高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

摘要

在这里，我们将基于细胞的报告基因测定描述为一种有价值的工具，用于筛选化学文库以查找通过 3' UTR 施加的调节转录后控制机制的化合物。

摘要

转录和转录后调控对基因表达产生深远的影响。然而，普遍采用的基于细胞的筛选试验集中于转录调控，而实质上旨在启动子靶向分子的鉴定。其结果是，转录后机制在很大程度上未覆盖由基因表达的靶向药物的开发。在这里，我们描述了，并在确定能够修改它的化合物旨在调查的3'非翻译区（3'非编码区），在其mRNA的命运的调制的作用的基于细胞的测定。该测定法是基于使用含有感兴趣的基因稳定地整合入一个疾病相关的细胞系的3'非编码区一个萤光素酶报道构建体。该协议被分成两部分，与最初的焦点上的初级筛选旨在治疗24小时后影响萤光素酶活性的分子的鉴定。该协议的第二部分介绍了反筛选必要区分化合物特别是通过3'UTR调控荧光素酶的活性。除了详细协议和有代表性的结果，我们提供关于该测定的开发和上内源靶的命中（多个）的验证重要的考虑因素。所描述的基于细胞的报告基因分析将帮助科学家识别分子通过依赖于3'UTR转录后调节机制蛋白质水平。

引言

对于基因表达的很长一段转录调控被认为发挥了重大的，如果在控制蛋白质的生产不是唯一的作用。越来越多的证据，但是，表明转录后调控贡献之多，如果不超过，转录调控，以确定细胞蛋白质丰度^1,2。基因表达的转录后调控更加复杂和精细的比起初的想法。事实上，转录后调控的所有各个阶段都出现了调控，包括mRNA加工，本地化，营业额，翻译³以及新描述的可逆RNA甲基化^4。从一些转录后调控过程可能受到影响，测定下面描述着重于那些涉及mRNA的3'非翻译区（3'非编码区）。 3'UTR广泛影响mRNA的命运通过特定的RNA结合公关互动为主oteins和非编码RNA，以它的调节序列和/或二级结构^5。因此，小分子改变这些相互作​​用或干扰的上游信号转导途径将转向，调节蛋白质丰度的平衡。这种治疗方法是用于人类疾病的量存在证据表明疾病相关基因进行转录后调节，从而代表了药物干预的潜在目标特别重要的。因此，系统通过用在高通量形式的转录后控制机制的干扰，允许mRNA水平“调节剂的筛选可成为潜在的新的治疗方法的鉴定有价值的工具。

所描述的基于细胞的报道基因测定允许对能够经由依赖于它的3'端非编码区的机制来调节的mRNA命运的化合物的鉴定。它由几个主要的Components（ 图1），并且需要几个预备步骤来验证该测定的可行性。首先，所述报道构建体被设计为包括3'....

方案

注：吞吐量这种检测系统取决于可用的HTS实验室设备。该协议是由在Tecan自由EVO 200机器人，它在96孔格式进行液体处理容易。小型化到384孔格式也是可能的。机器人液体处理系统是为了在所有的实验步骤保持在无菌条件下放置在层流罩。如果没有液体处理自动化是可用的，该协议可以很容易地适合于低吞吐量的格式。

初筛

1.第一天：准备和种子细胞

注：种子细胞，得到80％汇合在测定荧光素酶的活性，在接种后，即 ，48小时的时间。

1. 重悬胰蛋白酶CHP134-mycn3UTR神经母细胞瘤细 ​​胞的2×10 ⁵个细胞/ ml在RPMI含有10％FBS和1％L-谷氨酰胺的浓度。为27片制备至少250毫升细胞悬液考虑到液体处理，波谷死体积和反复移液步骤。倒入细胞悬浮到无菌的贮存器并将其放置在所述机器人处。
2. 放置9条形码白色平底96孔板和一个盒上的机器人台200微升无菌吸管提示。各分注步骤之前混合细胞悬浮液通过移液以避免细胞在重力下沉降。分配75微升细胞成9板各孔，以得到每1.5×10 ⁴个细胞的最终密度良好。
3. 盖上盖子的板和离开他们的保育箱的外面30分钟以使细胞沉降到井的底部。这将最大限度地减少边缘效应。
4. 重复，以制备27片的总数量的步骤1.....

结果

使用所描述的方法，我们筛选了2000-化合物库的转录后控制机制的潜在调节剂通过MYCN基因的3'非编码区施加。 图3示出了初级筛选由单个库板例举的结果。显示为媒介物处理的对照的百分比荧光素酶信号，通过测量荧光素酶活性与单个库板的化合物处理CHP134-mycn3UTR细胞的一式三份板获得。正如预期的那样，多数化合物对荧光素酶活性没有影响由接近100％基线值所示。命中（明确的正方形）被选定设置的X±2 SD，那里的平均值X和SD计算在所有检测值的阈值。化合物减少20％以下（一个标有星号）的荧光素酶的活性应考虑被删除的检测抑制最有可能从pronou结果该化合物的NCED细胞毒性。

图4示出在反筛选的约100个化合物获得的数据的几个有代表性的例子。这可以从标准化的荧光素酶信号CHP134-CTRL细胞来判断，在2μM浓度复合W的对细胞活力没有影响，而化合物X显示一些细胞毒活性。两种化合物W和X，但是，会引起MYCN 3'非编码区特异上调荧光素酶活性，以倍数变化差和t检验所指示的。化合物Y 2μM浓度似.......

讨论

该协议描述了一种基于细胞的报告基因测定，旨在鉴定靶向3' UTR依赖性转录后过程的调节剂。它包括初级筛选和反筛选，如果需要，可以伴随细胞毒性测定。初步筛选的结果是许多有价值的候选化合物，其可重复性和特异性在反筛选中得到进一步验证。

主要命中的鉴定基于处理表达报告基因-3' UTR 嵌合转录物的细胞后荧光素酶活性的变化。在没有 3' UTR 的情况下携带相同报告质粒的细胞中重新测试命中，可以区分真命中（通过 3' UTR 依赖性机制特异性调节荧光素酶水平的化合物）和假阳性（通过启动子的转录反应性改变荧光素酶活性的化合物）。正如对主要命中的反筛选所证明的那样，该测定显示出相当大的假阳性率⁶。可以采用多种策略来规避这一限制。抑制药物转录是较短治疗和半衰期短的 mRNA 的一种选择。或者，可以用修饰的核糖体蛋白启动子代替对外部刺激敏感的病毒启动子。后者代表一种组成型活性细胞启动子，被证明对多种药物具有转录惰性，因此更适合转录后评估¹³。最后，使用双色或双输出报告基因可以帮助揭示初级筛选中已经存在的启动子介导的活性的真正转录后效应。具体地，在表达两.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养板 96 孔 白色	珀金埃尔默	6005688
StorPlate 96 孔 U 型底（稀释板）	珀金埃尔默	6008190
100 ml 一次性试剂槽	Tecan	10 613 048
300 ml 一次性机器人储液槽	VWR	PB12001301
机器人吸头 DITI 50 μl 无菌	Tecan	30038607
机器人吸头 DITI 200 μl 无菌	Tecan	30038617
基质 1.4 ml 带 2D 条形码，带平底管	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo 荧光素酶检测系统	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x， 不含 Ca2+， Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-谷氨酰胺 200 mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum 系列（化合物库）	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 机器人	Tecan	N/A
Tecan F200 多孔板读板机	Tecan	不适用