需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

9.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52568

⸱

2015年3月3日

 ,  , 
1Laboratory of Translational Genomics, Centre for Integrative Biology, University of Trento, 2High Throughput Screening Core Facility, Centre for Integrative Biology, University of Trento

本文内容

摘要

本文介绍一种基于细胞的报告基因检测方法，该方法可作为筛选通过3’非翻译区（3’ UTR）调控转录后调控机制的化合物文库的有力工具。

摘要

转录水平和转录后水平的调控均对基因表达具有深远影响。然而，目前常用的基于细胞的筛选方法主要集中于转录调控，其本质上旨在发现靶向启动子的分子。因此，在以基因表达为靶点的药物研发中，转录后调控机制在很大程度上尚未被充分探索。本文描述了一种基于细胞的检测方法，旨在研究3'非翻译区（3’ UTR）在调控其mRNA命运中的作用，并筛选能够影响该过程的化合物。该检测方法基于使用一种稳定整合到疾病相关细胞系中的荧光素酶报告基因构建体，该构建体包含目的基因的3’ UTR。实验方案分为两个部分：第一部分侧重于初筛，旨在鉴定经24小时处理后影响荧光素酶活性的分子；第二部分则描述了必要的反向筛选，以区分那些通过3’ UTR特异性调控荧光素酶活性的化合物。除了详细的实验流程和代表性结果外，我们还对检测方法的开发以及对命中化合物在内源性靶点上的验证提出了重要考虑。本所述的基于细胞的报告基因检测方法将有助于科研人员发现通过依赖于3’ UTR的转录后机制来调节蛋白水平的分子。

引言

长期以来，人们认为基因表达的转录调控在控制蛋白质生成中起着主要甚至唯一的作用。然而，越来越多的证据表明，转录后调控在决定细胞内蛋白质丰度方面所起的作用至少与转录调控相当，甚至更为重要1,2。基因表达的转录后调控比最初设想的要复杂和精细得多。事实上，转录后调控的各个阶段均已被发现受到精密调控，包括mRNA加工、定位、降解、翻译3，以及最近发现的可逆性RNA甲基化4。在众多可能受影响的转录后调控过程中，下述实验方法重点关注涉及mRNA 3'非翻译区（3’ UTR）的调控机制。3’ UTR主要通过RNA结合蛋白和非编码RNA与其调控序列和/或二级结构的特异性相互作用，广泛影响mRNA的命运5。因此，能够改变这些相互作用或干扰上游信号转导通路的小分子，将改变调控蛋白质丰度的平衡状态。这种治疗策略对于已有证据表明致病相关基因受到转录后调控的人类疾病尤为重要，因而转录后调控机制可成为药物干预的潜在靶点。因此，建立能够在高通量条件下通过干扰转录后调控机制来筛选mRNA水平调节剂的系统，将成为发现潜在新型治疗方法的重要工具。

所述的基于细胞的报告基因检测方法可用于鉴定能够通过依赖mRNA 3’非翻译区（3’ UTR）的机制来调控mRNA命运的化合物。该检测系统包含多个主要组成部分（图1），并需要完成少量初步步骤以验证检测的可行性。首先，报告基因构建体被设计为包含目的基因的3’ UTR序列，该3’ UTR与报告基因（如萤火虫荧光素酶）的末端相融合（图1）。任何通过插入的3’ UTR所介导的转录后调控机制的变化，都将影响该嵌合转录本的稳定性及/或翻译效率，从而导致荧光素酶表达水平的变化。因此，荧光素酶活性的变化可间接反映目的基因转录后调控所受到的影响。系统的第二个组分为对照报告基因构建体，即一个表达相同报告基因但不含任何3’ UTR的相同表达质粒。这两种报告基因质粒可通过常规分子生物学实验方法在实验室自行构建，也可从商业渠道购买获得。

选择合适的细胞系对于构建检测体系至关重要。最佳细胞系模型的选择取决于多种因素，从临床需求（如最大程度地模拟病理状态）到实际问题（如细胞系的可获得性、转染效率和生长特性）。重要的是，在开展实验前，应确认将3’非翻译区（UTR）与报告基因融合后，能够对嵌合转录本的表达水平产生预期的影响。若在选定细胞中瞬时转染携带3’ UTR的报告基因构建体与对照构建体后，荧光素酶信号无显著差异，则表明该3’ UTR在此细胞模型中不具备功能，需考虑更换其他细胞模型。对于高通量筛选体系，应将携带3’ UTR的报告基因构建体和对照构建体稳定整合至选定的细胞系中。相比瞬时转染，使用稳定整合的细胞系具有多项优势：可扩大细胞模型的选择范围，包括一些难以转染的细胞系；降低因转染效率波动引起的数据变异性；降低实验成本。此外，瞬时转染时常因质粒DNA过载而导致系统饱和，在此情况下进一步提高报告基因的表达将变得困难，从而降低对潜在上调化合物的检测灵敏度。

最后，当所有检测组分都准备就绪后，在转向高通量模式之前，必须确定该检测方法的可行性， 即，以验证荧光素酶活性是否确实能够通过插入的3’非翻译区（3’ UTR）实现特异性的上调和下调。最佳对照是已知通过目标3’ UTR调节mRNA稳定性或可翻译性的小分子。若无法获得此类分子，也可接受能够模拟预期效应的替代性对照，例如已知通过结合目标3’ UTR发挥作用的miRNA或RNA结合蛋白。在主筛前对这些对照进行评估，不仅可验证所建立检测方法的功能性，还可评估其动态范围、灵敏度以及在高通量筛选模式下的表现。

利用所述方案，我们筛选了一个包含2000种化合物的文库6。神经母细胞瘤是婴儿期最常见的颅外实体瘤，被用作生物学模型；而MYCN癌基因的3’非翻译区（3’ UTR）作为靶基因，其扩增可强烈预测神经母细胞瘤的不良预后7。图2概述了实验设计。筛选分为三次运行，每次运行包含27块板的批次。27块板的批次分别包括光谱文库板编号n.1–n.8 + n.25（第一次运行）、n.9–n.16 + n.25（第二次运行）以及n.16–n.24 + n.25（第三次运行），每块板均设置三复孔进行检测。因此，一块文库板（n.25）在三次运行中均被检测，从而实现了运行间的比较。以下方案描述的是单次运行中9块文库板的三复孔测试过程。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：此类检测系统的通量取决于可用的高通量筛选实验室设备。本方案借助 Tecan Freedom EVO 200 机器人完成96孔板格式的液体处理操作。也可进一步微型化至384孔板格式。为在所有实验步骤中维持无菌条件，该液体处理机器人系统置于超净工作台内。若无自动化液体处理设备，本方案亦可轻松调整为低通量格式。

初筛

1. 第1天：细胞的准备与接种

注意：接种细胞，使其在检测荧光素酶活性时达到80%融合度。 即，接种后48小时

  1. 用含10% FBS和1% L-谷氨酰胺的RPMI培养基将经胰酶消化的CHP134-mycn3UTR神经母细胞瘤细胞重悬，调整细胞浓度至2 × 105 个细胞/mL。为准备27块培养板，需配制至少250 mL细胞悬液，以考虑液体操作过程中的损耗、储液槽的死体积以及重复移液步骤。将细胞悬液倒入无菌储液槽中，并置于机器人操作台。
  2. 在机器人操作台上放置9块带条形码的白色平底96孔板以及一盒200 μl无菌移液枪头。每次分装前，通过移液操作混匀细胞悬液，以防止细胞因重力沉降。向每块板的每个孔中分装75 μl细胞悬液，使最终每孔细胞密度为1.5 × 104 个细胞。
  3. 盖上培养板盖，将其置于培养箱外静置30分钟，使细胞沉降至孔底。此步骤可最大限度减少边缘效应。
  4. 重复步骤1.2和1.3两次，共制备27块培养板。
  5. 将培养板置于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。

2. 第2天：用文库化合物处理细胞

注意：Spectrum Collection 小分子文库包含 2,000 种化合物，分装于 25 块 96 孔板中，每板按 8 行 10 列排列，化合物在 DMSO 中的浓度为 10 mM。每块板的第一列和最后一列孔位留空，用于设置对照。化合物筛选实验通常在 1–10 µM 的化合物浓度下进行8。本文所述筛选方案确定工作浓度为 2 μM，检测终点时间为 24 小时。

  1. 在室温下解冻9个化合物文库板。
  2. 准备两个储液槽，分别加入无菌PBS和含0.5% DMSO的PBS溶液，并放置于机器人工作台上。为每个文库板准备并相应标记一个稀释板——即一个工作体积至少为400 μl的聚丙烯U型底96孔板。使用液体处理仪的固定吸头，向稀释板第2至第11列的每孔中加入398 μl无菌PBS。向第1列和第12列各孔中加入50 μl含0.5% DMSO的无菌PBS，以在对照孔中重现溶剂浓度（0.02%）。
  3. 将两个文库板、相应标记的稀释板、两盒50 μl无菌移液吸头以及六块细胞板放置于机器人工作台上。打开细胞板盖。
  4. 从两个文库板之一中取10 mM母液2 μl，加入对应稀释板的相应孔中，并充分混匀。此步骤将获得50 μM的中间化合物浓度。使用同一组吸头，将3 μl的50 μM稀释液分配至3块带条形码的白色96孔细胞板中。该稀释方案使每个测试化合物的工作浓度为2 μM。
    注意：为避免不必要的吸头操作，从一开始就使用完整的96通道吸头组，即使文库板仅包含80个化合物。由于文库板的第一列和最后一列为空，因此该操作可行。
  5. 更换移液吸头，并对第二个文库板重复步骤2.4。
  6. 盖上细胞板盖，将其放回培养箱中孵育24小时。
  7. 对剩余的文库板再重复步骤2.3至2.6两次。

3. 第3天：进行荧光素酶检测

注意：在进行荧光素酶检测之前，可以将其与基于刃天青还原的细胞活力检测进行多重检测，从而获得每个孔的细胞活力指数9。荧光素酶检测与细胞活力检测的多重检测会导致荧光素酶信号降低，但如果细胞产生的荧光素酶活性足够高，则该信号降低可忽略不计。荧光素酶活性可通过多种商用或自制10,11荧光素酶检测试剂进行检测，这些试剂可产生稳定的发光信号。

  1. 将所选的重组荧光素酶试剂平衡至室温。确保试剂体积足以用于所有待检测的板。对于27块板，需准备170 ml荧光素酶试剂，以考虑液体处理、储液槽死体积及重复移液步骤的损耗。将荧光素酶试剂倒入储液槽中，并将其放置于机器人操作台上。
  2. 从培养箱中取出9块含细胞的板，放置于机器人操作台上，打开盖子，待其平衡至室温。逐板向每孔加入50 μl荧光素酶试剂。在加样各板之间，设置相当于一块板发光读数时间的延迟，以确保所有板在加样后均于相同时间间隔内完成检测。
  3. 经过30分钟孵育后，将第一块板放入发光仪中，在短暂振荡后测定发光信号。依次对所有板重复此步骤。记录每块板的条形码，并将其与相应的数据文件关联，以避免因处理大量板而产生错误。
  4. 对剩余的18块含细胞板，重复步骤3.2–3.3两次。
  5. 收集剩余的荧光素酶试剂，并于-20 °C保存。

4. 第4天：数据分析

  1. 使用所有样本相对于同板中溶剂对照组平均值的归一化方法处理实验数据。针对每个文库化合物，计算其三个重复样本的平均值 x̅ 和标准差 SD。
  2. 通过设定阈值为 x̅ ± k × SD 来筛选上调和下调的阳性信号，其中平均值 x̅ 和标准差 SD 是基于所有检测处理值计算得出，k 为预设常数。
  3. 当荧光素酶信号的降低极有可能与化合物毒性相关时，可任意设定阈值截断点 < 溶剂对照组的 20%。排除低于此阈值的阳性结果，可显著减少反筛过程中的假阳性数量。
    注意：除了基于对照的归一化方法外，实验数据也可采用 Z 分数或其稳健类似物 B 分数12进行处理。此外，尚有其他可用于阳性筛选的统计学方法12。

5. 反向筛选

注意：在初筛中鉴定出的化合物（标记为“命中”）需通过反向筛选进行确认，并评估其特异性。

  1. 从保存在单个二维条形码管中的等分试样中挑取选定的阳性结果，并创建新的“阳性板”，同时保存相应的布局。不要忘记为对照组预留空位。
    注意：若缺乏高效的挑取系统，可在初筛阶段平行测试对照细胞和携带3’ UTR的细胞。在这种情况下，可在初筛后特异性筛选仅依赖引入的3’ UTR产生效应的化合物，从而避免进行反向筛选。然而，在两种细胞系中平行筛选会使实验成本翻倍。
  2. 按照初筛实验方案（第1天：细胞准备与接种），针对每块“阳性板”，分别准备三块CHP134-mycn3UTR和三块CHP134-CTRL稳定细胞的96孔板。
  3. 按照初筛实验方案（第2天：用文库化合物处理细胞），使用每块阳性板以2 μM的工作浓度处理三块CHP134-mycn3UTR和三块CHP134-CTRL板。
    注意：虽然此处描述的反向筛选在2 μM单一剂量下进行三个重复，但也可考虑用三个浓度（10倍梯度稀释，范围从2 μM到20 nM）替代标准重复实验来测试阳性化合物。采用该方法不仅可验证初筛结果，还可获得阳性化合物的初步剂量-反应数据，从而降低假阳性率。在此情况下，应采用不同的数据分析流程来处理实验数据并确认阳性结果。
  4. 按照初筛实验方案（第3天：进行荧光素酶检测），测量所有CHP134-mycn3UTR和CHP134-CTRL板的荧光素酶活性。
  5. 按照初筛实验方案（第4天：数据分析），将处理孔的实验数据归一化至板内溶剂对照组的平均值，并计算重复孔的均值和标准差。对每个测试化合物，计算其在CHP134-mycn3UTR与CHP134-CTRL细胞中荧光素酶活性的倍数变化。设定任意的倍数变化截断值为>1.5，显著性p值为<0.01。
    注意：在本实验设置中，判断阳性化合物特异性的关键参数是CHP134-mycn3UTR与CHP134-CTRL细胞之间荧光素酶活性存在显著的倍数变化。如有需要，还可通过针对所选化合物并行开展细胞活力检测来评估化合物毒性。若对初筛阳性结果进行剂量-反应分析，此步骤尤为有益。根据我们的经验，在单一剂量条件下，荧光素酶活性降低与细胞活力下降具有强相关性6。因此，在靶细胞和对照细胞中均观察到荧光素酶活性下降时，可将其视为化合物在测试浓度下具有毒性的指标。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

利用所述方法，我们对一个包含2000种化合物的文库进行了筛选，以寻找可能通过MYCN基因3’非翻译区（3’ UTR）调控转录后调控机制的潜在调节剂。图3展示了以单个文库孔板为例的初筛结果。通过检测在单个文库孔板化合物处理下的CHP134-mycn3UTR细胞中三复孔的荧光素酶活性，获得相对于溶剂处理对照组百分比表示的荧光素酶信号。正如预期，大多数化合物对荧光素酶活性无显著影响，表现为信号值接近100%基线水平。筛选命中化合物（空心方块）的判定标准设定为均值±2倍标准差（x̅ ± 2 SD），其中均值x̅和标准差SD由所有检测数据计算得出。应排除那些使荧光素酶活性降低至20%以下的化合物（以星号标记者），因为所观察到的抑制效应极有可能源于该化合物显著的细胞毒性。

图4展示了在约100种化合物的反向筛选中获得数据的几个代表性示例。根据CHP134-CTRL细胞中标准化的荧光素酶信号判断，化合物W在2 μM浓度下对细胞活力无影响，而化合物X则表现出一定的细胞毒性。然而，化合物W和X均导致MYCN 3’ ...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案描述了一种基于细胞的报告基因检测方法，旨在鉴定靶向 3’ 非翻译区（UTR）依赖性转录后过程的调节物。该方法包括初筛和反向筛选，必要时可辅以细胞毒性检测。初筛结果可获得若干有价值的候选化合物，其重复性和特异性将在反向筛选中进一步验证。

初筛命中物的鉴定基于在表达报告基因-3’非翻译区嵌合转录本的细胞中，经处理后荧光素酶活性的变化。通过在携带相同报告质粒但不含3’非翻译区的细胞中对命中物进行复测，可区分真实命中物（通过3’非翻译区依赖性机制特异性调节荧光素酶水平的化合物）与假阳性结果（通过启动子的转录响应性改变荧光素酶活性的化合物）。如对初筛命中物进行的反向筛选实验所示，该检测方法存在较高的假阳性率6。可采用多种策略以克服这一局限性。对于处理时间较短且mRNA半衰期较短的情况，可考虑使用药物抑制转录。另一种方法是将对外界刺激敏感的病毒启动子替换为修饰后的核糖体蛋白启动子。后者是一种组成型活性的细胞启动子，已被证明对多种试剂在转录水平上无响应，因此更适用于转录后调控的评估13。最后，在初筛阶段即采用双色或双输出报告系统，有助于将真实的转...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

我们感谢意大利神经母细胞瘤基金会对本项目的全额资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔白色培养板PerkinElmer6005688
96孔U型底储存板（稀释板）PerkinElmer6008190
100 ml 一次性试剂槽Tecan10 613 048
300 ml 一次性机器人储液槽VWRPB12001301
机器人吸头 DITI 50 μl 无菌Tecan30038607
机器人吸头 DITI 200 μl 无菌Tecan30038617
Matrix 1.4 ml 2D 条形码平底管Thermo Scientific3711
ONE-Glo 荧光素酶检测试剂系统 PromegaE6120
RPMILonzaBE12-918F
PBS-1x，不含 Ca2+，Mg2+LonzaBE17-516F
L-谷氨酰胺 200 mMLonzaBE17-605E
FBSLonzaDE14-801F
DMSOSigma-AldrichD8418
Spectrum 化合物库MicroSource Discovery SystemsN/A
Tecan Freedom EVO200 机器人 TecanN/A
Tecan F200 多板读板仪 TecanN/A

参考文献

  1. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220(2012).
  3. Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
  4. Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
  5. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
  6. Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
  7. Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
  8. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  9. Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
  10. van Olst, E. S. iebring-, et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
  11. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  12. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  13. Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
  14. Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
  15. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
  16. Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
  17. Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
  18. Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
  19. Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
  20. Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
  21. Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

3
高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。