简化显微操作从法医“接触DNA”证据中回收单个人源生物微粒的增强型遗传分析

摘要

本文介绍了一种优化且高效的去除策略，用于收集“接触DNA”样本中存在的生物微粒，并结合一种增强的扩增方案，该方案涉及一步法5 µl微体积裂解/STR扩增，以实现对生物微粒供体的短串联重复序列（STR）图谱的有效回收。

摘要

DNA谱型可以从“接触DNA”证据中获得，这些证据包括微量的人体生物材料。目前用于回收痕量DNA的方法采用棉签或胶带对目标区域进行取样。然而，这种“盲目涂抹”的方法会同时采集到不同个体的细胞材料，即使这些个体的细胞在物品上的位置存在地理上的分离。因此，接触DNA样本中遇到的一些DNA混合物实际上是取样过程本身人为造成的。在某些情况下，受害者的DNA可能大量存在，从而掩盖了潜在作案人的DNA。

为了克服标准回收与分析方法所面临的挑战，我们开发了一种成本较低的“智能分析”方法，可显著提升接触式DNA证据的遗传学分析效果。本文描述了一种经过优化且高效的显微操作回收策略，用于采集接触式DNA样本中存在的生物微粒，同时介绍了一种增强的扩增策略，即一步法5 µl微体积裂解/STR扩增，从而能够从生物微粒供体中回收STR图谱。利用单个或少量（即“团块”）生物微粒，可获得单一来源的图谱。这些方法代表了法医接触式DNA证据中单个生物微粒分离与分析的替代性增强技术。尽管该方法并非每项法医调查所必需，但在涉及身体攻击（例如，勒颈）的案件中，若使用标准分析技术无法获得单一来源的作案者DNA图谱，则该方法可能具有重要价值。此外，本文开发的策略还为从多种其他非法庭科学来源的微量生物材料中获取单细胞水平的遗传信息提供了可能。

引言

接触DNA是一种微量生物证据，指个体在与物体或其他个体发生物理接触时，直接转移细胞物质（例如脱落的皮肤细胞）所形成的生物痕迹¹。已有文献报道，可从多种被触摸过的物体（如文件、床品、鞋子、枪支、饮水容器、笔、公文包把手）上获得DNA图谱^2-9。

在触体DNA证据分析中，成功回收所存在的微量生物材料是一个关键因素。触体DNA证据通常通过使用无菌棉签擦拭可疑区域来收集（称为“盲拭法”）。采用这种方法时，所收集的生物材料性质未知，且采样范围较为宽泛。物体表面的沟槽或缝隙可能会阻碍对本已微量的生物材料的有效回收。此外，采用“盲拭法”必然会同时采集到存在于物品上不同个体的细胞材料，即使这些个体的细胞在物品表面处于空间上分离的位置。混合DNA图谱的回收十分常见，尤其是对于模板量较低的DNA样本，解析此类图谱往往具有挑战性^8,10,11，而在许多情况下，这种混合图谱本身就是拭子采样过程所导致的继发性人为假象。如果其中一位供体的生物材料量极少，常规提取与分析技术可能无法获得次要贡献者的DNA图谱。此外，拭子的类型，以及其使用时为干燥状态还是湿润状态（预先用无菌水润湿），可能因不同拭子在吸水性、吸附性以及生物材料释放效率方面的差异，而影响所采集到的生物材料量¹²。标准提取方法还可能因样本所需进行的物理操作或转移步骤而导致额外的样本损失。

如上所述，用于回收生物材料的简单拭子技术可能导致痕量生物样本的丢失，以及由于无法分离单个生物组分而增加混合谱型的出现频率。因此，我们致力于开发更具有选择性和高效性的回收策略，以采集物体表面接触后遗留的细胞微粒。本研究所建立的用于触碰DNA证据中生物材料分析的策略（由于皮肤表皮外层发现的大多数细胞为死亡或濒死的角质形成细胞，其细胞核并不总是可见，因此本文中将此类微粒称为“生物微粒”¹³）包括以下步骤：1）通过凝胶膜从被触碰的物体和表面、穿着的衣物或直接从人体皮肤上采集生物材料（即 生物微粒）；2）对回收的生物材料进行显微镜检查，以确认潜在的人源生物材料已被采集；3）使用水溶性粘合剂对单个或少数几个生物微粒进行显微操作；4）采用微量（5 µl）一步法裂解/扩增反应，对采集的生物微粒进行常染色体DNA-STR分型分析。

该方法相较于传统分析方法具有多项优势。利用凝胶膜回收生物微粒，可在分析前对样本中存在的生物材料进行显微镜检查。尽管从接触DNA证据中回收的大部分生物微粒可能并非有核细胞，从而难以确定应选择哪些或多少生物微粒，但在分析前对这些样本进行显微镜检查，有助于寻找有核细胞，从而最大化DNA谱型检出的概率。采用水溶性黏合剂辅助显微操作收集生物微粒，可实现目标生物微粒直接转移至反应管中。该过程在显微镜下可视化操作，以确保生物材料成功转移。降低反应体积或采用微体积反应可提高检测灵敏度，同时降低每份样本的分析成本。这使得从单件物证中可分析更多数量的样本。鉴于接触DNA证据中生物微粒的遗传状态存在差异，建议对单件物品进行多次取样。

在此，我们展示了利用所开发的方案成功获取接触性DNA证据中生物材料供体的高度可判别性遗传谱型。所开发的生物微粒采集与DNA分型方法提供了一套全面的“智能”（即， 具体、可量化、可实现、现实且及时的基于分子的方法，用于对微量生物材料进行表征、分析与解读。尽管该方法最初是为接触性DNA证据的法医学分析而开发，但此处建立的策略也可应用于其他来源的生物材料，并提供了在单细胞水平获取个体识别信息的可能性。

方案

注意：人体体液由志愿者提供，采集过程经中佛罗里达大学机构审查委员会批准。已从每位捐献者处获得知情书面同意。

1. 从被接触物体和表面收集生物颗粒

1. 将凝胶膜裁剪至所需尺寸，确保其大小适合用作固体支撑的玻璃载玻片。例如，对于 3” x 1” 的玻璃载玻片，应使用 2” x 0.75” 的凝胶膜。
   注意：可根据需要减小材料的长度和宽度，但不应超过此尺寸。
2. 从凝胶膜上撕下白色背衬，并将凝胶膜贴附到显微镜载玻片上（图1A）。用力按压，以确保完全贴合。
   注意：凝胶膜表面有一层透明的顶部保护层，不应移除，以便在施加压力时不会污染凝胶膜表面。已制备的凝胶膜载玻片（带保护层）可在室温下保存，直至使用。
3. 准备使用凝胶膜样品时，用无菌镊子小心移除凝胶膜上的透明顶部保护膜（图1B）。将凝胶膜表面直接接触目标触摸物体或表面（图2），并施加少量压力，以确保生物颗粒高效转移至凝胶膜上。
   注意：若施加压力过大，可能导致玻璃载玻片破裂。
   注意：可将同一物体或表面的多个采样点收集到同一片凝胶膜上。
4. 通过将载玻片置于体视显微镜下（可使用透射光或落射照明）观察，确认生物颗粒已成功转移至凝胶膜上（图3）。建议使用约 20X 放大倍数以最佳观察凝胶膜较大区域，使用约 200X 放大倍数以最佳观察单个生物颗粒。
5. 将凝胶膜样品载玻片置于加盖的载玻片盒中，于室温保存，或立即用于染色和/或生物颗粒收集。

2. 可选的生物颗粒染色以辅助可视化观察

1. 将步骤1中制备的凝胶膜样品载玻片放置在水槽上方的染色架上。
2. 使用一次性移液管，将台盼蓝染色液完全覆盖凝胶膜表面（图4A）。室温孵育1-2分钟。
3. 倾斜载玻片，使多余的染色液流入水槽中去除（图4B）。
   注意：如有需要，可使用一次性移液管轻轻加入无菌水冲洗载玻片（图4C）。
4. 让载玻片自然晾干，然后进行生物颗粒的分离。使用体视显微镜（整体观察约20倍，观察单个生物颗粒约200-300倍）检查载玻片，以确认染色效果良好（图4D-E）。
   注意：载玻片可置于带盖的载玻片盒中，室温保存。

3. 分离目标生物颗粒以进行分析

1. 将适当数量的 0.2 ml PCR 管放入管架中，并正确标记各管。
2. 在指定的 PCR 扩增罩或生物安全柜中配制 STR 扩增混合液（参见 材料列表）。充分涡旋震荡混合液，然后在小型离心机中短暂离心。
   1. 每份样本所需扩增混合液体积为 3.5 µl；根据所需样本数量配制相应体积的主混合液。
3. 用移液器将 3.5 µl 扩增混合液加入每个 0.2 ml 管中。管盖轻轻拧松。
4. 将一片双面胶带贴在洁净的玻璃载玻片上，或直接贴在玻璃块上。
   注：此步骤用于在样品采集过程中固定 0.2 ml 管。
5. 将一片双面胶带贴在洁净的玻璃载玻片上，再在其上放置一片水溶性波峰焊胶带。
   注：该载玻片可储存于干燥器中以备将来使用。
6. 将第一个 0.2 ml 管放置于第 3.4 步准备好的带有双面胶的载玻片或玻璃块上。将此管暂置一旁，待采集样品时使用。
7. 将带有水溶性波峰焊胶带的载玻片置于显微镜下（低倍镜）。使用钨针尖端轻轻刮取胶带表面，使少量（或“球状”）粘性物质附着于针尖（图 5A）。
   注：粘性球的大小可根据拟采集的生物微粒数量进行调整。
8. 小心地将带有粘性物质的钨针从显微镜下取出，避免扰动针尖。必要时可将针置于针架中暂存。
9. 将已准备好的凝胶膜样品（来自步骤 1 和 2）放置于显微镜载物台上。调节焦距和放大倍数，直至可清晰观察到生物微粒。确定需采集的目标生物微粒。
   注：必要时可使用玻璃块支撑载玻片。
10. 取回带有粘性球的钨针，将其置于凝胶膜表面目标生物微粒上方。将针尖（带粘性物质）下压，使其与生物微粒接触（图 5B）。轻轻提起针尖，确认生物微粒已被采集。重复此操作，直至采集到所需数量的生物微粒。
11. 将已准备好的 0.2 ml PCR 管置于显微镜载物台上。调节放大倍数，使管底含扩增混合液的部分清晰对焦。
12. 小心地将钨针插入 0.2 ml PCR 管中，直至针尖进入扩增混合液。
    注：建议在显微镜下观察操作。
13. 将针尖保留在扩增混合液中，直至粘性物质完全溶解，生物微粒释放至溶液中（图 5C）。取出钨针，将 0.2 ml 管直立放置并轻轻拧松管盖。
14. 重复上述采集步骤以处理其他样品。每处理完一个样品后，使用预先浸润的酒精（异丙醇）擦拭纸清洁钨针。

4. 微量核酸联合分离（直接裂解）与常染色体短串联重复序列（STR）分型

1. 在指定的PCR扩增罩或生物安全柜中配制裂解缓冲液（参见材料）。每管加入1.5 µl裂解缓冲液，使总反应体积达到5 µl。盖紧管盖。
   注意：0.2 ml离心管中已含有3.5 µl扩增混合液以及第3步收集的生物颗粒。
2. 将样品放入热循环仪中，并按照以下循环条件进行扩增：75 °C 15分钟；95 °C 11分钟；34个循环（94 °C 20秒和59 °C 3分钟）；60 °C 10分钟；然后在4 °C保存。
   1. 扩增产物如需短期保存，可置于4 °C。

5. 产物检测——毛细管电泳（CE）

1. 在96孔板中，每孔加入10 µl CE运行混合液（9.7 µl去离子甲酰胺和0.3 µl片段大小标准品，参见材料）。向每孔加入1 µl扩增产物或等位基因阶梯标记物。
   注意：甲酰胺具有潜在致突变性，操作时应在化学通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。
2. 采用扩增试剂盒说明书或内部验证过的电泳条件进行电泳。
3. 使用STR分析软件对原始数据进行分析。

结果

从一名男性捐赠者穿着的衬衫领口（100% 涤纶）上回收的单个及成团生物微粒的代表性图像如图6（单个生物微粒）和图7（成团生物微粒）所示。这些生物微粒采用本文所述方案从衬衫领口回收：通过直接接触将生物微粒从领口转移至凝胶膜，用台盼蓝对回收的生物微粒进行染色，使用钨针和水溶性粘合剂采集生物微粒样本，并采用5 µl微体积裂解/STR扩增方法进行STR分析。图6和图7代表了从一件接触DNA物证样本中典型采集的生物微粒样本（20个单个/独立生物微粒和20组成团生物微粒）。每幅图像中标注了所采集生物微粒的长度和宽度（单位为微米）。每张图像还列出了从对应生物微粒中获得的STR等位基因百分比，以展示此类证据中生物微粒分析可能取得的不同程度的成功。从接触DNA样本中回收的生物微粒主要为死亡或濒死的角质形成细胞，因此并非每个采集的生物微粒都能获得具有证明力的STR图谱，这一点在图6和图7中可见。对于该衬衫领口样本，20个单个生物微粒中有14个（70%）获得STR图谱，20组成团生物微粒中有15组（75%）获得STR图谱。然而，各回收图谱的证明价值存在差异：单个生物微粒图谱的等位基因回收率为3–97%，成团生物微粒图谱为3–100%。由于成功率存在变异性，建议从每件接触DNA物证中采集多个生物微粒，以提高获得高证明力STR图谱的可能性。

从衬衫衣领的一个单独生物微粒样本中获得的STR图谱如图8所示（图左侧显示了该图谱来源的生物微粒）。从这一单独生物微粒中几乎获得了完整的STR图谱（30个等位基因中的28个，一个基因座未检出，图谱准确性通过与参考图谱比对得到验证）。所获得的图谱质量较高，各基因座间的峰高相对均衡，且未出现等位基因丢失现象。等位基因丢失和峰高不平衡等假象通常在模板DNA含量较低的样本中频繁出现。从衬衫衣领的一个聚集态生物微粒样本中获得的STR图谱如图9所示。该样本获得了完整的STR图谱（30/30个等位基因，图谱准确性通过与参考图谱比对得到验证）。如前所述，并非每一个采集到的生物微粒都能成功获得STR图谱。一个单独生物微粒DNA分型失败的示例见图10（单个生物微粒），仅检出3%的等位基因（30个中1个）。尽管该单个生物微粒未能成功分型，但从同一样本中其他生物微粒仍成功获得了具有高度鉴别价值的供体STR图谱。这说明了对同一物体进行多次单细胞/微粒取样的必要性。

本文所述用于触体 DNA 证据的“智能”分析方法已成功应用于从各种被触摸过的物体和衣物（例如 椅子扶手、汽车方向盘、手机、咖啡杯、香烟、笔、衬衫、短裤和毛衣）上回收具有证据价值的单一起源个体的单个或“聚集”生物微粒。然而更重要的是，该方法还已用于模拟身体接触/袭击混合样本中男性供体 DNA（单一起源）的检测与分型（例如 施害者抓握受害者手腕、颈部或衣物，或在性侵案件中与受害者床品发生接触的情况）。

图 1：用于生物颗粒采集的凝胶膜载玻片的制备。（A） 使用无菌镊子移除凝胶膜的白色背面保护层，以暴露其粘性背面。然后将凝胶膜在玻璃显微镜载玻片上压紧贴附。（B） 当凝胶膜样品准备用于生物颗粒采集时，使用无菌镊子移除顶部透明的保护膜。

图2：利用凝胶膜从不同基底采集生物微粒。 凝胶膜载片可用于从多种表面采集生物微粒。将凝胶膜直接接触目标物体或表面，并施加轻柔压力，使生物微粒转移至凝胶膜表面。图中展示了从（A）穿着过的衣物（外套衣领）、（B）接触过的物体（便携咖啡杯）以及（C）人体皮肤直接接触（男性手腕）采集生物微粒的示例。

图 3：磨损衣物（裤腿内侧）上的生物微粒。 生物微粒通过与物体表面直接接触转移到凝胶膜上。生物微粒可呈“团块”状或单个/独立的微粒形式（以红色箭头指示）。

图4：凝胶膜载玻片上生物颗粒的可选染色方法。 为更清晰地观察生物颗粒，可使用台盼蓝染色剂对凝胶膜样品进行染色。整个凝胶膜表面均被台盼蓝覆盖 (A)。染色1-2分钟后，轻轻倾斜载玻片，使多余的染液流下 (B)。可使用无菌水轻轻冲洗以去除残留染液 (C)。待载玻片自然风干后，可在显微镜下观察以确认染色效果 (D, E)。注意：并非所有生物颗粒都会呈现染色（即 显示蓝色）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：生物颗粒的收集与分析。（A）通过轻轻刮取，将少量（或“小球状”）水溶性波峰焊焊膏（“粘合剂”）收集至钨针尖端。（B）随后将粘合剂接触凝胶膜表面，以收集目标生物颗粒。单个或多个生物颗粒可被同一粘合剂小球收集。（C）在完成所需生物颗粒的收集后，将针尖置入含有0.2 ml PCR管中的扩增混合液中。保持针尖浸没于液体中，直至其完全溶解，并观察到生物颗粒释放至溶液中。整个收集过程的所有步骤均在显微镜下操作并实时观察，以确保生物颗粒成功收集与转移。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：衬衫衣领样本中的单个生物微粒。 使用凝胶膜从一名男性供体所穿衬衫衣领内侧回收生物微粒。生物微粒经台盼蓝染色后，显示了样本中识别出的二十个不同个体微粒的图像。在每张图像中，所采集的生物微粒以圆圈标出（红色圆圈表示成功获得基因谱型的微粒；黑色圆圈表示未获得基因谱型的微粒）。在成功获得谱型的生物微粒图像上方，标注了等位基因回收率（观察到的等位基因数占可能总数30的百分比）。请点击此处查看该图的高清版本。

图7：衬衫衣领样本中聚集的生物微粒。 使用凝胶膜从一名男性供体所穿衬衫衣领内侧回收生物微粒。生物微粒经台盼蓝染色后，显示了样本中识别出的二十个不同聚集生物微粒的图像。在每张图像中，所采集的生物微粒以圆圈标出（红色圆圈表示成功获得基因谱型的生物微粒；黑色圆圈表示未获得基因谱型的生物微粒）。对于成功获得基因谱型的每个生物微粒，均标出了等位基因回收率（观察到的等位基因数占可能的30个等位基因的百分比）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 8：从男性衬衫衣领单个生物微粒获得的常染色体 STR 图谱。 使用 5 µl 直接裂解/扩增反应，从单个生物微粒（左侧所示）获得常染色体 STR 图谱。通过与供体参考样本比对确定该图谱的准确性。在单个反应中同时扩增15个常染色体 STR 位点及AMELOGENIN（用于性别鉴定），并通过毛细管电泳进行分离。结果以电泳图形式显示。每个位点处各峰下方标注了等位基因编号。横轴表示片段大小（碱基对，bp），纵轴表示信号强度（RFU，相对荧光单位；在相应等位基因编号下方给出）。请点击此处查看此图的高清版本。

图9：从男性衬衫衣领上采集的成团生物微粒获得的常染色体STR图谱。 使用5 µl直接裂解/扩增反应，从一个成团的生物微粒（左侧所示）中获得了常染色体STR图谱。该图谱的准确性通过与供体参考样本进行比对确定。在单个反应中同时扩增了15个常染色体STR位点以及amelogenin（用于性别鉴定），并通过毛细管电泳分离。结果以电泳图形式显示。每个位点处每条峰下方标注了等位基因编号。横轴表示片段大小（以碱基对，bp为单位），纵轴表示信号强度（RFU，相对荧光单位；在每个对应的等位基因编号下方提供）。请点击此处查看该图的高清版本。

图10：从采集的生物微粒中未能获得常染色体STR图谱的示例。 左侧所示的单个生物微粒采自一件衬衫衣领的凝胶膜样本。由右侧所得的STR图谱可见，仅获得一个等位基因（共30个可能的等位基因）。各基因座处每个峰下方的数字表示等位基因编号。横轴表示片段大小（以碱基对计，bp），纵轴表示信号强度（RFU，相对荧光单位；在每个对应的等位基因编号下方给出）。请点击此处查看此图的高清版本。

讨论

本文描述了从触碰DNA证据中回收的生物微粒进行采集及增强型遗传分析的方法。该方法包括以下步骤：1）使用凝胶膜从被触摸的物体和表面、穿着过的衣物或直接从人体皮肤上采集生物物质（即，生物微粒）；2）对回收的生物物质进行显微镜检查，以确认潜在的人源生物物质的存在；3）利用水溶性粘合剂对单个或少量生物微粒进行显微操作；4）采用微体积（5 µl）一步裂解/扩增反应对采集的生物微粒进行常染色体DNA-STR分型。一步式封闭管反应的使用可减少因额外样本操作或转移至其他反应管所导致的污染和样本损失风险。增强型微体积（5 µl）一步裂解/STR扩增反应能够从单个或少量生物微粒中获得供体完整或具有法医学意义的STR图谱。该方法旨在从单来源和多来源的触碰DNA证据（例如，穿着过的衣物及其他日常用品、被触摸或操作过的物体和表面、皮肤/皮肤混合样本）中获取单一来源的STR图谱，并已成功应用于模拟性侵混合样本中男性供体的检测。

该方法还可进一步应用于其他体液/组织混合场景的评估，例如受害者抓伤施暴者的情况，其中施暴者的生物微粒仅有少量存在于受害者大量生物物质之中。此外，由于本研究建立的方法允许在单个生物微粒水平上进行分析，因此可用于更深入理解间接转移的性质与范围^14-19，即中介个体将某一表面、物体或人身上的DNA谱型转移至另一表面、物体或人²⁰。采用盲拭子取样法分析间接转移时，可能无法检出次要供体的微量物质。而本研究建立的方法可实现对单个或少数生物微粒的分析，因此结果不会因主要供体大量生物物质的存在而受到干扰。本研究所发展的方法学还可能对性侵案件中微量生物物质的分析具有重要意义，例如涉及手指插入阴道的情形，此时若能明确检出施暴者微量的皮肤细胞，对于证实存在性接触可能至关重要。

尽管从凝胶薄膜样本中收集生物颗粒的操作不涉及复杂或困难的步骤，但该过程中的某些关键步骤必须谨慎执行，以确保生物颗粒成功转移至下游反应容器。使用水溶性粘合剂收集生物颗粒时，必须在显微镜下进行观察（即， 在高倍放大（约200-300倍）下使用体视显微镜，以确保仅收集目标生物微粒。根据所用粘附“小球”的尺寸，可能会同时收集到额外的周围物质，其中可能包含生物性和非生物性材料。例如， 纤维、其他碎屑）。收集到非目标生物微粒可能导致混合DNA谱型的获得。收集到非生物材料可能会将抑制物引入微量裂解/短串联重复序列（STR）反应体系中。若使用同一枚粘性“小球”收集多个生物微粒，则先前收集的生物微粒有可能从粘性表面脱落。这种情况并不常见，但在收集大量生物微粒时可能发生。例如， 使用单个粘性“球”可捕获超过50个生物颗粒。若目标为大量生物颗粒，建议分多次收集较少数量的颗粒，但全部转移至同一个0.2 ml离心管中。收集完生物颗粒后，在将凝胶膜载玻片从显微镜载物台上取下并放置0.2 ml离心管时，必须小心操作，避免扰动针尖。将针尖插入0.2 ml管底部的扩增混合液时，应避免针尖接触管壁，以防样品黏附于管壁造成损失。粘性“球”的溶解通常较快（约30秒或更短，具体时间取决于“球”的大小），可在显微镜下观察溶解过程；但应缓慢地将针尖从扩增混合液中取出，以确保粘性物质完全溶解。若粘性物质尚未完全溶解，可将针尖重新插入液体中，直至完全溶解。

本文所述方案已针对法医生物学证据中的生物微粒和人类细胞进行优化。所选用的裂解缓冲液与选定的DNA-STR扩增试剂盒兼容。尽管可能存在其他可用的裂解缓冲液，但其在细胞裂解效率及后续分析兼容性方面的性能需由使用者自行验证。此外，本方案中描述的STR扩增试剂盒和扩增循环次数已针对单个或少量生物微粒的应用进行了优化。本研究选用了一款新一代STR扩增试剂盒，据报具有更高的稳健性和灵敏度，并已证实能够从单个或少量生物微粒中获得高质量的STR图谱。尽管目前市面上存在多种其他STR试剂盒，其推荐的扩增循环次数各不相同，但它们可能不具备足够的灵敏度，因此在用于本方案前需经过充分评估。

尽管所述方法已成功用于从单个或少量生物微粒中回收STR图谱，但图谱回收的成功率无法达到100%。因此，对于某些样本，可能仅获得有限的部分DNA图谱，甚至无法获得图谱。这主要是由于大多数生物微粒无法通过肉眼明确识别为细胞物质，所采集的生物微粒中核物质可能已降解，或在转移至反应容器前样本材料已从粘附介质上丢失，因而难以避免。因此，不建议仅对每件接触性DNA物品采集单个生物微粒样本进行分析。我们通常从单个凝胶膜样本中收集20组样本，并在未能获得合适STR图谱时，根据需要额外采集更多样本组。采集工作的唯一限制因素是凝胶膜样本上所存在的生物材料量（以及可能的分析成本，尽管微型反应体系使得额外样本的采集成本与单次标准反应体积相当甚至更低（例如，25 µl））。

本文所述的DNA分型方法提供了一种基于分子手段的分析策略，用于对来自接触性DNA样本的微量生物材料进行表征、分析与解读。然而，除确定供体身份外，还可从所回收的生物微粒中获取额外的遗传信息即， 供体生物材料的STR（短串联重复）图谱。组织或体液的来源（例如， 皮肤与唾液）可能为刑事案件调查提供关键的背景信息。若无法确定组织来源，其组织来源的模糊性可能被用作犯罪其他可能性的辩解依据。例如， 体液可能的沉积方式）可被推测。本文所述的生物微粒收集与分离方案可用于收集生物微粒或其他细胞（例如， 颊部、阴道）用于组织来源鉴定（mRNA 表达谱分析）^21-30）策略，该策略涉及微体积的逆转录（RT）和扩增反应。经过进一步优化，还可能开发出DNA/RNA共提取策略，从而允许对同一样本进行细胞类型鉴定（RNA）和短串联重复序列（STR）分型，包括来自接触性DNA证据的生物微粒。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SealRite 1.5 ml 天然微量离心管，无菌	USA Scientific	1615-5510	有多种替代供应商可供选择，但管子必须为无菌
0.2 ml 平盖 PCR 管，天然色	Phenix Research	MPX-200F	或同等产品
Kimwipes 擦镜纸	Fisher Scientific	06-666 和/或 06-666-11C
酒精消毒片	Fisher Scientific	06-669-62	替代品为 06-665-24（Fisher Sci）；也可使用大包装酒精湿巾而非单片包装
无菌水			18.2 MΩ，经高压灭菌
带磨砂端玻璃显微镜载玻片，3" × 1"：1 mm 厚	Fisher Scientific	12-544-3	其他品牌或尺寸亦可接受
一次性移液管	Fisher Scientific	13-711-9D	其他替代品亦可接受
台盼蓝溶液	Sigma	T8154
移液器：0.2–2、2–20、10–100、100–1,000 μl	多种品牌
无菌、防气溶胶移液器吸头	多种品牌
小型离心机	多种品牌
体视显微镜	Leica	M205C	其他型号亦适用，但必须能够实现最高 350 倍的放大倍数
GeneAmp PCR System 9700 热循环仪（银块或金块）	Life Technologies	N8050200 或 4314878	可使用其他型号和厂家的仪器，但需验证其与 STR 扩增试剂盒的兼容性
3130 遗传分析仪	Life Technologies	3130-01	替代型号：310 或 3500 遗传分析仪（Life Technologies）
GeneMapper 软件	Life Technologies	多种版本	软件有多个可用版本，均可使用
WF Gel-Film，x8 保留等级	Gel-Pak	WF-40-x8-A	4" × 4" 晶圆膜；可按其他尺寸规格订购
双面胶带	多种品牌
玻璃块，3" × 1.5" × 3/8"	McCrone Microscopes and Accessories	370-2	或同等产品
[header]
带支架的钨针	McCrone Microscopes and Accessories	106
3M 水溶性波峰焊胶带，5414 透明型	Allied Electronics	70113977
裂解缓冲液（forensicGEM Saliva，Zygem）	VWR	95043-992	裂解缓冲液以 10 μl 分装制备（可根据所需样本数量制备额外的主混合液）。每个样本使用 1.5 μl。配制 10 μl 裂解缓冲液（足够约 6 个样本使用）：6.9 μl 无菌水，2.1 μl 10× 缓冲液（蓝色），1 μl forensicGEM。
STR 扩增试剂盒，AmpFlSTR Identifiler Plus PCR 扩增试剂盒	Life Technologies	4427368	可使用其他 STR 扩增试剂盒，但需由用户自行验证性能。扩增混合液配制如下（每样本体积）：2.2 μl PCR 反应混合液，1.1 μl 引物组，0.2 μl（1 U）AmpliTaq Gold DNA 聚合酶。应配制足够样本数的主混合液。将 3.5 μl 配制好的混合液加入 0.2 ml 管中用于生物微粒收集。
AmpliTaq Gold DNA 聚合酶	Life Technologies	N808-0245
HiDi 去离子甲酰胺	Life Technologies	4311320
GeneScan 500 LIZ 片段大小标准品	Life Technologies	4322682
96 孔光学反应板	Life Technologies	N8010560
96 孔板密封垫	Life Technologies	4315933
性能优化聚合物，POP-7	Life Technologies	4363785	POP-4 等替代品亦可接受