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方法文章

使用同源物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生

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DOI：

10.3791/52551

⸱

2015年4月22日

 ,  ,  , 
1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本视频文章展示了一种全面的实验方案，可在同一组织切片中检测并定量成年海马神经发生的各个阶段。我们改进了一种方法，以克服在无法获得来自不同宿主物种的合适抗体时，间接多重免疫荧光技术所存在的局限性。

摘要

成年神经发生是一个受到高度调控的多阶段过程，新的神经元由激活的神经干细胞通过一系列逐步定向分化的中间前体细胞亚型产生。这些前体细胞亚型各自表达一组特定的分子标记物，并结合特定的形态学标准，可用于其识别与鉴定。通常采用免疫荧光技术，结合亚型特异性抗体以及外源性或内源性增殖标记物进行检测。本文描述了用于检测和定量成年海马神经发生各阶段的免疫标记方法，包括胸腺嘧啶类似物的应用、经心脏灌注、组织处理、热诱导表位修复、ABC免疫组织化学、多重间接免疫荧光、共聚焦显微镜观察以及细胞定量分析。此外，我们还介绍了 一种连续多重免疫荧光染色方案，可避免因使用同一宿主物种来源的一抗而通常引发的问题。该方法能够在单个切片中同时精确定位所有海马区前体细胞亚型及增殖标志物。这些技术为并行研究不同前体细胞亚型的调控机制、其在脑部病理过程中的参与以及其在特定脑功能中的作用提供了强有力的工具。

引言

大脑中有两个区域在整个生命过程中持续产生新的神经元，分别是侧脑室的室下区和海马齿状回（DG）的颗粒下区（SGZ）。新生神经元起源于神经前体细胞，并经历多个形态学和生理学发育阶段后最终成熟1,2。从缓慢分裂的放射状胶质样干细胞（1型）开始，依次产生一系列过渡性扩增的中间前体细胞。其中更未分化的亚型（2a型和2b型）形态不规则，具有较短的切向突起。这些细胞进一步生成神经母细胞（3型），后者逐渐退出细胞周期，转变为未成熟神经元（树突伸向分子层），最终作为成熟的颗粒细胞整合入海马神经网络。由于这些细胞具有特殊的生理特性，可为神经回路提供更强的可塑性3，提示其在海马功能中具有独特作用。事实上，过去十年的研究已积累大量证据表明，成年期神经发生参与空间记忆、模式分离以及情绪行为的调控4,5。

成年神经发生可通过多种方法进行研究。胸苷类似物可在细胞周期S期掺入DNA，从而实现新生细胞的出生时间标记、定量分析及命运追踪6-8。依次使用不同的胸苷类似物（例如，CldU、EdU或IdU）可用于研究细胞更替或在实验过程中不同时间点出生的细胞群体9。另一种内源性细胞增殖标记物是Ki67，它在细胞周期的所有分裂阶段（G1、S、G2、M）均有表达，但在静止期（G0）及G1早期除外 10,11。为了分析成年齿状回中新生细胞群体的表型，可使用多种阶段特异性分子标记物，如GFAP、nestin、DCX和NeuN1,6。GFAP是成熟星形胶质细胞的标记物，但在成年前脑中的放射状胶质样细胞中也有表达；nestin是一种特异性表达于放射状胶质样细胞和早期中间前体细胞的中间丝蛋白；DCX是一种微管相关蛋白，表达于中间前体细胞、成神经细胞及未成熟神经元中。根据上述三种标记物的共表达情况以及标记细胞的形态特征，可识别出四种不同的前体细胞亚型：1型（GFAP+、nestin+、DCX-）、2a型（GFAP-、nestin+、DCX-）、2b型（GFAP-、nestin+、DCX+）和3型（GFAP-、nestin-、DCX+）1。将DCX与表达于有丝分裂后神经元的NeuN进行共标记，可区分未成熟（DCX+、NeuN+）和成熟（DCX-、NeuN+）颗粒细胞神经元。

上述标记物常用于免疫荧光共标记，随后通过共聚焦显微镜分析新生细胞的数量和类型。该过程通常需要使用来自不同宿主物种的抗体，以避免抗体之间发生非特异性交叉反应。然而，大多数适用于神经发生研究的初级抗体均由兔或鼠制备例如， 小鼠 α-BrdU、小鼠 α-NeuN、兔 α-Ki67、兔 α-GFAP）。这严重限制了在单一切片中可检测的抗原数量及其组合方式。进而不仅因需进行多次染色而增加染色工作量，还可能影响结果的可靠性。此外，某些抗原易受甲醛固定引起的表位遮蔽影响例如， Ki67、nestin）。本文描述了对经典单重和多重免疫标记方案的改进方法（例如， 表位修复，多重连续免疫染色，使用巢蛋白-GFP转基因小鼠12) 可以克服上述诸多问题。特别是，多重免疫荧光染色的顺序标记方案允许对多达四种不同抗原进行染色，即使部分抗体来源于同一宿主。该方法能够在同一组织切片中同时检测 I 型、IIa 型、IIb 型和 III 型前体细胞及其增殖活性。

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方案

注意：所有涉及活体动物的操作均依照欧盟指令86/609/EEC关于实验动物护理与使用的指南进行，并经当地伦理委员会（Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz）批准。

1. 胸腺嘧啶类似物的腹腔注射

  1. 在注射前一天称量动物体重。根据次日计划进行的所有注射，计算所需的胸苷类似物总量，并计算每只动物按体重调整后的注射体积（使用10 mg/ml的储备液）。
  2. 配制10 mg/ml的胸苷储备液。（注意！ 胸苷类似物具有毒性。请遵循供应商提供的具体材料安全数据表（MSDS）要求，即 穿戴实验服和手套，在化学通风橱中操作）。
    1. 从冷冻保存条件下取出胸苷类似物，恢复至室温（约21 °C）。称取10 mg，加入无菌生理盐水（用于BrdU和CldU）或含0.04 N NaOH的无菌生理盐水（用于IdU），涡旋混匀。置于50 °C水浴中至少10 - 15分钟，每2 - 3分钟涡旋一次，以充分溶解粉末。
      注意：溶液在室温下可使用不超过24小时，在-20 °C下可保存数周。需避光保存（用铝箔包裹）。每次使用前应检查是否有沉淀，必要时重新溶解。
  3. 抓住小鼠颈背部皮肤固定，使用带有30 G针头的精密注射器，在室温下经腹腔注射适当体积的储备液（根据体重调整剂量）。
    注意：若需在同一动物中依次给予CldU和IdU，建议注射等摩尔浓度（例如，42.5 mg/kg CldU 和 57.5 mg/kg IdU，相当于50 mg/kg BrdU）。因此，应相应调整10 mg/ml储备液的注射体积。

2. 组织制备

  1. 在灌注前一天配制4%多聚甲醛（溶于0.1 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液中），4 °C保存。
  2. 对深度麻醉的小鼠（3.5%异氟烷）经左心室进行心脏灌注，先用10 ml冰冻PBS灌注，随后用40 ml冰冻多聚甲醛（流速5 ml/min）灌注。取出脑组织，并在相同固定液中后固定24小时（4°C）。
  3. 将脑组织依次转移至10%蔗糖溶液（4°C下24小时）和30%蔗糖溶液（直至脑组织沉底，约48小时）。冷冻时，将经抗冻保护处理的脑组织缓慢浸入-25 °C的异戊烷中，直至组织不再产生气泡。于-80 °C保存。
  4. 使用冷冻切片机对脑组织进行冠状面切片，厚度为40 µm（切片机块温度为-25至-16 °C）。将切片按顺序转移至24孔细胞培养板的抗冻液各孔中（见图1）。于-20 °C保存。

96-well plate layout, liquid handling pattern in laboratory experiment, diagram illustrating method.
图1. 将切片机切片转移至24孔板的示意图。 从A1开始，将后续切片依次放入A行；到达A6后，移至下一行B，依此类推。到达D6后，返回A1并继续。此种切片排列方式可实现对每一个n的定量分析th 全脑切片。为定量新生细胞，取每6个th 脑切片（相当于一列的内容），用于免疫荧光表型分析时每隔12取一th 部分（相当于一列中两个交替行的内容）。

3. 免疫染色

注意：切片通常在配备载体板和网状插件的6孔板中以游离方式孵育。作为例外，封闭、抗体孵育和ABC反应步骤在无网状插件的12孔或24孔板中进行（每孔0.5至1 mL即可，具体体积取决于需染色的切片数量）。在这些步骤中，使用细毛刷转移切片（每次更换新溶液时需冲洗毛刷）。所有孵育步骤均需持续震荡（最高不超过150 rpm）。

  1. 免疫组织化学（ABC法）
    1. 将切片从抗冻剂转移至TBS中，并彻底漂洗（4 °C下过夜一次，室温下每次10分钟，共5次），以完全去除抗冻剂。
    2. 在含1.5% H2O2的TBS-T中孵育30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。注意观察气泡产生情况，必要时重新将切片浸入溶液中。用TBS漂洗3次，每次15分钟。
    3. 可选：同时将加热柜和2 N HCl预热至37 °C。将切片在2 N HCl中37 °C孵育30分钟以变性DNA。借助毛刷轻轻分离切片。
    4. 可选：在0.1 M硼酸缓冲液（pH 8.5）中室温孵育10分钟以中和切片。转移时，将承载切片的网状插入物在纸巾上短暂轻拭，以去除残留的HCl。用TBS漂洗2次，每次15分钟。
    5. 在TBSplus中孵育，以通透组织并阻断非特异性抗体结合位点，室温下1小时。
    6. 将切片在用TBSplus稀释的一抗中孵育，4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次15分钟。
    7. 将切片在用TBSplus稀释的生物素化二抗中孵育，室温下3小时。用TBS漂洗3次，每次15分钟。同时……
    8. 根据制造商说明书配制ABC复合物（1% A + 1% B溶于TBS-T）。室温静置30分钟后使用。将切片在AB试剂中孵育1小时，室温。用TBS漂洗3次，每次15分钟。
    9. 每6孔或12孔板准备50 ml含0.5 mg/ml DAB的TBS-T溶液，均分为两份，分别向每孔加入4 ml或2 ml。将切片转移至DAB溶液中（注意！ DAB具有毒性。请遵循供应商提供的具体MSDS要求，即穿戴实验服和手套，在通风橱中操作）。
    10. 向剩余的25 ml DAB溶液中加入0.5 ml 1% H2O2，混匀后按上述体积分别加入各孔，以启动过氧化物酶反应。孵育12分钟。用TBS漂洗3次，每次15分钟。
    11. 将切片用明胶封固于载玻片上，室温过夜干燥。用永久性封片剂加盖盖玻片。
    12. 可选：在加盖盖玻片前进行复染（见第3.5节）。
      注：若因背景过高导致信噪比较低，可在AB试剂孵育后（步骤3.1.8）重复H2O2处理。
  2. 多重免疫荧光染色
    1. 单重或同时多重免疫荧光染色
      1. 将切片从抗冻剂转移至TBS中，并彻底漂洗（4 °C下过夜一次，室温下每次10分钟，共5次），以完全去除抗冻剂。
      2. 可选：参照步骤3.1.3–3.1.4。
      3. 在TBSplus中孵育，以通透组织并阻断非特异性抗体结合位点，室温下1小时。
      4. 将切片在用TBSplus稀释的一抗混合液（例如，大鼠抗BrdU、豚鼠抗DCX、山羊抗GFP）中孵育，4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次15分钟。
      5. 将切片在用TBSplus稀释的荧光染料标记的二抗混合液（例如，罗丹明红标记的驴抗大鼠、Alexa-647标记的驴抗豚鼠、Alexa-488标记的驴抗山羊；均来源于驴）中孵育，室温3小时或4 °C过夜。此后需避光操作。用TBS漂洗3次，每次15分钟。
      6. 将切片用明胶封固于载玻片上，室温过夜干燥。用水溶性封片剂加盖盖玻片。
    2. 使用同一种属来源一抗的顺序多重免疫荧光染色
      1. 参照步骤3.2.1.1–3.2.1.3。
      2. 将切片在第一种一抗（例如，兔抗抗原A）中孵育，4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。
      3. 将切片在第一种荧光染料标记的二抗（例如，罗丹明红标记的驴抗兔）中孵育，室温3小时。此后需避光操作。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。
      4. 用与一抗同源的正常血清（例如，兔血清）在TBSplus中孵育3小时，室温，以饱和第一种二抗上未结合的抗原结合位点。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。
      5. 在含50 µg/ml未标记单价Fab片段（针对一抗宿主来源，例如抗兔IgG (H+L)）的TBSplus中孵育，4 °C过夜，以封闭可能被第二种二抗识别的表位。
      6. 至少用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。转移时，将承载切片的网状插入物在纸巾上短暂轻拭，以去除任何残留的Fab片段。
      7. 将切片在第二种一抗（例如，兔抗抗原B）中孵育，4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。
      8. 将切片在第二种荧光染料标记的二抗（例如，Alexa-488标记的驴抗兔）中孵育，室温3小时。用TBS漂洗3次，每次15分钟，然后按上述方法封片并加盖盖玻片。
        注：若需使用不同宿主来源的抗体标记多个抗原，可将其加入步骤3.2.2.2，相应二抗加入步骤3.2.2.3。
    3. 其中一种二抗与某一种一抗同种属
      注：本方案适用于对BrdU或Ki67与GFAP、nestin-GFP及DCX进行四重染色。
      1. 严格遵循步骤3.2.1.1–3.2.1.5。在此阶段前仅使用驴血清配制TBSplus。
      2. 在含3%山羊血清的TBSplus中孵育1小时，室温，以封闭α-山羊二抗上未结合的抗原结合位点。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。
      3. 将切片在用TBSplus稀释的AMCA标记的山羊抗兔抗体中孵育，室温3小时或4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次15分钟，然后按上述方法封片并加盖盖玻片。
    4. CldU与IdU共染
      1. 按照第3.2.1节（步骤3.2.1.1–3.2.1.2）所述方法漂洗、变性和中和切片。
      2. 在含20 µg/ml未标记Fab片段（抗小鼠IgG (H+L)）的TBSplus中孵育1小时，室温。用TBS漂洗4次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。
      3. 将切片在含大鼠抗BrdU（1:400；纯化IgG2）和小鼠抗BrdU（1:350）的一抗混合液中孵育，4 °C过夜。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。
      4. 将切片在含生物素化驴抗大鼠（1:500）和FITC标记的驴抗小鼠Fab片段（1:100）的二抗混合液中孵育。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟。
      5. 将切片在罗丹明红标记的链霉亲和素中孵育，室温2小时。用TBS漂洗3次，每次15分钟，然后按上述方法封片并加盖盖玻片。
    5. nestin-GFP小鼠中荧光信号的放大
      1. 在原始一抗混合液中加入山羊抗GFP抗体。
      2. 在二抗混合液中加入一种光谱特性与GFP相似的荧光染料标记的二抗（如Alexa 488标记的驴抗山羊）。
  3. 抗原修复
    1. 在漂洗去除抗冻剂后进行抗原修复。将含0.1 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）的6孔或12孔板置于蒸锅中预热至95–99 °C（约25分钟）。
    2. 将切片转移至热柠檬酸缓冲液中，蒸汽加热30分钟（用铝箔覆盖孔板，因塑料盖不耐高温）。
    3. 立即放入冰浴中冷却。此步骤有助于保护组织形态，尤其在处理出生后动物脑切片时尤为重要。
    4. 用TBS漂洗3次，每次10分钟，以去除并中和柠檬酸，随后继续染色步骤。
  4. 在小鼠组织上使用小鼠来源抗体
    1. 在第一次封闭步骤中（例如，步骤3.1.5或3.2.1.3）加入20 µg/ml单价Fab片段（抗小鼠IgG (H+L)，与二抗宿主相同）。
    2. 用TBS漂洗4次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗一次，10分钟，然后继续相应染色流程。
  5. 焦油紫复染
    1. 将焦油紫溶液预热至60 °C（置于玻璃瓶中）。将载玻片在热溶液中孵育3分钟。
    2. 在去离子水中漂洗，然后依次在70%、96%和100%异丙醇中各脱水2次，每次1分钟。
    3. 在二甲苯或二甲苯替代剂中透明5–6分钟，并用相容的永久性封片剂加盖盖玻片。

4. 数据分析

  1. 计数每6个经过过氧化物酶染色的新生细胞th 沿齿状回全长进行矢状切片。在400倍显微镜下使用光学显微镜观察。
  2. 将所得细胞数量乘以间隔区间，以估算新生细胞的总数。
  3. 使用配备适当激光器和滤光系统的共聚焦激光显微镜对荧光标记的切片进行成像。在齿状回全长范围内随机选取位置，以400倍放大倍数采集图像序列，并对每侧半球至少50个随机选取的兴趣细胞进行分析，以检测与其他标记物的共标记情况。
  4. 将共标记细胞的百分比（%/100）乘以新生细胞的总数，以计算特定新生细胞群体的绝对数量。

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结果

我们采用上述方法对出生后及成年海马体中的新生细胞进行定量与表征。因此，我们使用了野生型以及神经发生缺陷型的细胞周期蛋白D2基因敲除（Ccnd2KO) 小鼠，饲养条件已知会影响神经发生速率（即， 富集环境（enriched environment, EE）13,14. 针对Ki67、BrdU、CldU或IdU的免疫组织化学DAB染色 consistently 显示了野生型与突变型之间新生细胞数量的差异 Ccnd2KO小鼠（图3)15此外，通过连续等摩尔浓度的CldU和IdU注射，我们能够区分在特定环境富集（EE）时期内生成的细胞群体图3C,D）。采用3.2.4节的方法，我们能够成功检测到在同时给予CldU和IdU后，两者信号强度相等且具有优异的重叠性。图4）。通过同时使用 BrdU 和 NeuN，可采用标准免疫荧光方法对 BrdU 标记的新生细胞进行表型鉴定（图5）或 BrdU、GFAP、nestin-GFP...

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讨论

新生细胞亚群的定量与鉴定是成体神经发生研究中的核心问题。通过结合增殖标记物和针对成体神经发生特定阶段表达蛋白的抗体，可对这些亚群进行免疫组织化学检测。某些抗体或抗体组合需要特定的染色条件。

使用合成胸腺嘧啶类似物标记分裂细胞仍是研究成年海马神经发生的金标准。在实验开始前，必须考虑合适的注射方案。我们通常以50 mg/kg（体重，腹腔注射）的剂量给予BrdU，但具体浓度可根据实验需求进行调整（单次注射剂量可高达300 mg/kg）8,16。若需依次注射IdU和CldU以实现细胞群体的时间分辨，则必须使用等摩尔浓度（例如，42.5 mg/kg CldU 和 57.5 mg/kg IdU）。需要注意的是，胸腺嘧啶类似物可能对分裂细胞具有毒性，还可能标记正在进行DNA合成的受损细胞16。另一个缺点是，胸腺嘧啶类似物的免疫组织化学检测需要进行DNA变性处理，这可能会干扰抗体的抗原性或其他DNA标记技术（例如，DAPI、Hoechst 33258）。检测内源性增殖标志物（如Ki67）的免疫组织化学方法可能是一种合适...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢 S. Tausch 提供出色的技术支持。本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF，Bernstein Focus 01GQ0923）和德国研究基金会（DFG，FOR1738）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胸苷类似物给药
5-溴-2′-脱氧尿苷，BrdUSigma-AldrichB9285有毒（致突变性，致畸性）
5-氯-2′-脱氧尿苷，CldUSigma-AldrichC6891有毒（致突变性，致畸性）
5-氯-2′-脱氧尿苷，CldUMP Biomedicals2105478有毒（致突变性，致畸性）
5-碘-2′-脱氧尿苷，IdUMP Biomedicals2100357有毒（致突变性，致畸性）
组织制备
异氟烷-ActavisPiramal Healthcare700211
多聚甲醛粉末（PFA）Riedel-De Häen16005有毒，易燃
灌注泵 PD5206Heidolph Instruments523-52060-00
Masterflex Tygon 实验室管路，Ø 0.8 mmThermo Fischer Scientific06409-13
饲喂针头，直型，21 G，1.75 mm 橄榄尖，40 mmAgnthos1036
冷冻切片机 Microm HM 400Thermo Fischer Scientific
24孔细胞培养板Greiner Bio-One662160
免疫组织化学
Tefal vitacuisine 蒸汽炉TefalVS 4001
Netwell 24 mm 聚酯网膜插件Corning3479预装于6孔培养板中
Netwell 15 mm 聚酯网膜插件Corning3477预装于12孔培养板中
Netwell 塑料6孔支架套件Corning3521用于24 mm 聚酯网膜插件
Netwell 塑料12孔支架套件Corning3520用于15 mm 聚酯网膜插件
Vectastain Elite ABC 试剂盒Vector LaboratoriesPK-6100
DAB（3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物）Sigma-AldrichD-5637致癌性，光敏感
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
一抗
兔 IgG1 α-Ki67Novocastra/ Leica BiosystemsNCL-L-Ki67MM1DAB 1:400/IF 1:100；需抗原修复
兔 α-GFAP，AS-3-GFSynaptic Systems173 0021:500
山羊 IgG (H+L) α-GFPAcris AntibodiesR1091P1:300
小鼠 IgG1 α-巢蛋白（nestin）Abcamab61421:200；需抗原修复
豚鼠 IgG (H+L) α-双皮质素（Doublecortin）Merck MilliporeAB22531:500
大鼠 IgG2a α-BrdU（腹水）AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030CX用于BrdU检测；DAB 1:500/IF 1:400
大鼠 IgG2a α-BrdU（纯化）AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030  用于CldU检测；DAB 1:500/IF 1:250-400
小鼠 IgG1 α-NeuNMerck MilliporeMAB3771:500
小鼠 IgG1κ α-BrdUBD Biosciences347580用于IdU检测；DAB 1:500/IF 1:350
二抗
驴 α-豚鼠 IgG (H+L)-生物素Dianova711-065-1521:500
驴 α-大鼠 IgG (H+L)-生物素Dianova712-065-1501:500
驴 α-小鼠 IgG (H+L)-生物素Dianova715-065-1511:500
山羊 α-大鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Molecular ProbesA110061:250
驴 α-山羊 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Molecular ProbesA110551:250
驴 α-小鼠 IgG (H+L)-FITC，Fab片段Dianova715-097-0031:100
驴 α-小鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova715-605-1511:250
驴 α-豚鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova706-605-1481:250
驴 α-大鼠 IgG (H+L)-罗丹明红-XDianova712-295-1501:250
驴 α-兔 IgG (H+L)-罗丹明红-XDianova711-295-1521:250
驴 α-豚鼠 IgG (H+L)-罗丹明红-XDianova706-296-1481:250
链霉亲和素-罗丹明红-XDianova016-290-0841:500
山羊 α-兔 IgG (H+L)-AMCADianova111-155-1441:250，仅适用于兔 α-GFAP
Hoechst 33342Molecular ProbesH35701:1000
DAPIMolecular ProbesD13061:1000
封闭
Fab片段 驴 α-小鼠 IgG (H+L)Dianova715-007-0031:20
Fab片段 驴 α-兔 IgG (H+L)Dianova711-007-0031:20
正常驴血清Merck MilliporeS30
正常兔血清Dianova011-000-010
正常山羊血清Dianova005-000-001
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906
组织学
焦油紫（Cresyl violet）Sigma-AldrichC5042
Neo-ClearMerck Millipore109843无毒二甲苯替代品
Neo-MountMerck Millipore109016永久封片剂
显微镜
Axioskop 2Carl Zeiss Microscopy
LSM 710Carl Zeiss Microscopy

参考文献

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
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