高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

摘要

本文介绍一种基于细胞的报告基因检测方法，该方法可作为筛选通过3’非翻译区（3’ UTR）调控转录后调控机制的化合物文库的有力工具。

摘要

转录水平和转录后水平的调控均对基因表达具有深远影响。然而，目前常用的基于细胞的筛选方法主要集中于转录调控，其本质上旨在发现靶向启动子的分子。因此，在以基因表达为靶点的药物研发中，转录后调控机制在很大程度上尚未被充分探索。本文描述了一种基于细胞的检测方法，旨在研究3'非翻译区（3’ UTR）在调控其mRNA命运中的作用，并筛选能够影响该过程的化合物。该检测方法基于使用一种稳定整合到疾病相关细胞系中的荧光素酶报告基因构建体，该构建体包含目的基因的3’ UTR。实验方案分为两个部分：第一部分侧重于初筛，旨在鉴定经24小时处理后影响荧光素酶活性的分子；第二部分则描述了必要的反向筛选，以区分那些通过3’ UTR特异性调控荧光素酶活性的化合物。除了详细的实验流程和代表性结果外，我们还对检测方法的开发以及对命中化合物在内源性靶点上的验证提出了重要考虑。本所述的基于细胞的报告基因检测方法将有助于科研人员发现通过依赖于3’ UTR的转录后机制来调节蛋白水平的分子。

引言

长期以来，人们认为基因表达的转录调控在控制蛋白质生成中起着主要甚至唯一的作用。然而，越来越多的证据表明，转录后调控在决定细胞内蛋白质丰度方面所起的作用至少与转录调控相当，甚至更为重要^1,2。基因表达的转录后调控比最初设想的要复杂和精细得多。事实上，转录后调控的各个阶段均已被发现受到精密调控，包括mRNA加工、定位、降解、翻译³，以及最近发现的可逆性RNA甲基化⁴。在众多可能受影响的转录后调控过程中，下述实验方法重点关注涉及mRNA 3'非翻译区（3’ UTR）的调控机制。3’ UTR主要通过RNA结合蛋白和非编码RNA与其调控序列和/或二级结构的特异性相互作用，广泛影响mRNA的命运⁵。因此，能够改变这些相互作用或干扰上游信号转导通路的小分子，将改变调控蛋白质丰度的平衡状态。这种治疗策略对于已有证据表明致病相关基因受到转录后调控的人类疾病尤为重要，因而转录后调控机制可成为药物干预的潜在靶点。因此，建立能够在高通量条件下通过干扰转录后调控机制来筛选mRNA水平调节剂的系统，将成为发现潜在新型治疗方法的重要工具。

所述的基于细胞的报告基因检测方法可用于鉴定能够通过依赖mRNA 3’非翻译区（3’ UTR）的机制来调控mRNA命运的化合物。该检测系统包含多个主要组成部分（图1），并需要完成少量初步步骤以验证检测的可行性。首先，报告基因构建体被设计为包含目的基因的....

方案

注意：此类检测系统的通量取决于可用的高通量筛选实验室设备。本方案借助 Tecan Freedom EVO 200 机器人完成96孔板格式的液体处理操作。也可进一步微型化至384孔板格式。为在所有实验步骤中维持无菌条件，该液体处理机器人系统置于超净工作台内。若无自动化液体处理设备，本方案亦可轻松调整为低通量格式。

初筛

1. 第1天：细胞的准备与接种

注意：接种细胞，使其在检测荧光素酶活性时达到80%融合度。 即，接种后48小时

1. 用含10% FBS和1% L-谷氨酰胺的RPMI培养基将经胰酶消化的CHP134-mycn3UTR神经母细胞瘤细胞重悬，调整细胞浓度至2 × 10⁵ 个细胞/mL。为准备27块培养板，需配制至少250 mL细胞悬液，以考虑液体操作过程中的损耗、储液槽的死体积以及重复移液步骤。将细胞悬液倒入无菌储液槽中，并置于机器人操作台。
2. 在机器人操作台上放置9块带条形码的白色平底96孔板以及一盒200 μl无菌移液枪头。每次分装前，通过移液操作混匀细胞悬液，以防止细胞因重力沉降。向每块板的每个孔中分装75 μl细胞悬液，使最终每孔细胞密度为1.5 × 10⁴ 个细胞。
3. 盖上培养板盖，将其置于培养箱外静置30分钟，使细胞沉降至孔底。此步骤....

结果

利用所述方法，我们对一个包含2000种化合物的文库进行了筛选，以寻找可能通过MYCN基因3’非翻译区（3’ UTR）调控转录后调控机制的潜在调节剂。图3展示了以单个文库孔板为例的初筛结果。通过检测在单个文库孔板化合物处理下的CHP134-mycn3UTR细胞中三复孔的荧光素酶活性，获得相对于溶剂处理对照组百分比表示的荧光素酶信号。正如预期，大多数化合物对荧光素酶活性无显著影响，表现为信号值接近100%基线水平。筛选命中化合物（空心方块）的判定标准设定为均值±2倍标准差（x̅ ± 2 SD），其中均值x̅和标准差SD由所有检测数据计算得出。应排除那些使荧光素酶活性降低至20%以下的化合物（以星号标记者），因为所观察到的抑制效应极有可能源于该化合物显著的细胞毒性。

图4展示了在约100种化合物的反向筛选中获得数据的几个代表性示例。根据CHP134-CTRL细胞中标准化的荧光素酶信号判断，化合物W在2 μM浓度下对细胞活力无影响，而化合物X则表现出一定的细胞毒性。然而，化合物W和X均导致MYCN 3’ .......

讨论

本方案描述了一种基于细胞的报告基因检测方法，旨在鉴定靶向 3’ 非翻译区（UTR）依赖性转录后过程的调节物。该方法包括初筛和反向筛选，必要时可辅以细胞毒性检测。初筛结果可获得若干有价值的候选化合物，其重复性和特异性将在反向筛选中进一步验证。

初筛命中物的鉴定基于在表达报告基因-3’非翻译区嵌合转录本的细胞中，经处理后荧光素酶活性的变化。通过在携带相同报告质粒但不含3’非翻译区的细胞中对命中物进行复测，可区分真实命中物（通过3’非翻译区依赖性机制特异性调节荧光素酶水平的化合物）与假阳性结果（通过启动子的转录响应性改变荧光素酶活性的化合物）。如对初筛命中物进行的反向筛选实验所示，该检测方法存在较高的假阳性率⁶。可采用多种策略以克服这一局限性。对于处理时间较短且mRNA半衰期较短的情况，可考虑使用药物抑制转录。另一种方法是将对外界刺激敏感的病毒启动子替换为修饰后的核糖体蛋白启动子。后者是一种组成型活性的细胞启动子，已被证明对多种试剂在转录水平上无响应，因此更适用于转录后调控的评估¹³。最后，在初筛阶段即采用双色或双输出报告系统，有助于将真实的转.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔白色培养板	PerkinElmer	6005688
96孔U型底储存板（稀释板）	PerkinElmer	6008190
100 ml 一次性试剂槽	Tecan	10 613 048
300 ml 一次性机器人储液槽	VWR	PB12001301
机器人吸头 DITI 50 μl 无菌	Tecan	30038607
机器人吸头 DITI 200 μl 无菌	Tecan	30038617
Matrix 1.4 ml 2D 条形码平底管	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo 荧光素酶检测试剂系统	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x，不含 Ca2+，Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-谷氨酰胺 200 mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Spectrum 化合物库	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 机器人	Tecan	N/A
Tecan F200 多板读板仪	Tecan	N/A