基于新型原子力显微镜生物筛选技术分离肌萎缩侧索硬化中TDP-43变异体形态特异性试剂

摘要

通过结合原子力显微镜与生物淘选技术，我们建立了一套针对任意生物样本中疾病特异性蛋白质变体（即使浓度较低）的阴性和阳性生物淘选系统，成功获得了针对肌萎缩侧索硬化症相关TDP-43蛋白变体的抗体。

摘要

由于蛋白质变体在多种疾病中发挥关键作用，例如TDP-43在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中、α-突触核蛋白在帕金森病中，以及β-淀粉样蛋白和tau蛋白在阿尔茨海默病中，因此开发能够选择性靶向这些疾病特异性蛋白质变体的形态特异性试剂至关重要，可用于研究这些变体在疾病病理中的作用，并具有潜在的诊断和治疗应用价值。我们已开发出基于原子力显微镜（AFM）的新型生物筛选技术，可分离出选择性识别疾病特异性蛋白质变体的试剂。该过程包含两个关键阶段：阴性筛选和阳性筛选阶段。在阴性筛选阶段，通过多轮减法筛选，利用一系列精心选择的非靶标抗原去除与非靶标抗原发生反应的噬菌体。阴性筛选阶段的一个关键特征是利用AFM成像对筛选过程进行监测，并确认所有非期望的噬菌体颗粒均已被清除。在阳性筛选阶段，将目标抗原固定在云母表面，洗脱并筛选结合的噬菌体，以鉴定能够选择性结合目标抗原的噬菌体。只要使用了适当的阴性筛选对照，目标蛋白质变体无需预先纯化。即使在复杂生物材料中仅以极低浓度存在的目标蛋白质变体，也可用于阳性筛选步骤。通过该技术的应用，我们已获得针对TDP-43蛋白质变体的抗体，这些变体选择性地存在于人类ALS脑组织中。我们预计，本方案适用于生成可选择性结合多种不同生物过程和疾病中蛋白质变体的试剂。

引言

蛋白质变体的存在已被认为是多种疾病进展的因素，包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）等神经退行性疾病^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}。β-淀粉样蛋白和α-突触核蛋白的寡聚形式分别被认为是导致阿尔茨海默病和帕金森病的毒性物质^2,3,4,5。TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的聚集物已被证实与ALS和FTD相关^12,13,14。因此，能够选择性靶向不同蛋白质变体的试剂（如抗体）可作为诊断标志物和潜在治疗手段的有力工具。在本研究中，我们专注于开发可选择性结合与ALS相关的TDP-43蛋白变体的试剂，但本文所述技术应适用于分离针对多种蛋白质变体的试剂。

TDP-43 的细胞质聚集已被确定为肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理特征^{15,16,17,18,19}。在正常个体的所有细胞中，TDP-43 通常位于细胞核内，尽管其在细胞质与细胞核之间具有一定的穿梭倾向^15,17。然而，在 ALS 患者中，可在特定神经元和胶质细胞的细胞质中检测到聚集形式的 TDP-43，同时细胞核内的浓度降低，提示在疾病进展过程中 TDP-43 从细胞核向细胞质转移^16,20。尽管大多数 ALS 病例中均存在 TDP-43 的聚集现象，但并非所有病例均由此引起，因为约 1%–2% 的 ALS 总病例（或约 15%–20% 的家族....

方案

1. 噬菌体的制备

1. 所有噬菌体的制备和生物筛选过程均在生物安全柜中进行。根据制造商提供的说明（http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf），使用不同的文库（Tomlinson I 和 J 文库以及 Sheets 文库²¹）制备用于生物筛选的噬菌体颗粒。
   注意：我们在筛选过程中使用多个文库，以增加可获得抗体的多样性。
2. 简要而言，在含有1%葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的200 ml 2xYT培养基中，于37 °C摇床培养三种文库的细菌菌种，直至OD₆₀₀达到0.4。
3. 向200 ml Tomlinson I 和 J 文库中加入8 × 10¹¹个KM13辅助噬菌体，向200 ml Sheets文库中加入8 × 10¹¹个VCSM13辅助噬菌体。将文库样品与辅助噬菌体在37 °C孵育30分钟，期间不振荡。
4. 在3,000 × g条件下离心培养物10分钟，将菌体沉淀重悬于200 ml含0.1%葡萄糖、100 μg/ml氨苄青霉素和50 μg/ml卡那霉素的2xYT培养基中。
5. 将培养物在30 °C振荡过夜孵育，次日以3,300 × g离心30分钟。
6. 向各文库的200 ml上清液中加入50 ml含2.5 M NaCl....

结果

在 图1示意图展示了我们利用免疫管通过负向筛选去除文库中与脱靶抗原结合的噬菌体的过程。我们首先使用牛血清白蛋白（BSA）进行筛选，因为BSA是一种常用的封闭剂，任何会非特异性结合该靶标的噬菌体在后续的免疫检测中均可能造成干扰。随后，我们去除了与聚集态α-突触核蛋白结合的噬菌体，以消除那些对聚集蛋白的通用结构具有反应性的噬菌体即， 一种可与聚集态α-突触核蛋白、TDP-43、Aβ发生交叉反应的抗体 等等。）。原子力显微镜结果表明，在针对聚集态α-突触核蛋白进行一轮负向筛选后，噬菌体发生了结合图2A）且经过8轮后无结合图2B随后，我们使用健康人脑组织进行阴性淘选，以去除能够结合健康人脑匀浆中多种抗原的噬菌体。 图2C 显示噬菌体在经过1轮负向筛选后仍结合健康组织，而在经过10轮负向筛选后无噬菌体残留结合（图 2D）。由于可用于筛选的健康对照和额颞叶变性（FTD）免疫沉淀TDP-43蛋白的量较少，使用云母片而非免疫管可减少反应体积，从而降低.......

讨论

蛋白质变体已被证实参与多种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆）的进展^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}。分离能够选择性识别这些不同蛋白质变体靶标的抗体，可为研究、诊断乃至潜在治疗此类疾病提供有效的试剂。为获得此类变体特异性抗体，我们开发了一种新颖的生物筛选方法，该方法利用原子力显微镜监测每一步骤的进展。此前采用类似的阴性与阳性生物筛选联用策略，已成功获得可结合寡聚态β-淀粉样蛋白的克隆⁵。本文进一步拓展该研究，证明我们能够高效地生成选择性结合人脑组织样本中疾病特异性蛋白质变体的试剂。我们已分离出可特异性识别TDP-43变体的形态学特异性试剂，这些变体仅存在于人肌萎缩侧索硬化症脑组织中^13,14。未来的研究需进一步表征所靶向的TDP-43变体的性质（如是否发生聚集或修饰）。

在阳性筛选阶段，确保获得针对任意蛋白质变体靶标的噬菌体的关键步骤是确认阴性筛选过程已去除所有可能交叉反应的噬菌体克隆。我们利用原子力显微镜（AFM）成像验证了在每轮阴性筛选过程中，几乎所有结合非靶标抗.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
汤姆林森 I 型和 J 型文库	MRC（剑桥，英格兰）
希茨文库	MRC（剑桥，英格兰）
2xYT	BD Sciences	244020
葡萄糖	Amresco	0188-2.5KG
氨苄青霉素	Amresco	0339-25G	刺激性物质
KM13 辅助噬菌体	MRC（剑桥，英格兰）
卡那霉素	OmniPur	5880	刺激性物质
聚乙二醇 8000	OmniPur	6510	刺激性物质
氯化钠	Macron	7647-14-5
磷酸氢二钠	Amresco	0404-1KG	刺激性物质
氯化钾	EMD	PX1405-1	刺激性物质
磷酸二氢钾	Amresco	0781-500G	刺激性物质
TG1 细胞	MRC（剑桥，英格兰）
LB 琼脂培养基	EMD	1.10283.0500
牛血清白蛋白	Amresco	0332-100G
STEN 缓冲液	Crystalgen 公司	33429775
免疫管	Thermo Scientific	470319
云母	Spruce Pine Mica	24365
吐温 20	EMD
胰蛋白酶	Sigma	T-0303	刺激性物质
三乙胺	Sigma	T-0886	易燃物
甘油	Amresco	0854-1L	刺激性物质
质粒 DNA 提取试剂盒	Qiagen	27106	刺激性物质
脱脂奶粉	Carnation
96 孔高结合 ELISA 板	Costar	3590
抗 M13 HRP 抗体	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA 化学发光底物试剂盒（Femto）	Thermo Scientific	37074
抗 TDP-43 多克隆抗体	ProteinTech	10782-2-AP
蛋白 A/G 琼脂糖微珠	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 细胞	MRC（剑桥，英格兰）
异丙基硫代半乳糖苷	Teknova	13325
9e10 HRP 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	162-0115	易燃物
离心机	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa 原子力显微镜	Veeco
原子力显微镜探针	VistaProbes	T300R-10