于需要染色的切片数量）。在这些步骤中，使用细毛刷转移脑片（每次更换新溶液时需冲洗毛刷）。所有孵育步骤均在持续振荡条件下进行（最高转速不超过150 rpm）。

1. 免疫组织化学（ABC法）
   1. 将切片从防冻液转移至TBS中，彻底清洗（4 °C下过夜一次，室温下每次10分钟，共5次），以完全去除防冻液。
   2. 在含1.5% H₂O₂的TBS-T中孵育30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。注意观察气泡产生情况，必要时重新将切片浸入溶液中。用TBS清洗3次，每次15分钟。
   3. 可选：同时将加热柜和2 N HCl预热至37 °C。将切片在37 °C下于2 N HCl中孵育30分钟以变性DNA。借助毛刷轻轻分离切片。
   4. 可选：在室温下用pH 8.5的0.1 M硼酸盐缓冲液中和10分钟。转移时，将承载切片的网状插件在纸巾上短暂轻拭，以去除残留的HCl。用TBS清洗2次，每次15分钟。
   5. 在TBSplus中孵育，以通透组织并阻断非特异性抗体结合位点，室温下1小时。
   6. 在TBSplus中稀释的一抗中孵育，4 °C下过夜。用TBS清洗3次，每次15分钟。
   7. 在TBSplus中稀释的生物素化二抗中孵育，室温下3小时。用TBS清洗3次，每次15分钟。同时……
   8. 根据制造商说明书配制ABC复合物（1% A + 1% B溶于TBS-T）。使用前室温静置30分钟。将切片在AB试剂中孵育1小时，室温。用TBS清洗3次，每次15分钟。
   9. 每6孔或12孔板准备50 ml含0.5 mg/ml DAB的TBS-T溶液，均分为两份，分别向每孔加入4 ml或2 ml。将切片转移至DAB溶液中（注意！ DAB有毒。请遵循供应商提供的具体MSDS要求，即穿戴实验服和手套，在化学通风橱中操作）。
   10. 向剩余的25 ml DAB溶液中加入0.5 ml 1% H₂O₂，混匀后按上述体积等量加入各孔，以启动过氧化物酶反应。孵育12分钟。用TBS清洗3次，每次15分钟。
   11. 用明胶将切片贴附于载玻片上，室温晾干过夜。用永久性封片剂封片。
   12. 可选：在封片前进行复染（见第3.5节）。
       注：若因背景过高导致信噪比较低，可在AB试剂孵育后（步骤3.1.8）重复H₂O₂处理。
2. 多重免疫荧光
   1. 单重或同时多重免疫荧光
      1. 将切片从防冻液转移至TBS中，彻底清洗（4 °C下过夜一次，室温下每次10分钟，共5次），以完全去除防冻液。
      2. 可选：同步骤3.1.3 – 3.1.4。
      3. 在TBSplus中孵育，以通透组织并阻断非特异性抗体结合位点，室温下1小时。
      4. 在TBSplus中稀释的一抗混合液（例如，大鼠抗BrdU、豚鼠抗DCX、山羊抗GFP）中孵育，4 °C下过夜。用TBS清洗3次，每次15分钟。
      5. 在TBSplus中稀释的荧光染料标记二抗混合液（例如，罗丹明红标记驴抗大鼠、Alexa-647标记驴抗豚鼠、Alexa-488标记驴抗山羊；均来源于驴）中孵育，室温下3小时或4 °C下过夜。此后需避光保护切片。用TBS清洗3次，每次15分钟。
      6. 用明胶将切片贴附于载玻片上，室温晾干过夜。用水溶性封片剂封片。
   2. 使用同一种宿主来源的一抗进行顺序多重免疫荧光
      1. 同步骤3.2.1.1 – 3.2.1.3。
      2. 在第一种一抗（例如，兔抗抗原A）中孵育，4 °C下过夜。用TBS清洗3次，每次10分钟，再用TBS-T清洗一次，10分钟。
      3. 在第一种荧光染料标记的二抗（例如，罗丹明红标记驴抗兔）中孵育，室温下3小时。此后需避光保护切片。用TBS清洗3次，每次10分钟，再用TBS-T清洗一次，10分钟。
      4. 在与一抗同源的正常血清（例如，兔血清）中孵育3小时，室温，以饱和第一种二抗上未结合的抗原结合位点。用TBS清洗3次，每次10分钟，再用TBS-T清洗一次，10分钟。
      5. 在含50 µg/ml未标记单价Fab片段（针对一抗宿主来源，例如，抗兔IgG (H+L)）的TBSplus中孵育，4 °C下过夜，以封闭可能被第二种二抗识别的表位。
      6. 至少用TBS清洗3次，每次10分钟，再用TBS-T清洗一次，10分钟。转移时，将承载切片的网状插件在纸巾上短暂轻拭，以去除残留的Fab片段。
      7. 在第二种一抗（例如，兔抗抗原B）中孵育，4 °C下过夜。用TBS清洗3次，每次10分钟，再用TBS-T清洗一次，10分钟。
      8. 在第二种荧光染料标记的二抗（例如，Alexa-488标记驴抗兔）中孵育，室温下3小时。用TBS清洗3次，每次15分钟，然后按上述方法贴片和封片。
         注：若需使用不同宿主来源的抗体标记抗原，可将其加入步骤3.2.2.2，相应二抗加入步骤3.2.2.3。
   3. 其中一种二抗与其中一种一抗同种属
      注：本方案适用于对BrdU或Ki67与GFAP、nestin-GFP及DCX进行四重染色。
      1. 严格遵循步骤3.2.1.1 – 3.2.1.5。在此阶段前仅使用TBSplus中的驴血清。
      2. 在含3%山羊血清的TBSplus中孵育1小时，室温。此步骤可封闭α-山羊二抗上未结合的抗原结合位点。用TBS清洗3次，每次10分钟，再用TBS-T清洗一次，10分钟。
      3. 在TBSplus中稀释的AMCA标记山羊抗兔抗体中孵育，室温下3小时或4 °C下过夜。用TBS清洗3次，每次15分钟，然后按上述方法贴片和封片。
   4. CldU与IdU共染
      1. 按第3.2.1节（步骤3.2.1.1 – 3.2.1.2）所述方法清洗、变性和中和切片。
      2. 在TBSplus中含20 µg/ml未标记Fab片段抗小鼠IgG (H+L)中孵育，室温下1小时。用TBS清洗4次，每次10分钟，再用TBS-T清洗一次，10分钟。
      3. 在含大鼠抗BrdU（1:400；纯化IgG2）和小鼠抗BrdU（1:350）的一抗混合液中孵育，4 °C下过夜。用TBS清洗3次，每次10分钟，再用TBS-T清洗一次，10分钟。
      4. 在含生物素化驴抗大鼠（1:500）和FITC标记驴抗小鼠Fab片段（1:100）的二抗混合液中孵育。用TBS清洗3次，每次10分钟，再用TBS-T清洗一次，10分钟。
      5. 在罗丹明红标记链霉亲和素中孵育，室温下2小时。用TBS清洗3次，每次15分钟，然后按上述方法贴片和封片。
   5. nestin-GFP小鼠中荧光信号的放大
      1. 将山羊抗GFP加入一抗混合液中。
      2. 将一种光谱特性与GFP相似的荧光染料标记二抗（如Alexa 488标记驴抗山羊）加入二抗混合液中。
3. 抗原修复
   1. 在去除防冻液并清洗后进行抗原修复。将含0.1 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）的6孔或12孔板放入蒸锅中预热至95 – 99 °C（约25分钟）。
   2. 将切片转移至热的柠檬酸缓冲液中，蒸煮30分钟（用铝箔覆盖板子，因塑料盖不耐高温）。
   3. 立即将板子放入冰浴中冷却。此步骤有助于保护组织形态，尤其在处理出生后动物脑切片时尤为重要。
   4. 用TBS清洗3次，每次10分钟，以去除并中和柠檬酸，随后继续染色步骤。
4. 在小鼠组织上使用小鼠源抗体
   1. 在第一次封闭步骤中（例如，步骤3.1.5或3.2.1.3）加入20 µg/ml单价Fab片段抗小鼠IgG (H+L)（与二抗同宿主物种）。
   2. 用TBS清洗4次，每次10分钟，再用TBS-T清洗一次，10分钟，然后按相应方案继续操作。
5. 焦油紫复染
   1. 将焦油紫溶液预热至60 °C（置于玻璃瓶中）。将载玻片在热溶液中孵育3分钟。
   2. 在去离子水中清洗，并依次在70%、96%和100%异丙醇中各脱水2次，每次1分钟。
   3. 在二甲苯或二甲苯替代剂中透明5 – 6分钟，然后用兼容的永久性封片剂封片。

4. 数据分析

1. 计数每6个过氧化物酶染色的新生细胞^th 沿整个齿状回的吻侧-尾侧范围进行切片。在400倍放大倍数下使用光学显微镜观察。
2. 将所得细胞数量乘以间隔时间，以估算新生细胞的总数。
3. 使用配备适当激光器和滤光系统的共聚焦激光显微镜对荧光标记的切片进行成像。在齿状回全长范围内随机选取位置，以400倍放大倍数采集图像序列，并对每侧半球至少50个随机选择的兴趣细胞进行其他标记物的共标分析。
4. 将共标记细胞的百分比（%/100）乘以新生细胞的总数，以计算特定新生细胞群体的绝对数量。

结果

我们应用上述方法对出生后及成年海马体中的新生细胞进行定量与表征。为此，我们使用了野生型小鼠以及神经发生缺陷型细胞周期蛋白D2基因敲除（Ccnd2KO）小鼠，并将其饲养于已知会影响神经发生速率的条件下（即，丰富环境，EE）^13,14。针对Ki67、BrdU、CldU或IdU的免疫组织化学DAB染色结果均一致显示，野生型小鼠与Ccnd2KO小鼠之间的新生细胞数量存在差异（图3）¹⁵。此外，通过等摩尔浓度的CldU与IdU连续注射，我们能够区分在特定丰富环境暴露时期内生成的细胞群体（图3C,D）。采用第3.2.4节所述方法，我们成功检测到CldU与IdU同时给药后信号强度相等且重叠效果极佳（图4）。BrdU标记的新生细胞可通过标准免疫荧光方法进行表型鉴定，即同时使用BrdU与NeuN抗体（图5），或联合使用BrdU、GFAP、nestin-GFP及DCX抗体（图6B）。该技术可在...

讨论

新生细胞亚群的定量与鉴定是成体神经发生研究中的核心问题。通过结合增殖标记物和针对成体神经发生特定阶段表达蛋白的抗体，可对这些亚群进行免疫组织化学检测。某些抗体或抗体组合需要特定的染色条件。

使用合成胸腺嘧啶类似物标记分裂细胞仍是研究成年海马神经发生的金标准。在实验开始前，必须考虑合适的注射方案。我们通常以50 mg/kg（体重，腹腔注射）的剂量给予BrdU，但具体浓度可根据实验需求进行调整（单次注射剂量可高达300 mg/kg）^8,16。若需依次注射IdU和CldU以实现细胞群体的时间分辨，则必须使用等摩尔浓度（例如，42.5 mg/kg CldU 和 57.5 mg/kg IdU）。需要注意的是，胸腺嘧啶类似物可能对分裂细胞具有毒性，还可能标记正在进行DNA合成的受损细胞¹⁶。另一个缺点是，胸腺嘧啶类似物的免疫组织化学检测需要进行DNA变性处理，这可能会干扰抗体的抗原性或其他DNA标记技术（例如，DAPI、Hoechst 33258）。检测内源性增殖标志物（如Ki67）的免疫组织化学方法可能是一种合适...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胸苷类似物给药
5-溴-2′-脱氧尿苷，BrdU	Sigma-Aldrich	B9285	有毒（致突变性，致畸性）
5-氯-2′-脱氧尿苷，CldU	Sigma-Aldrich	C6891	有毒（致突变性，致畸性）
5-氯-2′-脱氧尿苷，CldU	MP Biomedicals	2105478	有毒（致突变性，致畸性）
5-碘-2′-脱氧尿苷，IdU	MP Biomedicals	2100357	有毒（致突变性，致畸性）
组织制备
异氟烷-Actavis	Piramal Healthcare	700211
多聚甲醛粉末（PFA）	Riedel-De Häen	16005	有毒，易燃
灌注泵 PD5206	Heidolph Instruments	523-52060-00
Masterflex Tygon 实验室管路，Ø 0.8 mm	Thermo Fischer Scientific	06409-13
饲喂针头，直型，21 G，1.75 mm 橄榄尖，40 mm	Agnthos	1036
冷冻切片机 Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
24孔细胞培养板	Greiner Bio-One	662160
免疫组织化学
Tefal vitacuisine 蒸汽炉	Tefal	VS 4001
Netwell 24 mm 聚酯网膜插件	Corning	3479	预装于6孔培养板中
Netwell 15 mm 聚酯网膜插件	Corning	3477	预装于12孔培养板中
Netwell 塑料6孔支架套件	Corning	3521	用于24 mm 聚酯网膜插件
Netwell 塑料12孔支架套件	Corning	3520	用于15 mm 聚酯网膜插件
Vectastain Elite ABC 试剂盒	Vector Laboratories	PK-6100
DAB（3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物）	Sigma-Aldrich	D-5637	致癌性，光敏感
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
一抗
兔 IgG1 α-Ki67	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100；需抗原修复
兔 α-GFAP，AS-3-GF	Synaptic Systems	173 002	1:500
山羊 IgG (H+L) α-GFP	Acris Antibodies	R1091P	1:300
小鼠 IgG1 α-巢蛋白（nestin）	Abcam	ab6142	1:200；需抗原修复
豚鼠 IgG (H+L) α-双皮质素（Doublecortin）	Merck Millipore	AB2253	1:500
大鼠 IgG2a α-BrdU（腹水）	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	用于BrdU检测；DAB 1:500/IF 1:400
大鼠 IgG2a α-BrdU（纯化）	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	用于CldU检测；DAB 1:500/IF 1:250-400
小鼠 IgG1 α-NeuN	Merck Millipore	MAB377	1:500
小鼠 IgG1κ α-BrdU	BD Biosciences	347580	用于IdU检测；DAB 1:500/IF 1:350
二抗
驴 α-豚鼠 IgG (H+L)-生物素	Dianova	711-065-152	1:500
驴 α-大鼠 IgG (H+L)-生物素	Dianova	712-065-150	1:500
驴 α-小鼠 IgG (H+L)-生物素	Dianova	715-065-151	1:500
山羊 α-大鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	1:250
驴 α-山羊 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11055	1:250
驴 α-小鼠 IgG (H+L)-FITC，Fab片段	Dianova	715-097-003	1:100
驴 α-小鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	1:250
驴 α-豚鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	706-605-148	1:250
驴 α-大鼠 IgG (H+L)-罗丹明红-X	Dianova	712-295-150	1:250
驴 α-兔 IgG (H+L)-罗丹明红-X	Dianova	711-295-152	1:250
驴 α-豚鼠 IgG (H+L)-罗丹明红-X	Dianova	706-296-148	1:250
链霉亲和素-罗丹明红-X	Dianova	016-290-084	1:500
山羊 α-兔 IgG (H+L)-AMCA	Dianova	111-155-144	1:250，仅适用于兔 α-GFAP
Hoechst 33342	Molecular Probes	H3570	1:1000
DAPI	Molecular Probes	D1306	1:1000
封闭
Fab片段 驴 α-小鼠 IgG (H+L)	Dianova	715-007-003	1:20
Fab片段 驴 α-兔 IgG (H+L)	Dianova	711-007-003	1:20
正常驴血清	Merck Millipore	S30
正常兔血清	Dianova	011-000-010
正常山羊血清	Dianova	005-000-001
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906
组织学
焦油紫（Cresyl violet）	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Clear	Merck Millipore	109843	无毒二甲苯替代品
Neo-Mount	Merck Millipore	109016	永久封片剂
显微镜
Axioskop 2	Carl Zeiss Microscopy
LSM 710	Carl Zeiss Microscopy