本方案描述了生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒的合成及其作为多模态分子成像探针的应用。该纳米颗粒具有核-壳结构，其中位于纳米颗粒核心内的钆或锰离子可产生磁共振成像（MRI）对比效应。生物功能化外壳则包含用于荧光成像的荧光团以及用于分子靶向的靶向配体。
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本文内容
摘要
摘要
多模态分子成像技术利用多种互补的成像方法，可在细胞、亚细胞及分子水平上对生物过程进行可视化观察。这些成像探针有助于在活体（in vivo）条件下实时评估生物通路与机制，从而提升诊断与治疗效果。本文介绍了生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）的合成方案——这是一类新型探针，适用于多模态分子成像应用。该纳米颗粒整合了荧光成像与磁共振成像（MRI）两种成像模式，二者具有互补特性。PB NPs采用核壳结构设计，其中钆和锰离子嵌入普鲁士蓝晶格的间隙位置，可在T1和T2加权序列中均产生MRI对比效应。通过静电自组装方式，将荧光标记的亲和素包覆于PB NPs表面，实现荧光成像功能。随后，利用生物素化配体对亲和素包被的纳米颗粒进行修饰，赋予其分子靶向能力。实验检测了纳米颗粒的稳定性、毒性及其MRI弛豫率。最后，通过体外（in vitro）荧光成像与分子MRI实验，验证了这些生物功能化PB NPs的多模态分子成像能力。
引言
分子成像是指在细胞、亚细胞和分子水平上对生物过程进行无创且靶向的可视化1。分子成像能够在实时评估样本内源性通路和机制的同时，使其保持在原有的微环境中。通常，分子成像涉及施用一种外源性成像剂，该成像剂以小分子、大分子或纳米颗粒的形式存在，用于可视化、靶向和追踪所研究的相关生理过程2。在分子成像中已探索的多种成像模式包括磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、超声、光声成像、拉曼光谱、生物发光、荧光以及活体显微成像3。多模态成像是指将两种或多种成像模式相结合，通过组合提升对各种生物过程和事件的可视化与表征能力4。多模态成像充分利用了各成像技术的优势，同时弥补了单一技术的局限性3。
本文介绍了生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）的合成方案——这是一类新型的多模态分子成像探针。PB NPs可用于荧光成像和分子磁共振成像（MRI）。普鲁士蓝是一种颜料，由交替排列的二价铁（Fe(II)）和三价铁（Fe(III)）原子构成，形成面心立方网络结构（图1）。PB晶格由线性氰基配体组成，通过FeII-CN-FeIII连接方式形成，并在其三维网络中嵌入阳离子以平衡电荷5。利用PB晶格可嵌入阳离子的特性，可将钆离....
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方案
1. PB NPs、GdPB 和 MnPB 的合成
通过以下详细步骤，采用一锅法合成纳米颗粒（PB NPs、GdPB 或 MnPB）：
- 配制溶液 A：将 5 ml 的 5 mM 亚铁氰化钾(II) 溶于去离子水（DI 水）中。根据所合成的纳米颗粒类型（PB NPs、GdPB 或 MnPB），按以下方法配制溶液 B：
- 对于 PB NPs：配制 10 ml 含 2.5 mM 三氯化铁的 DI 水溶液。
- 对于 GdPB NPs：配制 10 ml 含 2.5 mM 硝酸钆(III) 和 2.5 mM 三氯化铁的 DI 水溶液。
- 对于 MnPB NPs：配制 10 ml 含 2.5 mM 氯化锰(II) 和 2.5 mM 三氯化铁的 DI 水溶液。
- 将溶液 B 加入圆底烧瓶中，在室温（RT）下以 1,000 rpm 搅拌烧瓶内容物。使用蠕动泵以约 10 ml/hr 的流速，将溶液 A 逐滴加入含有溶液 B 的圆底烧瓶中。
- 溶液 A 加入溶液 B 完成后，继续在室温下以 1,000 rpm 搅拌 30 分钟。停止搅拌并收集混合物。
- 将混合物分装至微量离心管中，以洗涤去除未反应的组分。向每份分装物中加入 5 M NaCl（每毫升反应混合物加 0.2 ml NaCl），以辅助离心收....
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结果
采用一锅合成法，可稳定地合成单分散的普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs，平均直径为 78.8 nm，多分散系数（PDI）= 0.230；由动态光散射仪测定）、GdPB（平均直径为 164.2 nm，PDI = 0.102）或 MnPB（平均直径为 122.4 nm，PDI = 0.124）（图 2A）。所合成纳米颗粒的实测 zeta 电位均低于 -30 mV（图 2B），表明颗粒因表面电荷而具有中等稳定性。这些纳米颗粒在 5 天内表现出良好的时间稳定性，其粒径（流体动力学直径）保持一致（图 2C）。
当与细胞共孵育时，纳米颗粒（PB NPs、GdPB 和 MnPB）在低于一定阈值浓度时对细胞表现出可忽略的细胞毒性（图3）。PB NPs 对 Neuro2a 细胞的细胞毒性研究表明，在与 Neuro2a 细胞共孵育且浓度低于 0.67 × 10-6 mg/细胞时，其细胞毒性可忽略不计（图3A）。通过将.......
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讨论
本文介绍了基于生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒的一类新型多模态分子成像探针的合成方法。由于荧光成像和分子磁共振成像（MRI）具有互补特性，因此将这两种分子成像模式整合到了纳米颗粒中。这些生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒具有核-壳结构。其合成的关键步骤包括：1）一锅法合成，获得由普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）、含钆普鲁士蓝纳米颗粒（GdPB）或含锰普鲁士蓝纳米颗粒（MnPB）组成的核；2）通过静电自组装方式，利用荧光标记的亲和素对纳米颗粒进行生物功能化修饰；3）利用稳定的亲和素-生物素相互作用，将生物素化配体（抗体）连接到纳米颗粒上。荧光标记的亲和素和生物素化配体共同构成了纳米颗粒的生物功能化外壳。
单锅法合成可制备兼具T1和T2磁共振成像（MRI）对比剂功能的普鲁士蓝纳米颗粒（PB NPs）、GdPB或MnPB。通过调整单锅法合成中顺磁性离子盐（硝酸钆(III)和氯化锰(II)）的用量（增加或减少），可改变纳米颗粒核心中负载的顺磁性离子（钆或锰）的含量，从而导致MRI信号强度相应增强或减弱。然而，对合成方案的这些修改可能导致纳米颗粒不稳定或发生聚集.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由谢赫·扎耶德儿科手术创新研究所（RAC 奖项编号 #30000174 和 30001489）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 六氰合铁(II)酸钾三水合物（K4Fe(CN)6·3H2O） | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| 氯化锰(II)四水合物（MnCl2·4H2O） | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| 硝酸钆(III)六水合物（Gd(NO3)3·6H2O） | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| 氯化铁(III)六水合物（FeCl3·6H2O） | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NG2蛋白多糖生物素偶联抗体（Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody） | Millipore | AB5320 | |
| 生物素化抗人嗜酸性粒细胞趋化因子-3抗体（Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3） | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a细胞系 | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10细胞系 | 实验室库存 | --- | |
| OE21细胞系 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1神经球 | 实验室库存 | --- | |
| Eol-1细胞系 | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| 聚(L-赖氨酸)氢溴酸盐（Poly(L-lysine) hydrobromide） | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| 甲醛（Formaldehyde） | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 牛血清白蛋白（Bovine serum albumin） | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 氨基放线菌素D（Aminoactinomycin D） | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| 吐温X-100（Triton X-100） | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace 钙黄绿素红-橙 AM（CellTrace Calcein Red-Orange, AM） | Life Technologies | C34851 | |
| 亲和素-Alexa Fluor 488（Avidin-Alexa Fluor 488） | Life Technologies | A21370 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424 | |
| 蠕动泵 | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| 超声破碎仪 | QSonica | Q125 | |
| 加热板/磁力搅拌器 | VWR | 97042-642 | |
| 超洁净铝箔 | VWR | 89107-732 | |
| 涡旋混合器 | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 ml 锥形微量离心管 | VWR | 87003-295 | |
| 15 ml 锥形离心管 | VWR | 21008-918 | |
| 试管架 | VWR | 82024-342 | |
| 一次性塑料比色皿 | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer毛细管样品池 | VWR | DTS1070 | |
| 离心过滤器，0.2微米离心柱 | VWR | 82031-356 | |
| 96孔细胞培养板 | VWR | 29442-056 | |
| 0.25%胰蛋白酶EDTA溶液（1x） | JR Scientific | 82702 | |
| 细胞培养级PBS（1x） | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT细胞增殖检测试剂盒 | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75培养瓶 | 89092-700 | VWR | |
| DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium） | Biowhitaker | 12-604Q | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10437-010 | |
| 青霉素-链霉素溶液（1x） | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | FV1200 | |
| 带腔室载玻片 | Thermo Scientific | 154534 | |
| 正方形显微盖玻片，1.5号 | VWR | 48366-227 | |
| 显微载玻片 | VWR | 16004-368 | |
| RPMI培养基 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| 3 T临床MRI磁体 | GE Healthcare | ||
| 100 ml圆底烧瓶 |
参考文献
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
- James, M. L., ....
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