金纳米棒辅助的神经细胞光刺激

摘要

本方案概述了如何利用金纳米棒光学吸收产生的瞬态加热来刺激神经元细胞的分化及细胞内钙活性。这些结果可能为神经假体和神经科学基础研究开辟新的应用前景。

摘要

近期研究表明，通过神经组织中的水分吸收红外光所产生的瞬时加热效应，可以以多种方式刺激神经。由于该技术有望提高刺激的定位精度，并减少与组织的机械接触，因此在替代或补充标准刺激技术方面具有巨大潜力。然而，光学方法受限于可见光难以深入穿透组织。此外，热力学建模表明，当使用多个刺激位点或高激光重复频率时，累积的加热效应可能带来潜在风险。下述方案描述了一种改进的神经细胞红外刺激方法。其基本机制依赖于金纳米棒光学吸收所引发的瞬时加热，这种加热可触发神经细胞分化，并提高细胞内钙离子活性水平。这些结果表明，纳米颗粒吸收剂能够增强甚至替代基于水吸收的红外神经刺激过程，在神经假体和细胞治疗的未来应用中具有广阔前景。

引言

近期研究表明，水吸收红外光（波长>1,400 nm）所产生的瞬时热效应可用于诱导神经组织产生动作电位¹，以及心肌细胞内的胞内钙瞬变²。由于红外光刺激具有潜在的更高空间分辨率、无需与组织直接接触、可最小化刺激伪影，并且无需在刺激前对细胞进行基因改造（而光遗传学则需要），因此在神经假体应用中引起了广泛关注¹。尽管具备上述诸多优势，但近期开发的热模型提示，当使用多个刺激位点和/或高重复频率时，目标组织或细胞可能会受到累积热效应的影响^3,4。

为应对这些挑战，研究人员已认识到可利用外源性吸收剂进行神经刺激，以在组织中产生更局限的热效应。Huang 等 通过使用超顺磁性铁氧体纳米颗粒，在射频磁场作用下远距离激活HEK 293细胞中温度敏感型TRPV1通道，验证了这一原理⁵尽管该技术可能实现更深层的穿透（磁场与组织的相互作用相对较弱），但记录到的响应仅持续数秒，而非仿生装置所需的毫秒级持续时间。⁵同样地，Farah 等 利用黑色微颗粒实现大鼠皮层神经元的电刺激演示 体外。他们利用数百毫秒量级的脉冲持续时间实现了细胞水平的刺激精度 µ范围内的 s 和能量 µJ，可能实现更快的重复频率⁶.

外源性吸收剂的....

方案

1. 金纳米棒的制备

注意：金纳米棒（Au NRs）可通过多种方法合成¹⁶，或从商业供应商处购买。

1. 通过紫外-可见光谱法测量金纳米棒（Au NR）溶液的初始光密度（OD），记录300 nm至1,000 nm波长范围内的吸收值，分辨率设置为0.5–2 nm。根据所用比色皿的规格调整待测溶液的体积。
2. 使用合适的技术评估纳米颗粒的初始摩尔浓度¹⁷ (例如 紫外-可见光谱法、单颗粒电感耦合等离子体质谱法、透射电子显微镜，或使用供应商提供的浓度值。
3. 通过将初始金纳米棒（Au NR）样品稀释至光密度（OD）= 1，配制5 ml的储备溶液。为获得最佳重复性，所有测试样品应保持相同的OD值。稀释溶剂的组成请遵循商业供应商提供的操作说明；若不确定，可使用去离子水。
4. 将1 ml金纳米棒溶液在7,800 × g条件下离心15分钟，重复两次，以去除溶液中多余的化学物质。离心的力和时间可根据情况调整（例如 5,600 × g 离心 20 分钟¹⁸.
5. 移去上清液，并将纳米棒重新悬浮于去离子水中。由于重新悬浮的颗粒在溶液中可能形成聚集体，建议每日新鲜配制以获得最佳效果。 alternatively，可置于冰箱中保存，但不得超过1周。切勿冷冻。
6. 在用于细胞培养条件之前，将金纳米棒溶液超....

结果

通过使用本文所述的方案1、2和3，在激光照射强度为1.25至7.5 W·cm⁻²的条件下，观察到金纳米颗粒（金纳米棒、聚苯乙烯磺酸盐包覆金纳米棒和二氧化硅包覆金纳米棒）对NG108-15神经细胞分化具有促进作用。罗丹明B标记的金纳米棒的共聚焦图像显示，这些颗粒在孵育第1天即被细胞内化¹²。颗粒主要定位于细胞质中，表明其优先通过细胞体膜被摄取¹²。在诱导NG108-15神经细胞分化后检测到的主要形态学变化包括增殖停止、βIII-微管蛋白的表达以及神经突的生长，后者通过最大长度和数量进行分析²²。

在本实验测得的激光辐照度水平（1.25 至 7.5 W·cm⁻²）下，与纳米棒（NRs）共同培养的样品显示出神经突长度增加。对照组样品（未与纳米颗粒共培养但接受相同激光功率照射的细胞）在神经突长度上未表现出显著变化。当使用 7.5 W·cm⁻² 的辐照剂量时，与金纳米棒（Au NRs）共培养的 NG108-15 细胞的最终神经突长度比未接受激光照射的样品长约 3.......

讨论

本演示文稿中概述的方案描述了如何利用外源性吸收剂培养、分化及进行光学刺激神经元细胞。NR特性（例如 尺寸、形状、等离子体共振波长和表面化学性质）以及激光刺激参数（如波长、脉冲长度、重复频率 等等。) 可根据不同的实验需求进行调整。可使用标准的生物学检测方法和材料来监测细胞行为的变化。总体而言，该方法提供了一种简单而高效的方式，用于照射细胞群体 体外 并可扩展至原代细胞、组织样本和 体内 研究。

金纳米棒（Au NRs）用于生物应用所需满足的主要条件是稳定（包括化学和物理稳定性）和生物相容性。其中生物相容性尤为关键，原因是金纳米棒表面通常存在阳离子型表面活性剂（常见为CTAB）。已知CTAB可诱导细胞毒性 体外²⁸ 和 体内²⁹ 并且在合成过程中常用于驱动纳米棒（NR）形状的形成³⁰。通过在金纳米棒表面沉积额外的涂层，通常可提高其稳定性和生物相容性（例如

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Au NR	Sigma Aldrich	716812
NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM	Sigma Aldrich	D6546
FCS	Life Technologies	10100147
L-谷氨酰胺	Sigma Aldrich	G7513
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140122
两性霉素B	Life Technologies	15290018
甲醛	Sigma Aldrich	F8775
吐温X-100	BDH	T8532
BSA	Sigma Aldrich	A2058
抗-βIII-微管蛋白抗体	Promega	G7121
TRITC标记的抗小鼠IgG抗体	Sigma Aldrich	T5393
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
DMSO	Sigma Aldrich	472301
Pluronic F-127	Invitrogen	P6867
紫外-可见分光光度计	Varian Medical Systems Inc.	Cary 50 Bio
小型离心机	Eppendorf	Mini Spin
超声波清洗仪	Unisonics Australia	FPX 10D
细胞培养箱	Kendro	Hera Cell 150
细胞培养用离心机	Hettich	Rotofix 32A
激光二极管	Optotech	780 nm单模光纤耦合LD
光纤	Thorlabs	780 HP
功率计	Coherent	Laser Check
ImageJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
落射荧光显微镜	Axon Instruments	ImageX-press 5000A
μ-载玻片孔板	Ibidi	80826
倒置共聚焦显微镜	Carl Zeiss Microscopy Ltd.	LSM 510 meta-共聚焦显微镜
示波器	Tektronix	TDS210