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方法文章

近胎龄绵羊多变量慢性非麻醉状态记录的仪器化

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DOI：

10.3791/52581

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2015年10月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Département de sciences cliniques, CHUV, Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC, 2Département d'obstetriques et de gynécologie, CHU Ste-Justine Research Centre, Université de Montréal, 3Département de neurosciences, CHU Ste-Justine Centre de recherche, Université de Montréal, 4Centre de recherche en reproduction animale (CRRA), Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC

本文内容

摘要

慢性植入仪器的非麻醉胎羊模型可用于研究健康和疾病状态下的人类胎儿发育，因为该模型允许手术植入和维护导管与电极、重复采血、注射物质、记录生物电活动以及进行体内成像。本文描述了建立该模型所需的操作步骤。

摘要

慢性置入仪器的妊娠绵羊已被用作研究人类胎儿发育以及对病理生理刺激（如内毒素、细菌、脐带阻塞、缺氧和各种药物治疗）反应的模型。针对有早产风险胎儿的糖皮质激素治疗以及治疗性低温等挽救生命的临床实践均是在该模型基础上发展而来。这得益于非麻醉状态下胎儿绵羊对手术植入和维持导管及电极的特殊适应性，从而可实现重复采血、物质注射、生物电活动记录、电刺激应用以及器官的体内成像。本文描述了建立稳定的慢性置入仪器且非麻醉胎儿绵羊模型所需施行的手术置入操作，并从术后血气、代谢及炎症等角度对术后恢复情况进行表征分析。

引言

存在多种动物模型可用于研究正常及异常妊娠，包括实验啮齿类动物、非人灵长类动物和家养反刍动物。1,2,3,4,5 慢性植入仪器的妊娠绵羊已被广泛用作人类胎儿发育及对病理生理刺激（如脂多糖（LPS））反应的研究模型，应用历史已达50年。6-10 LPS暴露后产生的病变与早产儿脑室周围白质软化症所见的病变完全相似，这是由于两种物种具有类似的成熟发育特征。11, 12

其他妊娠并发症也已得到深入研究，例如产前糖皮质激素可促进胎儿肺部发育13-15，以及宫内生长受限（IUGR）对胎儿的影响16,17。

胎羊模型被广泛使用，是因为非麻醉状态下的胎羊特别适合进行手术植入和维持导管及电极，从而可重复采集血液样本、记录生物电活动、施加电刺激以及进行体内脑成像。18 尽管遥测技术也可实现，但由于其建立系统更为复杂，且初期投入和维护成本较高，目前应用仍较少。19

此外，胎羊模型具有很高的多功能性，可根据研究需求选择多种不同的仪器配置。例如，可连续数天至数周实时记录多种变量信号，包括胎羊呼吸运动、脑电活动、心血管反应、心电图，以及利用血流探头或微球技术测量多个器官的局部血流量等。得益于这种多功能性，已开展的研究涵盖广泛领域，如心血管系统的发育20,21、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的发育22、脑发育23，尤其是睡眠状态的发育24、缺氧/窒息的影响25、治疗性低温疗法26、炎症反应6-11、炎症与缺氧的联合作用27、糖皮质激素的作用28,29、抗抑郁药物的影响30、支气管肺发育不良（BPD）31,32、胎儿期编程33,34,35,36,37,38,39，以及产前和分娩期间新型胎儿监护技术的开发等研究方向40,41,42,43。

本方法的总体目标是展示这一多功能模型的基本实施方案。该模型可用于建立多种急性和慢性实验方案，从整体、器官、细胞和分子水平上研究胎儿生理学与病理生理学。

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方案

动物护理遵循加拿大动物护理委员会的指南，并获得蒙特利尔大学动物护理委员会的批准（方案编号 #10-Rech-1560）。表1中提供了所用材料与方法的详细信息。

1. 麻醉

  1. 将单腔导管插入颈静脉。
  2. 使用乙酰丙嗪（Atravet 10 mg/mL）2 mg 静脉注射，于操作前约30分钟对母羊进行镇静 在麻醉诱导前进行，以减少与操作相关的应激反应，从而降低皮质醇水平。
  3. 给予地西泮（Diazepam 5 mg/mL）20 mg，氯胺酮（Ketalar 100 mg/mL） 4-5 mg/kg 的丙泊酚（Propofol 10 mg/mL）静脉注射，剂量为 0.5 至 1 mg/kg，以诱导全身麻醉。
  4. 使用喉镜（威斯康星型刀片，超长350 mm左撇子刀片）插入气道交换导管至气管，以辅助插管。将硅胶气管导管（内径9至12 mm）沿气道交换导管滑入气管。该技术有助于简化插管过程。小心充盈气管导管的气囊，以避免压力引起的气管溃疡，并将导管固定于母羊头部。
  5. 将气管插管连接至麻醉机的呼吸回路，并立即开始机械通气。调整呼吸机参数以维持 PaCO2 在35至45 mmHg的正常范围内。
  6. 将导管插入耳动脉（22至20 G；1英寸［0.9 x 25 mm］至1.16英寸［1.1 x 30 mm］），并连接至非顺应性导管，以监测直接动脉血压。
  7. 使用多参数生理监护仪记录心电图、直接动脉血压、血氧饱和度（SpO₂）2），二氧化碳图（PET一氧化碳2），以及每5分钟记录一次体温。通过串行电缆将所有生理数据传输至中央生理数据采集计算机。使用循环水毯维持正常体温。
  8. 以10 mL/kg的剂量在全身麻醉的首小时内输注平衡多离子溶液，随后将输注速率减至5 mL/kg/h。
  9. 在切开皮肤前，对母羊静脉注射甲氧苄啶-磺胺多辛（trimethoprim-sulfadoxine）5 mg/kg，作为抗生素预防。
  10. 对母羊和胎儿的所有外科操作均需采用标准无菌技术。
  11. 始终对母羊实施屏障护理，包括非手术人员。这将最大限度地降低地方性感染的风险 例如， 贝氏柯克斯体 始终佩戴手套和口罩（N-95型）。

2. 手术步骤概述

  1. 在乳房前方紧邻处沿腹白线做一条20厘米长的正中切口，穿过下腹壁，以尽量减少腹肌损伤。
    1. 将大网膜向上方牵拉，手动触诊子宫角。从子宫体开始沿每个子宫角向其末端触诊，注意胎儿的数量及其大小。若存在多个胎儿，通过手动评估胎头大小及眼眶间距，选择较大的胎儿。
    2. 通过部分外置的子宫牢固握住所选胎儿的头部。使用梅岑鲍姆剪刀（Metzenbaum scissors）在子宫大弯处行10 cm子宫切开术。立即将一个装有无菌生理盐水的无乳胶无菌外科手套套在胎儿头部，如同戴手一般；或者使用浸湿的4×4纱布保持胎儿头部湿润。将子宫固定于腹壁。
      1. 将胎儿的右侧和左侧胸肢外置，并轻柔地将胎儿从子宫中拉出，直至剑突位置。
    3. 采用标准手术暴露技术将聚乙烯导管插入右侧和左侧臂静脉及动脉。将另一根聚乙烯导管插入羊膜腔，并将其末端固定于胎儿胸骨处。
      1. 仅使用无菌导管。建议在标准设施中采用气体灭菌法。将每根导管连接至针头，针头再连接至双向三通阀，以便后续进行采血或压力监测。
    4. 将不锈钢电极缝合至胸骨柄、剑突以及双肩各点，以监测心电图（ECG）。
    5. 将胎儿放回子宫内。所有导管和电极通过左侧腹壁的一个小穿刺切口引出。
    6. 使用三层缝合技术关闭剖腹切口。用合成可吸收单股缝线（USP 2）连续简单缝合腹壁。用合成可吸收编织缝线（USP 0）连续简单缝合皮下组织。使用外科不锈钢钉合器关闭皮肤切口。
  2. 手术步骤的详细描述
    1. 用40号刀片从剑突部位向乳腺方向剃除毛发，并沿两侧 flank 的褶皱处剃净。随后用4%葡萄糖酸氯己定溶液和软毛刷彻底清洗腹侧腹部，持续3分钟。
      1. 使用4%葡萄糖酸氯己定从腹部中心开始进行标准无菌擦洗，以离心方式持续3分钟。将无菌生理盐水倒在腹部以去除消毒皂液。手术准备的最后一步，交替使用2%葡萄糖酸氯己定溶液和70%异丙醇进行三次擦拭。
    2. 在切口前确保麻醉深度足够。沿腹白线从脐部至乳房前方稍上方做一标准剖腹手术切口，以尽量减少腹肌损伤。
    3. 沿左侧腹壁将长海绵钳插入腹腔，直至肋缘区域导管预定穿出位置。
      1. 将镊子的尖端抵住壁面，直至助手能够定位并确认合适的位置。将镊子的钳口稍微张开（1 cm），让助手进行一个 2 cm 的全层刺切口。
      2. 将镊子尖端从切口处引出，再次打开，用镊子轻轻夹住导管，并通过腹部腹侧切口将导管最终牵拉出腹腔。需要注意的是，有些研究团队先植入导管再将其引出体外，这种方法的缺点是在手术过程中无法进行胎儿心电图监测。
    4. 触诊子宫以确定胎位和胎仔数量。通过耳间距离确定最大的胎仔。在子宫大弯处胎仔头部背侧的宫壁上做切口，避开绒毛膜突起。
      1. 使用剪刀切开胎膜，然后插入钝端套管以获取无出血的羊水样本。
    5. 通过该切口将胎儿的头侧半部移出体外。将装有37°C无菌生理盐水的无菌非乳胶外科手套覆盖在胎儿头部，以帮助维持正常体温。
      1. 在将胎儿上半身从子宫中取出时，助手应持Babcock钳夹住以防止羊水流失。随后，再次使用Babcock钳夹住胎膜和子宫壁与皮肤，以防止羊水污染腹腔。
      2. 仅暴露需要进行器械操作的胎儿身体部位，其余部分应保留在子宫内或分别用湿润且温热（37 °C）的无菌布覆盖。
    6. 将双侧胸肢外展，以充分暴露双侧肱动脉和肱静脉。沿前臂内侧切开，仔细分离肱动脉和肱静脉周围组织。
    7. 采用标准手术切开技术将聚乙烯导管插入右侧和左侧肱动脉以及左侧肱静脉。
      1. 分离待插管血管周围组织，范围超过1厘米。使用编织合成可吸收USP 2-0缝线结扎血管远端。在血管近端预先放置结扎线，但暂不打结。
        1. 使用Castroviejo剪刀将血管横向剪开，切口约为血管直径的30%。通过牵拉近端缝线部分阻断血流。将导管向近端方向插入。
      2. 将聚乙烯导管向近端插入约8 cm，或直至遇到阻力，然后稍作回撤。使用血管夹临时固定导管的近端。在导管的近端和远端周围再放置一针缝线。由助手持续抽吸并冲洗导管，以确保导管通畅。
      3. 使用USP 2-0编织合成可吸收缝线，采用连续缝合方式关闭胎儿皮肤。
    8. 在左右肩部、胸骨柄和剑突处，固定绝缘的不锈钢电极，以利于监测胎儿心电图。
    9. 将羊膜腔压力和取样导管缝合至胸骨。该导管末端带有侧孔。
    10. 使用USP 2-0编织合成可吸收缝合线将所有导管固定于胎儿背部。
    11. 在将胎儿放回子宫之前，缓慢静脉注射30 µg 克仑特罗，持续15分钟 以避免低血压并提供子宫松弛。
    12. 使用USP 4-0编织合成可吸收缝合线，采用连续缝合方式缝合胎膜。每次仅将一根导管或电极纳入缝合口，以确保紧密闭合。使用USP 0编织合成可吸收缝合线，按照Halsted原则采用双层库兴式（Cushing）缝合法关闭子宫肌层。仔细埋藏手术结。
    13. 使用荷包缝合技术，在所有导管和心电图导线穿出左侧肋旁切口处将其固定。
    14. 使用 USP 2 使用单股合成可吸收缝合线以连续缝合方式缝合白线。使用USP 2-0编织合成可吸收缝合线以连续缝合方式闭合皮下组织。以外科缝钉固定皮肤层。
    15. 静脉注射250 mg氨苄青霉素，并通过羊膜腔导管向羊膜腔内再次给药。用温盐水补充流失的羊水。
    16. 将所有外置的导管和心电图电极放入无菌袋中以维持无菌状态。在母羊躯干周围放置一层网状绷带，以固定所有导管和电极，使其紧贴母羊身体。
    17. 停止全身麻醉，待母羊喉部反射恢复正常后拔管。
    18. 将母羊在全身麻醉后恢复稳定时，放回代谢笼中。在整个实验期间，母羊将饲养于代谢笼内。母羊应能够站立、躺卧和进食 随意摄取 在不使母体镇静的情况下监测未麻醉的胎儿。
    19. 接下来的三天内，对母羊预防性给予抗生素（甲氧苄啶磺胺多辛 5 mg/kg），对胎儿静脉注射氨苄西林 250 mg，并通过羊膜腔导管再次给药。
    20. 利用血气分析评估母羊和胎儿的代谢状态。
    21. 以尽可能少的肝素化生理盐水冲洗所有导管。注意——切勿超过胎儿可接受的肝素和液体的日允许剂量。有可能导致胎儿液体负荷过重。在抗生素预防后，每天缓慢冲洗一次，每条管路约5 mL NaCl。
  3. 数据记录与分析
    1. 手术期间，可选择性持续记录母体和胎儿的ECG及心率，以及母体动脉血压和气道压力（Paw）图1）。使用生命体征监护仪采集除心电图以外的所有母体数据。将这些数据与胎儿和母体心电信号一同输入模数转换器；传递 将母体和胎儿心电图信号首先输入1901型前置放大器。使用制造商提供的软件记录并显示所有数据。
    2. 在胎儿手术开始时（插入第一根动脉导管后立即进行）和关闭子宫后，同时从母羊和胎儿采集1 mL动脉血样本，用于动脉血气分析，以及乳酸、葡萄糖和血浆碱剩余的测定。
    3. 术后恢复期间，采集3 mL胎儿血样以检测IL-6和TNF-α炎症谱。将血浆于4 °C离心（4分钟，4,000 x g），倾出上清液并储存在-80 °C，用于后续ELISA检测。
      注意：为了获得本文报告的代表性结果，术后第六天通过静脉注射 20 mL 戊巴比妥钠处死动物。通过检测仔鼠体重、脑重、肝重及母鼠体重评估胎儿生长情况。实验周期的持续时间显然取决于具体研究问题的设计，最长可达约 6 周。
  4. 细胞因子分析（可选步骤）
    1. 使用绵羊特异性的夹心法测定血浆中细胞因子浓度（IL-6、TNF-α） ELISA。将小鼠抗绵羊单克隆抗体（IL-6 捕获抗体）或小鼠抗牛单克隆抗体（TNF-α）以 4 µg/ml 的浓度包被于 ELISA 板上，4 °C 过夜孵育。之后用洗涤缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 PBS，PBST）洗涤 3 次。
    2. 用含1% BSA的PBST封闭平板1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板3次。
    3. 使用重组绵羊蛋白（IL-6、TNF-α）作为ELISA标准品，配制系列稀释液，浓度范围从标准品1的2,000 ng/ml至标准品7的31.25 pg/ml。
    4. 每孔加入50 µl系列稀释的蛋白标准品和样品，室温孵育2小时，洗涤平板3次。所有标准品和样品均设复孔。
    5. 在孔中加入50 µl兔抗绵羊多克隆抗体（检测抗体IL-6）或兔抗牛多克隆抗体（TNF-α），稀释比例为1:250，于室温孵育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤平板5次。
    6. 加入50 µl 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1:5,000稀释），孵育30分钟。
    7. 每孔加入50 µl TMB底物溶液，孵育。
    8. 在所需时间加入25 µl的2 N硫酸以终止显色反应。
    9. 在酶标仪上以450 nm波长读取吸光度，并以570 nm波长进行校正。
      注意：在我们的检测中，IL-6 ELISA 的检测灵敏度为 16 pg/ml，TNF-α ELISA 的检测灵敏度为 13.9 pg/ml。所有检测的批内和批间变异系数均为 <5% 和 <10%，分别。
  5. 统计分析
    注意：具体的统计学方法取决于研究问题。此处我们报告用于检验表2中血液气体指标是否存在显著差异的统计方法。
    1. 使用 Kolmogorov-Smirnov 检验测试数据正态分布，随后根据情况选择适当的参数检验或非参数检验，并对多重比较进行校正。
    2. 使用K均值聚类分析识别队列中自发性缺氧的胎儿，并确定各自的pO2 和 O2Sat 值（考虑 pO2 < 20 mmHg 或 O2周六 < 55% 为胎儿缺氧。 44-48
    3. 使用 SPSS 等统计软件进行分析。
    4. 以均值±标准差表示数据，统计学差异显著性设为 p<0.05 被视为具有显著性。

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结果

在妊娠128±2天（dGA，约妊娠0.88倍，足月为145 dGA）时，采用无菌技术在全身麻醉下（母羊和胎儿均麻醉）对38只妊娠期确定的母羊进行了手术置入动脉、静脉和羊膜导管以及心电图（ECG）电极。若为双胎妊娠，则根据触诊估计胎儿间颞径选择较大的胎儿； alternatively，也可随机选择胎儿进行置入操作，以避免潜在的偏倚，或对两个胎儿均进行置入。手术总持续时间为124±27分钟。胎儿上半身暴露于子宫外的时间为92±19分钟。大多数接受手术的母羊为F2代动物，其母本为F1代（边境 Leicester × 罗马诺夫），父本为汉普夏公羊；其杂交组合如下：汉普夏（50%）- 边境 Leicester（25%）- 罗马诺夫（25%）= HABLRV。

手术和仪器操作期间具有代表性的母体和胎儿生理特征如图1所示，均处于胎儿相应孕周的生理正常范围，且母体在麻醉期间的行为表现正常。

母体体重平均为 75±11 kg，38 例中有 21 例为双胎妊娠（即，速率为1.6±0.5。在剖检时...

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讨论

本文介绍了建立用于研究胎儿生理学和病理生理学的动物模型——慢性置入仪器且非麻醉状态下的胎羊模型——所需的麻醉与手术操作。

该方案中有四个关键步骤需要特别强调。第一，将导管和电极穿过母体侧腹：此操作应一次性完成，以避免造成任何内脏器官损伤。第二，在将胎儿移出之前，需固定好子宫切口手术部位：这一点至关重要，可防止或尽量减少羊水流失，并在关闭子宫前对羊膜进行缝合。第三，动脉插管：胎羊动脉直径约为1-2 mm，对于经验丰富的外科医生而言插管并不困难；由两名外科医生组成的团队在此操作中配合最为高效快捷，有助于节省时间，从而缩短整个手术过程的持续时间。第四，在将胎儿放回羊膜腔并关闭子宫之前，需仔细固定并整理好羊膜腔内的所有导管和心电图电极：这有助于避免术后因母体或胎儿活动导致导管被意外牵拉或心电图电极撕裂。

除了本文所介绍的肱血管插管方法外，也可使用颈动脉或股动脉进行插管。具体选择取决于整体的仪器植入策略，而该策略本身又由研究设计决定。我们建议尽量减少胎儿在子宫外停留的时间，并尽量减少胎儿为完成仪器植入所需离开子宫的程度。这些考虑因素促使...

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致谢

作者们衷心感谢Molly Towell围产期研究基金会、加拿大卫生研究院（CIHR）、魁北克健康研究基金会（FRQS）（资助对象：MGF）以及加拿大卫生研究院-魁北克围产期研究培训网络（QTNPR）（资助对象：LDD）提供的经费支持。

作者谨此感谢Esther Simard、Marco Bosa、Carl Bernard和Carmen Movila提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACE 光源Schott-FostecA20500
解剖剪刀精细科学工具公司（Fine Science Tools）14060 - 11
斜头解剖剪刀精细科学工具公司（Fine Science Tools）15006 - 09
手术刀柄精细科学工具公司（Fine Science Tools）10003 - 12交替使用的解剖工具
弧形手术刀片 #12精细科学工具公司（Fine Science Tools）10012 - 00交替使用的解剖工具
骨剪精细科学工具公司（Fine Science Tools）16044 - 10
S & T 缝合打结镊精细科学工具公司（Fine Science Tools）00272 - 13
Dumont SS 镊子 - 斜头型精细科学工具公司（Fine Science Tools）11203 - 25 
6-0 规格编织丝线缝合线泰利福医疗（Teleflex Medical）07 - 30  - 10
医用胶带Transpore3M
盐酸氯胺酮 100 mg/mlHospiraNDC 0409 - 2051 - 05最终剂量为 80 mg/kg
镇静注射液（赛拉嗪 100 mg/ml）VecdoNDC 50989 - 234 - 11最终剂量为 10 mg/kg
活性橙 14Sigma - AldrichR - 8254
林格氏液成分溶液经含 95% O₂ 和 5% CO₂ 的气体平衡，最终 pH 值为 7.4
氯化钠Sigma - AldrichS7653最终浓度：118 mM
氯化钾费希尔科技公司（Fisher Scientific）P217 - 3最终浓度：4.7 mM
二水合氯化钙费希尔科技公司（Fisher Scientific）C79 - 500最终浓度：2.5 mM
磷酸二氢钾费希尔科技公司（Fisher Scientific）P -285最终浓度：1.2 mM
硫酸镁J.T. BakerJan-00最终浓度：0.57 mM
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）费希尔科技公司（Fisher Scientific）BP 310 - 500最终浓度：5.95 g/L
葡萄糖Sigma - AldrichG8270最终浓度：5.5 mM
LifeWindowDigicare 生物医学技术公司
CED 生物放大器和 ADC 单元剑桥电子设计有限公司（Cambridge Electronic Design Limited,
Unit 4, Science Park,
Milton Road,
Cambridge CB4 0FE
ENGLAND）		生物放大器：1902；ADC：micro1401；数据采集软件：Spike 2，V7.13
Neurolog 模拟信号生物放大器Digitimer 有限公司（Digitimer Ltd
37 Hydeway
Welwyn Garden City
Hertfordshire, AL7 3BE, England）		NL108A
ABL800FlexRadiometer Canada；200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2
Eppendorf 5804REppendorf Canada；2810 Argentia Road, #2
Mississauga, Ontario, L5N 8L2
Arrow 颈静脉插管套件Arrow International, Inc.，2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA
Atravet10 mg/ml
地西泮5 mg/ml
氯胺酮Ketalar100 mg/ml
丙泊酚10 mg/ml
SurgiVeT气管内导管；Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA
Cook 气道交换导管（带 RAPI-FIT 接头）Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA
Dispomed 呼吸机Dispomed Ltd.，745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6
BD Insyte-W贝克顿·迪金森公司（Becton Dickinson），输注治疗系统公司（Infusion Therapy Systems Inc.），9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA22 至 20 G；1 英寸 [0.9 x 25 mm] 至 1.16 英寸 [1.1 x 30 mm]
Edwards Lifesciences 型号：PX272 压力监测套件（含 TruWave 一次性压力传感器）
LifeWindow LW6000Digicare 生物医学技术公司，107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA
Gaymar
Babcock
聚乙烯导管SCI（Scientific Commodities Inc.）2 米
2-0 Vicryl
Castroviejo 剪刀
心电图（ECG）LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Germany单鞘内四铜电极，2 米
2-0 Vicryl
3-0 Vicryl
PDS II USP
复方磺胺甲噁唑（甲氧苄啶-磺胺多辛）
氨苄西林
三通阀Argon Medical，货号 041220001A带阳式鲁尔锁的双四通三通阀
针头Tyco Healthcare 8881202389Monject 铝制针座钝头针，22Gx，0.7mm x 38.1mm：用于胎儿动脉和静脉导管
针头Tyco Healthcare 8881202322Monject 铝制针座钝头针，16Gx，1.6mm x 38.1mm：用于羊膜腔导管

参考文献

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