小鼠气味辨别与习惯化测试

摘要

本文描述了一种用于检测啮齿类动物嗅觉系统的方法。通过嗅觉习惯化/去习惯化实验，研究人员可以判断小鼠是否对重复呈现的气味产生习惯化，以及在呈现新气味时是否表现出去习惯化反应。

摘要

本视频演示了一种用于确定小鼠嗅觉系统是否正常运作的技术。该测试有助于判断小鼠是否能够区分非社会性气味与社会性气味，是否会对重复呈现的气味产生习惯化，以及在接触新气味时是否表现出去习惯化。由于许多社会行为测试是通过测量实验动物对熟悉或陌生小鼠的反应来进行的，因此确认动物能够感知并区分社会性气味，有助于避免假阳性结果。在使用气味构建新环境或将嗅觉线索作为关联刺激的恐惧条件化等学习测试中，也存在类似的考量。嗅觉系统的功能缺陷会影响动物区分不同环境背景的能力，并损害其在恐惧条件化过程中与嗅觉线索形成关联的能力。

在气味习惯化/去习惯化测试中，反复向小鼠呈现多种气味。每种气味呈现三次，每次持续两分钟。研究者记录小鼠朝向气味的嗅探时间，以此作为嗅觉反应性的测量指标。典型的小鼠在多次呈现同一气味后，对该气味的反应会逐渐减弱（习惯化）。随后实验者呈现一种新的气味，小鼠会表现出对新气味嗅探时间的增加（去习惯化）。当新气味被反复呈现后，动物再次表现出习惯化。本实验方案包括水、两种或多种非社会性气味以及两种社会性气味的呈现。除了减少实验干扰因素外，该测试还可用于评估新构建的基因敲除、基因敲入和条件性基因敲除小鼠品系嗅觉系统的功能。

引言

小鼠依赖嗅觉来探索新环境、寻找食物、识别其他个体以及进行性行为^1-3。在开展涉及食物、社会互动或任何旨在诱发小鼠反应的气味相关行为学实验之前，研究人员必须首先确认实验动物是否具备正常的功能性嗅觉。嗅觉缺失或无法区分不同气味的情况可能导致多种行为学范式中出现假阳性或假阴性结果，因此应在进行其他类型行为学测试之前，先确认小鼠检测和区分气味的能力。

嗅觉习惯化/去习惯化测试最早于20世纪80年代被描述⁴。该测试已被穆阳（Mu Yang）博士和杰奎琳·克劳利（Jacqueline Crawley）博士改进并适用于小鼠⁵。这是一种简单且成本低廉的测试，可使研究者确认小鼠是否能够感知并区分不同气味。除了检测嗅觉功能外，该测试还允许研究者观察小鼠的一般行为，因此应在实验流程的早期进行。关于小鼠运动能力、焦虑迹象、活动水平以及对社交气味与食物气味反应的定性观察，可能提示可进一步开展测试的新方向。

在此项测试中，将浸有不同气味的棉签连续三次呈现给小鼠。每次重复呈现同一气味时，小鼠会对棉签产生习惯化，表现为每次接触后探索时间逐渐减少。当呈现一种新气味时，会发生去习惯化，正常小鼠会花更多时间探索该棉签，表明其能够区分当前气味与先前气味⁵。该测试每次仅对一只小鼠进行，包括45分钟的适应期，随后进行45分钟的测试。

方案

以下实验所用的成年雄性小鼠在贝勒大学培育并饲养，环境温度为 22 °C，光照周期为 14 小时光照/10 小时黑暗 hr 光照和 10 hrs 黑暗（20:00 至 6:00）昼夜节律。小鼠被给予 随意摄取 可自由获取食物和水。所有对小鼠的操作均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的要求，并经贝勒大学动物护理与使用委员会批准动物实验方案。小鼠在上午晚些时候至下午早些时候进行测试。以下所有操作过程中，实验人员应佩戴手套，以消除气味并防止污染。

1. 非社会性气味的制备

1. 每天测试时均需配制新鲜的非社会性气味物质。
   注意：实验人员在配制气味物质时应佩戴手套。
   1. 取3个离心管，每管加入10 ml水。
   2. 用移液器将100 µl香蕉提取物加入一个15 ml 锥形管中，并将100 µl 杏仁提取物加入另一个15 ml 锥形管中，以制备1:100的稀释液。 
      注意：第三个15 ml 锥形管仅装入水。

2. 社会性气味的制备

1. 在测试当天早晨准备新鲜的社会气味。从至少三天未清洁且含有相同数量小鼠的两个笼子中获取社会气味。获取与测试小鼠相同性别的小鼠所产生的社会气味。
   注意：这些气味应室温保存，并在4-6小时内使....

结果

按照所述方案，实验结果基于十只成年（出生后第90-120天）雄性C57BL/6J小鼠和八只雄性FVB混合背景品系（出生后第50-70天）小鼠获得。测试由一名研究者在多个日期内完成。图中每个数据点代表小鼠探索某种气味的平均时间。

当首次引入浸过水的棉签时，小鼠会花费大量时间探究这一新奇物体（图1：前三个数据点）。随着后续每次呈现，小鼠探究棉签的时间逐渐减少，表明已产生习惯化。当引入一种新气味时，小鼠探究棉签的时间出现上升，说明小鼠能够区分新气味与先前的气味（图1：杏仁气味数据点）。同样，随着该气味的多次重复呈现，探究时间再次逐渐减少。在三次试验中，小鼠对水棉签的嗅探时间表现出显著下降 F(2,18) = 3.8，p <0.05。当反复呈现杏仁气味时，小鼠也表现出类似的趋势 F(2,18) = 3.6，p <0.05。到第三次呈现气味时，小鼠仍表现出习惯化，但此时动物的行为已接近下限效应（图1：香蕉气味数据点）。下限效应是指行为反应已低至无法可靠检测进一步下降的程度。当呈现.......

讨论

本文提供的结果适用于小鼠。小鼠对新气味表现出强烈反应，随后迅速产生习惯化。该方法中的一个关键步骤是气味的制备。研究者需格外注意将不同气味彼此隔离，以防止交叉污染。另一个关键环节是棉签的呈现方式。研究者需要调试棉签头部的最佳位置，使小鼠能够探查棉签尖端，但不会将其撕咬损坏。测试中的一个重要组成部分是气味的选择。我们使用了三种非社会性气味，但增加其他气味也不困难。需要注意的是，所选气味之间应具有明显差异。若连续呈现相似气味，可能会出现“下限效应”。此外，当小鼠连续接触过多新气味时，其反应可能逐渐减弱。如果研究者希望增加更多气味刺激，则可能需要增加测试天数。每只小鼠的测试时间约为一小时。此外，在将特定气味作为实验条件纳入正式实验前，应先在对照小鼠中对所选气味进行调试和验证。

嗅觉习惯化/去习惯化是研究社会行为时需要包含的一项重要测试。三箱社会行为测试通常用于检测小鼠的社会行为缺陷。该测试包含一个实验动物探索新物体和新小鼠的条件，新物体和新小鼠分别放置在腔室两端的杯子下方。该测试还可以包含另一个条件，即在一个杯子下放置一只新小鼠，在另一个杯子下放置另一只小鼠（熟悉小鼠）。研究人员随后检查实.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠笼具	Allentown	标准小鼠笼
金属网盖	Allentown	BCU Mouse WBL 2500
垫料	Harlan	7090 Sani-Chips
棉签	VWR	89031-270	6” 木质手柄
香蕉香精	McCormick
杏仁香精	McCormick
实验室封口膜	VWR	89098-062
秒表	VWR	62374-000
腈类手套	VWR	82026
计时装置	VWR	61161-350
15 ml 圆锥形离心管	VWR	89003-294
2 L 烧杯	Pyrex	1003
Parafilm 封口膜	Parafilm	PM-992	4” x 250’
带盖 1 L 瓶	VWR	89000-240