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方法文章

金纳米棒辅助的神经细胞光刺激

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DOI：

10.3791/52566

⸱

2015年4月27日

 ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

本文内容

摘要

本方案概述了如何利用金纳米棒光学吸收产生的瞬态加热来刺激神经元细胞的分化及细胞内钙活性。这些结果可能为神经假体和神经科学基础研究开辟新的应用前景。

摘要

近期研究表明，通过神经组织中的水分吸收红外光所产生的瞬时加热效应，可以以多种方式刺激神经。由于该技术有望提高刺激的定位精度，并减少与组织的机械接触，因此在替代或补充标准刺激技术方面具有巨大潜力。然而，光学方法受限于可见光难以深入穿透组织。此外，热力学建模表明，当使用多个刺激位点或高激光重复频率时，累积的加热效应可能带来潜在风险。下述方案描述了一种改进的神经细胞红外刺激方法。其基本机制依赖于金纳米棒光学吸收所引发的瞬时加热，这种加热可触发神经细胞分化，并提高细胞内钙离子活性水平。这些结果表明，纳米颗粒吸收剂能够增强甚至替代基于水吸收的红外神经刺激过程，在神经假体和细胞治疗的未来应用中具有广阔前景。

引言

近期研究表明，水吸收红外光（波长>1,400 nm）所产生的瞬时热效应可用于诱导神经组织产生动作电位1，以及心肌细胞内的胞内钙瞬变2。由于红外光刺激具有潜在的更高空间分辨率、无需与组织直接接触、可最小化刺激伪影，并且无需在刺激前对细胞进行基因改造（而光遗传学则需要），因此在神经假体应用中引起了广泛关注1。尽管具备上述诸多优势，但近期开发的热模型提示，当使用多个刺激位点和/或高重复频率时，目标组织或细胞可能会受到累积热效应的影响3,4。

为应对这些挑战，研究人员已认识到可利用外源性吸收剂进行神经刺激，以在组织中产生更局限的热效应。Huang 等 通过使用超顺磁性铁氧体纳米颗粒，在射频磁场作用下远距离激活HEK 293细胞中温度敏感型TRPV1通道，验证了这一原理5尽管该技术可能实现更深层的穿透（磁场与组织的相互作用相对较弱），但记录到的响应仅持续数秒，而非仿生装置所需的毫秒级持续时间。5同样地，Farah 等 利用黑色微颗粒实现大鼠皮层神经元的电刺激演示 体外。他们利用数百毫秒量级的脉冲持续时间实现了细胞水平的刺激精度 µ范围内的 s 和能量 µJ，可能实现更快的重复频率6.

外源性吸收剂的使用也被用于诱导形态学变化 体外. Ciofani 等 使用超声激发的压电氮化硼纳米管，神经元细胞突起生长增加了约40%7类似地，已有报道称PC12细胞内吞的氧化铁纳米颗粒可通过激活细胞黏附分子而以剂量依赖性方式促进神经突分化8.

近年来，人们对外源性吸收剂辅助神经刺激的兴趣也集中于使用金纳米颗粒（Au NPs）。Au NPs 能够在等离子体共振峰处高效吸收激光光，并以热的形式将能量耗散至周围环境9在所有可选的颗粒形状中，金纳米棒（Au NRs）的光吸收特性恰好与生物组织的治疗窗口（近红外，NIR，波长范围为750-1,400 nm）相匹配。10此外，在神经刺激的背景下，使用金纳米棒（Au NRs）具有相对良好的生物相容性，并可提供广泛的表面功能化选择11最近的研究表明，在NG108-15神经细胞中，金纳米棒经持续激光照射后可诱导出促进分化的刺激效应12类似地，在用金纳米棒（Au NRs）培养的神经元细胞中，记录了经不同频率和脉冲宽度调制的激光照射后的细胞内钙瞬变。13在初级螺旋神经节神经元培养物中，金纳米棒经近红外激光照射后，也记录到细胞膜去极化现象14第一部分 体内 最近刚刚证明了使用经辐照的金纳米棒（Au NRs）的应用效果。Eom 及其同事在 Au NRs 的等离子体共振峰处进行照射，记录到大鼠坐骨神经复合神经动作电位（CNAPs）的幅度增加了六倍，刺激阈值降低了三倍。这种增强的响应归因于激发纳米棒等离子体共振峰所引起的局部热效应。15.

本文介绍了在培养的NG108-15神经细胞中结合金纳米棒（Au NRs）进行激光刺激效应研究的实验方案。这些方法提供了一种简便而有效的方式，用于对细胞群体进行辐照 体外 使用标准的生物学技术和材料。该方案基于光纤耦合激光二极管（LD），可实现安全操作和可重复的光路对准。金纳米棒（Au NR）样品制备和激光照射方法可进一步拓展至不同颗粒形状和神经元细胞培养体系，前提是相应的合成方法和细胞培养方案已知。

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方案

1. 金纳米棒的制备

注意：金纳米棒（Au NRs）可通过多种方法合成16，或从商业供应商处购买。

  1. 通过紫外-可见光谱法测量金纳米棒（Au NR）溶液的初始光密度（OD），记录300 nm至1,000 nm波长范围内的吸收值，分辨率设置为0.5–2 nm。根据所用比色皿的规格调整待测溶液的体积。
  2. 使用合适的技术评估纳米颗粒的初始摩尔浓度17 (例如 紫外-可见光谱法、单颗粒电感耦合等离子体质谱法、透射电子显微镜，或使用供应商提供的浓度值。
  3. 通过将初始金纳米棒（Au NR）样品稀释至光密度（OD）= 1，配制5 ml的储备溶液。为获得最佳重复性，所有测试样品应保持相同的OD值。稀释溶剂的组成请遵循商业供应商提供的操作说明；若不确定，可使用去离子水。
  4. 将1 ml金纳米棒溶液在7,800 × g条件下离心15分钟，重复两次，以去除溶液中多余的化学物质。离心的力和时间可根据情况调整（例如 5,600 × g 离心 20 分钟18.
  5. 移去上清液，并将纳米棒重新悬浮于去离子水中。由于重新悬浮的颗粒在溶液中可能形成聚集体，建议每日新鲜配制以获得最佳效果。 alternatively，可置于冰箱中保存，但不得超过1周。切勿冷冻。
  6. 在用于细胞培养条件之前，将金纳米棒溶液超声处理5分钟，然后用紫外光照射30分钟进行灭菌（紫外辐射强度不低于400 mW∙m⁻²）。-2 在254 nm处。

2. NG108-15 神经细胞系培养与分化

  1. 准备500 ml无菌的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），其中含有10%（w/v）胎牛血清（FCS）、1%（w/v）L-谷氨酰胺、1%（w/v）青霉素/链霉素和0.5%（w/v）两性霉素B，用于细胞培养。
    注意：补充剂可分装后于 -20 °C 并在所需当天加入培养基中。细胞培养基可在无菌条件下冷藏，最长保存1个月。
  2. 为细胞分化培养基，配制50 ml无菌DMEM，其中含1%（w/v）L-谷氨酰胺、1%（w/v）青霉素/链霉素和0.5%（w/v）两性霉素B。
  3. 在聚苯乙烯材质的T75培养瓶中，加入10 ml细胞培养基，于含加湿 atmosphere（5% CO₂）的培养箱中培养NG108-15神经元细胞2 在 37 °C）。通常，接种 1.5–2 × 105 每瓶细胞在3-4天内可长至适宜状态。每两天更换一次细胞培养基。
    注意：为防止遗传漂变或变异，实验中请勿使用传代次数超过21代的细胞。
  4. 当细胞培养至70-80%融合时，更换为预热的新鲜细胞培养基。通过轻轻敲击融合培养瓶底部的方式机械性分离细胞，切勿使用胰蛋白酶。
  5. 将细胞悬液在600 × g下离心5分钟，弃上清，用2 ml预热的细胞分化培养基重悬细胞沉淀。
  6. 接种 2 × 104 细胞/厘米²2 在组织培养用聚苯乙烯96孔板中 200 µl 细胞分化培养基中。在5% CO₂条件下将实验孵育1天。2/37 °C.
  7. 加入 3.2 × 109-4.2 ×1 010 在第2天向Au NR溶液中加入颗粒/ml，并继续孵育24小时。对照实验中不添加颗粒。
    注意：作为替代性对照，可使用具有明显不同峰值吸收波长的金纳米颗粒（Au NPs）进行比较14为获得更一致的细胞行为，应保持细胞密度恒定，并在接种细胞前避免对孔板表面进行任何处理。

3. 神经突起生长增强

  1. 将激光器与单模光纤（数值孔径 = 0.13）耦合，并使用光纤连接器（FC 连接器方便且常见）进行端接。使用标准功率计测量激光输出功率。为获得最佳效果，应使激光器的峰值波长与纳米棒（NRs）的表面等离子体共振峰相匹配。
  2. 在NR孵育后的第3天，将FC连接器固定于孔板上。在室温下，以连续波模式，使用不同激光功率对样品和对照组照射1分钟。随后，将细胞在5% CO₂条件下继续培养3天。2/37 °C重复激光照射，至少进行3次独立测量。
    注意：可根据具体应用选择不同的照射时间和脉冲频率。
  3. 根据光束直径和激光辐照度（W∙cm⁻²）对激光进行表征-2).
    1. 对于标准单模光纤，使用 NA = n·正弦θ，其中 n 为所用介质的折射率 θ 是光纤出射光锥的半角（参见 图1A）。根据三角学， r = tanθ∙d，其中 r 为光束半径，d 为光纤与样品之间的距离。FC 连接器与孔径直径相匹配，因此可在一定距离处对样品进行照明 d = 2.70 ± 0.20 mm。光在水中从光纤出射（n = 1.33），从而提供 r = tan(arcsin(NA/n))∙d.
    2. 利用后一个公式，计算靶点处的激光束半径、相应的光束面积以及平均激光辐照度（激光功率除以光束面积）（参见示例图 图1B）。这些数值代表了照射区域内平均辐照度。
    3. 利用误差传播的一般理论评估测量中的误差。
      注意：FC连接器与样品之间的距离可通过拍摄实验装置的照片，并使用适当的软件对图像进行后期处理来测量例如 ImageJ
  4. 第5天，从实验中移除细胞分化培养基，用3.7% (v/v) 甲醛溶液固定样本10分钟，随后用0.1% (v/v) Triton X-100 透化细胞20分钟。
  5. 加入3%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）孵育60分钟，以封闭未反应的蛋白质结合位点。加入抗-βIII-微管蛋白抗体，4℃孵育过夜（5 µg/ml 在添加了1% BSA的PBS中 4 °C.
  6. 在避光条件下，用适当的二抗孵育细胞 90 分钟（例如 TRITC标记的抗小鼠IgG抗体），使用浓度为0.4-2 µg/ml 在含1% BSA的PBS中孵育。用DAPI标记细胞核。0.1 µg/ml 在去离子水中浸泡10分钟。
    注意：抗体偶联和浓度可能根据公司提供的操作流程有所不同。每次染色步骤后，用 PBS 洗涤样本两次，每次 5 分钟。
    Laser irradiance vs. power graph and optical setup diagram; study on excitation measurement.
  7. 使用至少20倍物镜通过落射荧光或共聚焦显微镜获取图像样本。根据二抗选择相应的显微镜滤光片。选择DAPI滤光片（λEX = 358 nm；λEM = 488 nm）以显示细胞核。
  8. 通过以下指标分析图片：i) 最大神经突长度（记录从神经突末端至细胞体起始处的长度），ii) 每个神经元细胞的神经突数量（统计单个细胞的所有神经突总数），iii) 具有神经突的细胞百分比（以表达βIII-tubulin的细胞总数除以细胞核染色阳性的细胞总数计算）19.

4. 激光诱导的细胞内 Ca2+ 成像

  1. 通过将 2 g 溶质溶解于 10 ml 无水二甲基亚砜（DMSO）中，配制 20% (w/v) 的 Pluronic F-127 储存液。将 Pluronic F-127 溶液在 40 °C 下加热约 20 分钟以提高其溶解度。若需在室温下保存，请提前配制。
  2. 在 NR 孵育后的第 3 天，配制平衡盐溶液（BSS；135 mM NaCl、4.5 mM KCl、1.5 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2、5.6 mM 葡萄糖和 10 mM HEPES，pH 7.4），并加入 5 µM Fluo-4 AM（溶于 DMSO）和 0.1% (w/v) Pluronic F-127 溶液。
    注意：BSS 溶液可提前配制，并在冰箱中冷藏保存最多 1 个月。Fluo-4 AM 和 Pluronic F-127 应在实验当天添加。
  3. 移除细胞分化培养基，并替换为添加了补充物的 BSS 溶液。为在倒置共聚焦显微镜下获得最佳结果，将细胞孵育于微孔玻片孔中。
  4. 在 5% CO2/37 °C 条件下避光孵育 30 分钟，使 NG108-15 细胞负载 Fluo-4 AM。孵育结束后，用 BSS 洗涤样品两次，以去除未进入细胞的游离荧光染料。
  5. 将激光器与单模光纤耦合，并使用标准技术切割光纤末端。在光学显微镜下观察所得光纤尖端，确保其表面质量良好（即 尖端应垂直于光纤轴线，且在显微镜检查下呈平坦状态）。
    1. 使用标准功率计测量输出激光功率。将光传输光纤插入光纤夹持器中，并固定于微位移器上。有关光纤制备与定位的更多细节，请参见 Brown et al.20。
      警告：在测量激光功率期间，须遵守激光安全的一般规则（例如 不得直视激光束，操作时佩戴激光防护眼镜，防止杂散光照射到其他实验室人员）。
  6. 将示波器连接至便携式激光器，以监测光学调制。使用具有可变频率（0.5–2 Hz）和脉冲宽度（20–100 msec）的二进制信号。按照 Paviolo et al.13 所示装置，将激光器通过调制信号作为晶体管-晶体管逻辑（TTL）输入连接至显微镜。
    1. 将细胞置于倒置共聚焦显微镜下，在透射照明模式下将光传输光纤置于距离目标细胞 250 ± 50 µm 的位置。在此距离下，使用 3.3.1 节中提供的公式计算目标处的光束半径。
  7. 使用氩离子激光器（488 nm）激发细胞内化的 Fluo-4 AM 染料（λEX = 494 nm；λEM = 516 nm），并同步使用激光二极管（LD）激发内吞的 NRs。在室温下对样品和对照组进行成像，使用至少 40× 物镜，以往返扫描模式采集时间序列图像，分辨率为 256 × 256 像素/帧，频率至少为 4 Hz。在不进行 LD 激发的情况下进行一次记录，以识别是否存在氩离子激光干扰（基线噪声）。
  8. 使用自适应加权惩罚最小二乘算法去除数据背景21。将诱导的 Ca2+ 变化绘制成随时间变化的曲线。使用图像后处理软件，通过设定阈值为基线噪声标准差的三倍（3σ），分析荧光强度中的瞬时峰。

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结果

通过使用本文所述的方案1、2和3，在激光照射强度为1.25至7.5 W·cm−2的条件下，观察到金纳米颗粒（金纳米棒、聚苯乙烯磺酸盐包覆金纳米棒和二氧化硅包覆金纳米棒）对NG108-15神经细胞分化具有促进作用。罗丹明B标记的金纳米棒的共聚焦图像显示，这些颗粒在孵育第1天即被细胞内化12。颗粒主要定位于细胞质中，表明其优先通过细胞体膜被摄取12。在诱导NG108-15神经细胞分化后检测到的主要形态学变化包括增殖停止、βIII-微管蛋白的表达以及神经突的生长，后者通过最大长度和数量进行分析22。

在本实验测得的激光辐照度水平（1.25 至 7.5 W·cm−2）下，与纳米棒（NRs）共同培养的样品显示出神经突长度增加。对照组样品（未与纳米颗粒共培养但接受相同激光功率照射的细胞）在神经突长度上未表现出显著变化。当使用 7.5 W·cm−2 的辐照剂量时，与金纳米棒（Au NRs）共培养的 NG108-15 细胞的最终神经突长度比未接受激光照射的样品长约 3...

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讨论

本演示文稿中概述的方案描述了如何利用外源性吸收剂培养、分化及进行光学刺激神经元细胞。NR特性（例如 尺寸、形状、等离子体共振波长和表面化学性质）以及激光刺激参数（如波长、脉冲长度、重复频率 等等。) 可根据不同的实验需求进行调整。可使用标准的生物学检测方法和材料来监测细胞行为的变化。总体而言，该方法提供了一种简单而高效的方式，用于照射细胞群体 体外 并可扩展至原代细胞、组织样本和 体内 研究。

金纳米棒（Au NRs）用于生物应用所需满足的主要条件是稳定（包括化学和物理稳定性）和生物相容性。其中生物相容性尤为关键，原因是金纳米棒表面通常存在阳离子型表面活性剂（常见为CTAB）。已知CTAB可诱导细胞毒性 体外28 和 体内29 并且在合成过程中常用于驱动纳米棒（NR）形状的形成30。通过在金纳米棒表面沉积额外的涂层，通常可提高其稳定性和生物相容性（例如

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披露

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

作者谨此感谢NanoVentures Australia提供的差旅经费支持，感谢谢菲尔德大学的John Haycock教授为本研究提供了部分研究场所，同时感谢Jaimee Mayne女士在拍摄过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Au NRSigma Aldrich716812
NG108-15Sigma Aldrich8811230
DMEMSigma AldrichD6546
FCSLife Technologies10100147
L-谷氨酰胺Sigma AldrichG7513
青霉素/链霉素Life Technologies15140122
两性霉素BLife Technologies15290018
甲醛Sigma AldrichF8775
吐温X-100BDHT8532
BSASigma AldrichA2058
抗-βIII-微管蛋白抗体PromegaG7121
TRITC标记的抗小鼠IgG抗体Sigma AldrichT5393
DAPIInvitrogenD1306
Fluo-4 AMInvitrogenF14201
DMSOSigma Aldrich472301
Pluronic F-127InvitrogenP6867
紫外-可见分光光度计Varian Medical Systems Inc.Cary 50 Bio
小型离心机EppendorfMini Spin
超声波清洗仪Unisonics AustraliaFPX 10D
细胞培养箱KendroHera Cell 150
细胞培养用离心机HettichRotofix 32A
激光二极管Optotech780 nm单模光纤耦合LD
光纤Thorlabs780 HP
功率计CoherentLaser Check
ImageJhttp://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
落射荧光显微镜Axon InstrumentsImageX-press 5000A
μ-载玻片孔板Ibidi80826
倒置共聚焦显微镜Carl Zeiss Microscopy Ltd.LSM 510 meta-共聚焦显微镜
示波器TektronixTDS210

参考文献

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