Streptococcus pneumoniae 可在心脏中形成界限清晰的非化脓性显微病变。本文概述了用于建立小鼠心脏微病变模型的实验方案，提供了利用显微镜观察微病变、区分早期与晚期微病变的方法指导，以及检测康复期动物心脏重构的技术手段。
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摘要
摘要
在菌血症期间，Streptococcus pneumoniae 可穿过血管内皮进入心肌，并形成充满细菌的微小病灶（微病灶），其显著特征是缺乏免疫细胞浸润。由于能够释放对心脏有毒性的产物，微病灶内的 S. pneumoniae 被认为可导致成人暴发性侵袭性肺炎球菌病中常观察到的心力衰竭。本文介绍了一种实验性小鼠感染方案，可在30小时内稳定诱导心脏微病灶的形成。文中提供了在苏木精与伊红（H&E）染色的心脏切片中识别微病灶的操作指导，并强调了早期与晚期微病灶在形态学上的区别。此外，还介绍了利用针对肺炎球菌荚膜多糖的抗体结合免疫荧光显微镜技术验证微病灶内 S. pneumoniae 的实验方案。最后，提供了一种抗生素干预方案，可用于挽救感染小鼠，并对康复期小鼠心脏中瘢痕组织的形成进行检测与评估。上述方案共同为研究肺炎球菌侵入心肌的分子机制、心肌细胞死亡、因暴露于 S. pneumoniae 引起的心脏重塑，以及心脏内肺炎球菌引发的免疫反应提供了有力工具。
引言
成人因社区获得性肺炎（CAP）住院时，存在发生不良心脏事件的风险，这会增加死亡率1-4。Corrales-Medina 等最近的一项研究发现，心脏并发症与27%的肺炎相关死亡有关，或为其直接原因3。肺炎链球菌（ pneumococcus）是CAP和脓毒症最常见的病因5，已有研究证实其与高达19%的住院成年患者发生不良心脏事件直接相关6。与肺炎相关的心脏不良事件按发生频率由高到低依次为：新发或加重的充血性心力衰竭、心律失常以及心肌梗死6。
最近的一项研究中 PLoS 病原体 布朗的文章 等，S. pneumoniae 被发现能够在侵袭性肺炎链球菌病（IPD）期间穿过心肌血管内皮，进入心肌组织，并在心室中形成充满细菌的散在性非化脓性显微病灶（微小病灶）。7在非人灵长类动物以及死于肺炎链球菌感染的个体的心脏样本中，均观察到心肌微小病灶形成的证据。同样，实验感染的小鼠也稳定地出现了心脏微小病灶。在小鼠中，微小病灶的大小和数量与菌血症的持续时间及严重程度、血清中心肌肌钙蛋白水平以及心脏电生理异常呈正相关。研究发现，细菌向心脏的移位机制与肺炎链球菌穿越血脑屏障并引发肺炎链球菌性脑膜炎的机制相同。 即胆碱结合蛋白A介导肺炎链球菌以层粘连蛋白受体和血小板活化因子受体依赖的方式侵袭血管内皮细胞8微小损伤的形成还需要肺炎链球菌的孔形成毒素——肺炎溶素，该毒素被发现可导致心肌细胞死亡。7.
肺炎链球菌引起的心脏微小病灶与由其他革兰氏阳性菌（包括Staphylococcus aureus）所致的化脓性软组织及心脏脓肿明显不同。这类微小病灶的特征是单个细菌病灶周围伴有中性粒细胞 浸润和纤维蛋白沉积9,10。S. pneumoniae形成的微小病灶体积更小，分布于整个受累心脏，且缺乏明显的免疫细胞浸润。在感染早期，由S. pneumoniae引起的微小病灶表现为受损或炎症组织区域，类似于心肌病的病理学表现。此阶段可能观察到少量单核细胞 ，但其存在时间短暂，病灶迅速呈现坏死样改变，内部充满细菌，并持续增大，直至动物死亡或接受抗菌治疗干预。重要的是，在抗生素治疗开始后3天内，原病灶部位可观察到大量免疫细胞浸润，同时伴有显著的胶原沉积。类似的心脏重构现象在心肌梗死后亦有报道，并对心脏功能产生持久影响11-15。因此，这些微小病灶可能是侵袭性肺炎球菌病（IPD）期间发生不良心脏事件的潜在解释，也可能解释了疾病恢复期幸存者中心脏相关死亡率升高的现象。
本文介绍了实验性小鼠IPD模型及心脏病变形成的实验方法，以及感染早期和晚期心脏微小病变的可视化技术。文中演示了对经抗菌干预后存活动物的心脏胶原沉积检测方案。本文章的目的是促进其他研究者对这一重要且新颖的肺炎链球菌病理学开展进一步研究。
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方案
注意：所有小鼠实验均经圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物护理与使用委员会审查并批准（方案编号 #13032-34-01C）。动物护理与实验方案遵循美国公共法律 89-544（《动物福利法》）及其修订案、公共卫生服务指南以及《实验动物护理与使用指南》（美国卫生与公共服务部） & 人类服务）。
1. 感染
- 选取10至12周龄的BALB/c小鼠，雌雄均可。
注：S. pneumoniae 4型菌株TIGR4是一种已测序的强毒力临床分离株16。 - 在37 °C、5% CO2条件下，将TIGR4菌株接种于Todd-Hewitt肉汤中培养，直至光密度（OD）620达到0.5（相当于1.0 × 108菌落形成单位[CFU]/mL）。以3,500 × g离心10分钟收集肺炎链球菌菌体，使用真空泵吸除上清液。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并稀释细菌，最终浓度为1.0 × 104 CFU/mL。
- 使用诱导室，以含2.5%气化异氟烷的氧气对小鼠进行麻醉。用钝头镊子轻捏脚趾以确认麻醉状态。
- 用一只手抓住麻醉后小鼠的颈背部皮肤，使其保持直立，使用带有27–30号针头的注射器，每只小鼠腹腔内（i.p.）注射100 µL S. pneumoniae 菌液（相当于攻击剂量为1.0 × 103 CFU）。注射后将小鼠放回笼中。小鼠通常在注射后30–40秒内苏醒。
- 让感染进程持续至少24小时（早期）或30小时（晚期）。
- 采用CO2窒息法处死小鼠。行颈椎脱位以确保小鼠死亡。在步骤1.6中通过取出心脏进一步确认死亡。
- 用酒精棉片消毒小鼠尾部，剪去2–3 mm组织段。采集2 µL血液，加入含1 U/mL肝素钠的PBS中，进行5次10倍系列稀释。将各稀释液接种于胰蛋白胨大豆血琼脂平板，于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。次日根据菌落计数推算菌血症水平。
- 将小鼠仰卧位固定于手术台上。胸部喷洒70%乙醇后擦干。使用手术剪和镊子打开胸腔，移除肋骨，横断膈肌以暴露心脏和肺脏。用剪刀剪断连接心脏的血管，小心用镊子取出心脏，避免镊子造成组织损伤。
- 用PBS冲洗心脏，然后将其放入组织标本包埋盒中，确保后续切片时可获得冠状切面。如需石蜡包埋，将包埋盒置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，次日送检进行石蜡包埋。
- 也可将组织置于置于干冰上的O.C.T.包埋剂中，进行速冻处理。
2. 心脏病灶内病灶及肺炎链球菌的可视化
- 将包埋在石蜡中的心脏组织切片，使每个组织切片均可见心脏的四个腔室。切片厚度为 5 µm。
- 脱蜡并用苏木精染色切片 & 伊红（H&E) 采用标准方法17.
- 查看 H&E 染色的心脏切片在低倍（100X，200X）和高倍（油镜：400X，1,000X）光学显微镜下观察，评估心肌中是否存在微小病变。在此获取 H&使用配备100倍、数值孔径1.3的Plan-NEOFLUAR物镜的蔡司Axioskop 2显微镜获取#38;E图像。
注意：在早期阶段，心脏病变可通过其不同的颜色外观加以区分，在某些情况下还可观察到免疫细胞（单核细胞和粒细胞），其中呈现为单核细胞的形态。在晚期病变中，尤其是在30小时观察到的病变，免疫细胞消失，取而代之的是大量类似空泡的病变。需要强调的是，尽管在心脏病变早期发育阶段可能出现免疫细胞浸润，但这似乎并非必要条件。
3. 微损伤内肺炎链球菌的免疫荧光显微镜检测
- 使用切片机将心脏组织在冷冻模具中切片至5 μm厚度，并将切片置于带正电荷的玻璃载玻片上。让冷冻的心脏切片自然解冻并风干。用10%中性缓冲福尔马林（25 °C时pH为6.8–7.2）固定切片10分钟。
- 将载玻片在PBS中洗涤（3次），每次5分钟；随后在含0.2% Triton X-100的PBS中通透15分钟，再用PBS再次洗涤。
- 用含10%山羊血清的PBS在载玻片上封闭组织切片1小时。
- 用PBS冲洗载玻片，加盖后在37 °C下用PBS配制的1:1,000兔抗4型肺炎链球菌抗血清与心脏切片孵育2小时。
注意：阴性对照应使用正常兔抗血清 - 用PBS洗涤后，加盖并在37 °C下用含10%山羊血清的PBS稀释的FITC标记山羊抗兔IgG抗体（1:2,000）孵育切片30分钟。
- 按照制造商说明，使用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）（5 mg/mL）对真核细胞核进行染色以实现可视化。洗涤后用FluorSave封片剂封片。
- 使用共聚焦显微镜系统在低倍和高倍放大下采集荧光图像。根据需要调整数值孔径以获得最佳成像效果。此处使用配备60倍、数值孔径1.42物镜的共聚焦系统采集荧光图像。
4. 脓毒症小鼠的抗生素救治
- 从感染的小鼠开始 腹腔注射 1.0 × 103 TIGR4 的菌落形成单位（CFU），如步骤 1 中先前所述。
- 从感染后30小时开始，给予药用级 氨苄青霉素 i.p. （80 mg/kg 体重）溶于 100 µl 生理盐水中，每 12 小时给药一次，持续 36 小时。在预定时间点取心脏组织，并按照步骤 1.6 所述方法进行石蜡包埋和切片处理。
5. 胶原蛋白沉积检测
- 使用二甲苯和梯度酒精洗涤，再用去离子水水化，采用标准方法对组织切片进行脱蜡和水化处理17。将切片用0.2%磷钼酸水溶液处理5分钟，然后用去离子水冲洗5分钟。
- 在室温下，用0.1%苦味酸-天狼星红染液对切片染色2小时。
- 用0.01 N盐酸洗涤切片3分钟，再用70%乙醇冲洗1分钟。
- 按照与步骤5.1中所述相反的顺序进行洗涤，对切片进行脱水处理，即依次使用浓度递增的乙醇和二甲苯对心肌组织切片进行梯度脱水。
- 用封片剂封片，用于显微镜下观察。
- 为识别胶原沉积区域，使用光学显微镜在低倍和高倍镜下观察染色组织切片中深红色染色的区域。心脏心室中任何呈现红色的区域即为胶原沉积部位；无此红色染色的区域则为未发生胶原沉积的健康组织。此处，使用配备20倍、数值孔径0.5物镜的显微镜采集偏振天狼星红染色图像。
注意：在健康组织中，心房会呈现红色染色。
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结果
通过H可视化微损伤&E
在IPD小鼠经TIGR4菌株腹腔注射（i.p.）攻击后，其心脏组织的H&E染色切片中可见心室存在心肌微小病灶。图1展示了感染后24至30小时（hpi）这些病灶体积的增大，病灶内可见更多的苏木精染色（即，紫蓝色）肺炎链球菌。微小病灶表现为类似空泡的形态，病灶周围邻近的心肌细胞呈现更深的伊红（红色）染色，病灶内可见双球菌，且通常缺乏免疫细胞浸润。约半数病灶邻近可见的血管。在感染后24至30小时，微小病灶的数量增多且体积显著增大。在30 hpi时，常可见细胞外细菌从病灶处穿过细胞间隙向外扩散。
使用免疫荧光显微镜观察S. pneumoniae
为了观察并确认 S. pneumoniae 确实存在于病灶内，采用了针对TIGR4菌株产生的4型荚膜多糖的免疫荧光染色（图2）。所获得的图像显示，在微小病灶部位...
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讨论
本报告展示了一种高度可重复的方法，用于在小鼠侵袭性肺炎球菌病（IPD）期间诱导由S. pneumoniae介导的心脏微小病灶，并介绍了可视化这些病灶的技术。通过给予小鼠超过免疫系统清除能力阈值的细菌剂量，引发重度菌血症，类似于人类脓毒症期间发生的状况，最终导致细菌移位至心肌。出于尚不明确的原因，S. pneumoniae在心脏中能够不受宿主免疫应答的抑制而持续复制。这一现象目前正处于深入研究之中，本出版物或可为其他研究者参与相关研究提供支持。
苏木精和伊红（H&E）染色可利用普通光学显微镜观察微小病灶，其中心肌细胞染成粉红色至红色，而心脏微小病灶及其内部的细菌则染成蓝色至深紫色。这种鲜明对比使得在感染后期病灶较大时能够轻松识别微小病灶。为确认心脏微小病灶中存在S. pneumoniae，采用针对TIGR4所携带的4型荚膜多糖的抗血清进行免疫荧光显微镜检测。重要的是，应根据实验攻毒所用肺炎链球菌菌株的血清型选择相应的特异性抗荚膜抗体。此外，研究者也可使用 commercially available 针对肺炎链球菌...
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披露
作者声明本研究不存在利益冲突。
致谢
本研究工作获得了美国心脏协会资助项目（编号13IRG14560023）以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI078972和HL108054（授予CJO）的支持。AOB的资助来自美国国立卫生研究院转化科学促进国家中心（NIH UL1 TR001120）以及F31 AI10417701项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Todd-Hewitt 肉汤 | Neogen | 7161A | |
| O.C.T. 包埋剂 | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| 正常山羊血清 | Abcam | ab7481 | |
| 抗4型肺炎链球菌抗血清 | Statens Serum Institut | 16747 | |
| 山羊抗兔 FITC 标记抗体 | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave 封片剂 | Millipore | 345789 | |
| Permount 封片介质 | Fisher Scientific | S70104 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma | A9393 | |
| 0.2% 磷钼酸 | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 苦味酸中 0.1% 天狼星红 | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N 盐酸 | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| 组织粘附载玻片 | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet 软膏 | Dechra | 12920060 | |
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | 未指定 | 标准 |
参考文献
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality. Circulation. 125, 773-781 (2012).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes. Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies. PLoS Med. 8, e1001048(2011).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin. Proc. 89, 60-68 (2014).
- Kumar, S., et al. Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection. Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).
- Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events. Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).
- Brown, A. O., et al. Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function. PLoS Pathogens. In press, (2014).
- Orihuela, C. J., et al. Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models. The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).
- Flick, M. J., et al. Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia. Blood. 121, 1783-1794 (2013).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).
- Arenal, A., et al. Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).
- Deneke, T., et al. Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).
- Bakker, J. M., et al. Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation. Circulation. 77, 589-606 (1988).
- Verma, A., et al. Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).
- Wu, K. C. Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI. Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293, 498-506 (2001).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
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