利用摇蚊科（双翅目）水面漂浮的蛹壳作为水体快速生物评价的方案

摘要

利用底栖大型无脊椎动物进行快速生物评价的方案常用于监测和评估水质。一种高效的方案涉及摇蚊科水面漂浮蛹壳（SFPE）的采集。本文描述了摇蚊科SFPE的野外采集、实验室处理、玻片制备及鉴定技术。

摘要

利用底栖大型无脊椎动物群落进行快速生物评价的方案已成功用于评估人类活动对水质的影响。然而，传统的底栖幼虫采样方法（如舀网法）可能耗时且成本较高。一种替代方案是收集摇蚊科水面漂浮的蛹壳（SFPE）。摇蚊科是双翅目中一个物种丰富的科，其幼虫阶段通常生活在水生环境中。成虫摇蚊从水中羽化后，会将蛹壳留在水面漂浮。由于风力或水流的作用，这些蛹壳常沿河岸或障碍物后方聚集，便于采集以评估摇蚊类的多样性和丰富度。摇蚊可作为重要的生物指示物种，因为不同物种对污染的耐受性存在差异。因此，所采集SFPE中各类群的相对丰度和物种组成能够反映水质的变化。本文详细描述了摇蚊科SFPE在野外采集、实验室处理、玻片制备及鉴定方面的相关方法。SFPE方法的优点包括对采样区域干扰极小、样品采集和实验室处理高效经济、易于鉴定、几乎适用于所有水生环境，并可能更灵敏地反映生态系统所受的胁迫。其局限性在于无法确定幼虫的微生境利用情况，且若蛹壳未与成年雄虫建立关联，则难以鉴定到物种水平。

引言

生物监测项目通过使用生物体来评估环境健康状况，常被用于评价水质或监测生态系统恢复项目的成效。自1989年以来，利用底栖大型无脊椎动物群落进行的快速生物评估方案（RBP）在各州水资源管理机构中广受欢迎¹。传统采集底栖大型无脊椎动物以用于RBP的方法，如网捞法、苏伯采样器（Surber sampler）和赫斯采样器（Hess sampler）²，可能耗时较长、成本较高，且仅能反映特定微生境中的群落特征³。一种高效且可替代的RBP方法是收集摇蚊科（Chironomidae）的水面漂浮蛹壳（SFPE），以获取特定水体的生物学信息³。

摇蚊科（Chironomidae）（昆虫纲：双翅目），通常被称为非吸血性摇蚊，是一类完全变态的昆虫，通常在水生环境中发育，随后在水面羽化为成虫 。摇蚊科物种丰富，全球已描述约5,000种，但估计实际存在的物种可能多达20,000种⁴。由于其高度的多样性以及对污染耐受性的差异，摇蚊常被用于记录多种水生生态系统的水质与生境状况⁵。此外，在水生系统中，摇蚊通常是数量最多、分布最广的底栖大型无脊椎动物，通常占群落中物种数的50%或以上^5,6。陆生成虫羽化后，其蛹壳（蜕下的蛹皮）会残留在水面上（图1）。由于风力或水流的作用，蛹壳会聚集在岸边或障碍物后方，可被快速、便捷地采集，从而获得过去24–48小时内羽化的摇蚊物种的全面样本⁷。

所采集的摇蚊蛹皮（SFPE）的相对丰度和分类组成反映了水质状况，因为某些物种对污染具有很强的耐受性，而另一些则非常敏感⁵。与传统的摇蚊幼虫采样技术相比，SFPE 方法具有多项优势，包括：（1）采样区域的生境干扰极小，甚至没有干扰；（2）样本采集不针对活体生物，而是非生命的蜕皮，因此不会影响群落动态的变化轨迹；（3）在具备适当检索表和描述的情况下，鉴定到属级甚至种级相对容易³；（4）与传统采样方法相比，样本的采集、处理和鉴定更为高效且经济^3,8,9；（5）积累的蜕皮代表了来自多种微生境的分类单元¹⁰；（6）该方法几乎适用于所有水生环境，包括溪流和河流、河口、湖泊、池塘、岩池以及湿地；（7）SFPE 可能是生态系统健康状况更敏感的指示指标，因为它们代表了已完成所有未成熟阶段并成功羽化为 成虫的个体¹¹。

SFPE 方法并非收集摇蚊群落信息的新方法，Thienemann 最早提出了使用 SFPE 的建议。¹² 20世纪初。已有多种研究采用SFPE进行分类学调查（例如， ^13-15），生物多样性与生态学研究（例如 ^7,16-19）以及生物学评估（例如，^20-22）。此外，一些研究探讨了样本设计、样本量以及为达到不同物种或属的检测水平所需的样本事件数量等方面的问题。例如，^8,9,23）。这些研究表明，通过中等程度的努力或样品处理成本，即可检测到较高比例的物种或属。例如，Anderson 和 Ferrington⁸ 根据100个计数的子样本确定，  1/3^rd 所需时间更短 与网捞样本相比，选择SFPE样本更具优势。另一项研究确定，每采集一个网捞样本，可筛选和鉴定出3-4个SFPE样本，且随着物种丰富度的增加，SFPE样本在物种检测效率上高于网捞样本。³例如，在物种丰富度为15-16种的样地，平均拖网采集效率为45.7%，而SFPE样品的采集效率为97.8%³.

重要的是，SFPE 方法已在欧盟实现标准化²⁴ （称为摇蚊蛹皮技术（CPET））和北美²⁵ 用于生态评估，但该方法尚未被详细描述。Ferrington 曾描述过 SFPE 方法的一个应用实例。 等³；然而，该研究的主要重点是评估SFPE方法的效率、功效和经济性。本工作的目的是详细描述SFPE方法的全部步骤，包括样品采集、实验室处理、玻片制备和属水平鉴定。目标读者包括研究生、研究人员以及有意将传统的水质监测工作拓展到其研究中的专业人员。

方案

1. 野外采集用品的准备

1. 根据研究设计确定应采集的SFPE样本数量，并获取一个样本瓶（例如， 每个样品 60 ml。
2. 为每个样本瓶准备两张日期和地点标签，一张放在瓶内，另一张贴在瓶外。确保每张日期和地点标签均包含以下信息：  国家、州、县、城市、水体、GPS坐标、采样日期及采样人员姓名。
3. 收集其他特定材料和设备（见特定材料/设备列表）。

2. 野外采集

1. 一手持幼虫托盘，另一手持筛网。将幼虫托盘浸入 SFPE 聚集的水中例如， 泡沫堆积物、障碍物、挺水植物、碎屑、回流涡流以及河岸边缘图2A），让水、蜕皮和碎屑进入幼虫托盘，并将这些物质倒入筛子中过滤。若在流水生态系统中采样，应从采样河段的下游端开始，向上游方向进行（图2B）。若在静水系统中采样，应从下风向的岸边开始。 
   1. 重复步骤2.1，持续10分钟（或根据特定采样方案的其他规定时间） 在每个预设的样本次数范围内（通常对于从溪流中采集的样本为100–200米，但取决于水生监测站点的整体面积）；根据实际情况在SFPE聚集区域之间移动。
2. 使用装有采样点水样的洗瓶将筛网上的碎屑集中到一个区域，借助镊子和洗瓶中的乙醇流，小心地将SFPE样品转移至预先标记的样品瓶中。用乙醇充满样品瓶。
3. 对所有样品重复步骤 2.1 至 2.2。

3. 样品挑选

注意：本方案其余部分适用于300个SFPE的子样本，若用于其他子样本量可能需要进行调整。有关根据具体研究目标和资源定制SFPE方法的子采样和采样频率指南，请参见Bouchard和Ferrington的⁹。

1. 为每个SFPE样品分配一个1 dram的小瓶；准备日期和  将产地标签放入每个小瓶内，并填充小瓶 ¾ 用乙醇充满。
2. 打开相应的样本罐盖子，检查是否有附着的蛹壳。使用装有乙醇的洗瓶，轻轻将盖子上的内容物冲洗至培养皿中。用镊子从样本罐内取出标签，并轻轻将标签上的内容物冲洗到培养皿中，随后将标签放置一旁。
3. 将样品罐中的内容物转移至 幼虫托盘，用乙醇冲洗以确保样本瓶中无SFPE残留。将托盘中的部分蛹壳、残渣及乙醇转移至培养皿中，确保样本完全浸没在乙醇中。 
4. 将培养皿置于体视显微镜下，系统性地检查培养皿内是否存在蛹壳。使用镊子将所有蛹壳从培养皿中拾取并放入小瓶中。不要拾取破损的标本即， 不要采集头胸部和腹部不足一半、已干燥或被压扁的标本，以免后续难以鉴定。
   注意：鉴定到物种通常需要 整个标本完整存在，尽管 在某些情况下， 对于不完整的标本，可能仍可进行属级鉴定。
   1. 轻轻搅动培养皿，仔细检查是否有额外的蛹壳，包括可能附着在皿壁上的蛹壳，以及最初可能未被发现的微小且透明的标本。重复检查过程，直至连续两次扫描均未发现新的蛹壳为止。
5. 重复步骤 3.3 和 3.4，直至挑取完全部或共计 300 个蛹壳。 当挑选出300个蛹壳后，将培养皿中的残留物倒回幼虫托盘，并用乙醇冲洗培养皿。然后，将幼虫托盘中的残留物转移至空的样品瓶中，贴上日期和采集地点标签，并盖上瓶盖。  保留或根据项目特定方案处理残留物。

4. 样品分选

1. 将标记好的小瓶中所有采集到的蛹壳倒入培养皿中，加入足量乙醇，以刚好浸没样本为宜。
2. 在体视显微镜下，将样本按不同形态特征分为若干组即， 形态分类单元）并将每个形态分类单元分别放入 装有3/4液体的带标签小瓶^th 用乙醇充满。
   1. 利用外部形态特征区分摇蚊科形态分类单元。例如，根据头胸部的头结节、额瘤、额刚毛以及胸角在有无、大小、形状和颜色上的差异进行区分；根据腹部各体节的刺、钩列、砂纸状结构、刚毛和距，以及肛叶的特征进行区分 用于形态分类群的分离（图 4A）。参见 Ferrington， 等 ^5,Sæther ^26,Pinder 和 Reiss ²⁷ 有关形态特征的更多描述和图示。
   2. 如果标本开始变干，可使用额外的乙醇。

5. 载玻片封片

1. 为每个形态分类单元在多孔板中填充一孔95%乙醇。
   1. 放置多个表示（例如， 将每个形态分类单元（占总数的25%）分别放入载玻片制片用板的各个孔中。让标本在孔中静置至少10分钟。 脱水 充分地。
2. 用适当的部位、采集和识别信息标记载玻片（图3).
3. 将载玻片置于体视显微镜下。
   注意：将载玻片模板粘贴到载物台上有助于实现一致的定位。
4. 在载玻片上滴加一滴 Euparal；将 Euparal 液滴铺展至与盖玻片大小相近。使用 Euparal 时应确保通风良好。
   注意：使用Euparal时应确保适当通风。
5. 使用镊子将第一个形态分类单元的代表性样本嵌入Euparal中。
   注意：使用镊子轻轻将样本在实验室擦拭纸上轻敲，以去除多余的乙醇  在将其包埋于Euparal之前。
6. 使用精细尖头镊子和/或解剖探针将头胸部与腹部分离（图4A).
   1. 沿蜕皮缝切开头胸部图4B）并打开头胸部，使缝合边缘位于相对的两侧（图4C).
   2. 将头胸部摆放至腹面朝上图4C).
   3. 将腹部背侧朝上，置于头胸部正下方图4C).
7. 将盖玻片置于样本上。手持盖玻片呈一定角度，使其一边缘接触载玻片，然后缓慢放下盖玻片，以减少气泡产生。轻轻按压盖玻片，使样本展平。
8. 重复步骤 5.3 至 5.7，处理所有脱水样本 样本。

6. 属的鉴定

1. 使用复式显微镜观察载玻片上的标本，确定其属级分类。参照 Wiederholm 28 和 Ferrington 提供的检索表与诊断特征，将标本鉴定至属。 等⁵如有需要，可使用Ferrington的方法确认科级分类鉴定。 等⁵.   注意：自Wiederholm以来，已有大量通用描述和修订版本²⁸ 和 Ferrington， 等⁵因此，这些检索表和鉴定方法尚不完整，需结合原始文献进行补充。

结果

图1展示了摇蚊的生命周期；其幼体阶段（卵、幼虫、蛹）通常在水生环境中发生，或与水生环境密切相关。幼虫完成发育后，会构建一个管状庇护所，并通过丝状分泌物将自身附着于周围基质上，随后进行化蛹。当发育中的成虫成熟后，蛹体脱离附着物并游至水面，成虫由此从蛹壳中羽化而出。蛹壳充满空气，且由于体壁外层具有一层蜡质，可使其漂浮于水面，直至细菌开始分解蜡质层。

水流或风会将漂浮的蛹壳聚集到某些堆积区域，例如河岸植被或倒下的树木与水面接触的地方，如图2A所示。可使用幼虫托盘和筛网从这些自然堆积区域收集蛹壳，以评估摇蚊科昆虫在多种微生境中的羽化情况，如图2B所示。对于某些应用而言，以一致且标准化的方式进行采样非常重要，以便在不同采样点之间或同一采样点不同时段之间进行比较。已有研究表明，10分钟的采集时间足以对摇蚊的相对多度进行有效评估^3,25。例如，Ferrington 等³研究了Chironomus riparius物种...

讨论

成功进行SFPE样本采集、挑选、分拣、制片及鉴定的最关键步骤是：（1）在野外采集过程中，确定研究区域内SFPE大量聚集的区域图2A）；（2）缓慢扫描培养皿中的内容以检测所有 样品挑选过程中的SFPE；（3）在载片过程中培养出必要的手工灵巧性，以分离头胸部与腹部图 4A）；以及（4）识别摇蚊蛹壳的关键形态特征 准确鉴定到属。

检测SFPE高积累区域（图2A） 成功采集SFPE样本的最重要步骤。蛹壳可被截留在水生植被或船坡道等人工结构中，而波浪可将漂浮物聚集到近海的“风成条带”中³⁰对于较大的水体，需确定自然聚集区域 可能需要根据风向确定研究地点，或使用船只进入蛹壳聚集的区域。必须采集到足够数量的SFPE样本，以准确检测新出现物种的存在，并高精度估计各物种的相对丰度。在样本分拣过程中，需多次缓慢扫描培养皿，以发现体型较小（体长3-6 mm）、色素较浅的标本。SFPE常附着于藻类、树叶、枝条、种子和花朵上，因此可能在初次扫描时被遗漏。此...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醇	菲舍尔科技	S25309B	70-95%
塑料洗瓶	菲舍尔科技	0340923B
样品瓶	菲舍尔科技	0333510B	建议使用玻璃或塑料材质，60 mL 容量
试验筛	Advantech	120SS12F	125 微米筛孔尺寸
幼虫培养盘	BioQuip	5524	白色
体视显微镜
玻璃小瓶	菲舍尔科技	0333926B	1 dram 规格
塑料滴管	赛默飞世尔科技	1371110	每毫升 30 至 35 滴
精细镊子	BioQuip	4524	#5
培养皿	Carolina	741158	玻璃或塑料材质
多孔板	赛默飞世尔科技	144530	玻璃或塑料材质
玻璃载玻片	赛默飞世尔科技	3010002	3 × 1 英寸
盖玻片	赛默飞世尔科技	12-519-21G	圆形或方形
Euparal 封片介质	BioQuip	6372B
绘图笔	BioQuip	1154F	黑色
探针	BioQuip	4751
Kimwipes 擦镜纸	金佰利专业品牌™	34120