本文介绍一种制备具有纤维梯度排列的电纺纳米纤维支架的方案，并探讨其在调控细胞形态与取向中的应用。纳米纤维支架在物理和化学性质上的梯度特征在生物医学领域具有广泛的应用前景。
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摘要
摘要
本实验方案旨在介绍一种简便的方法，用于制备具有纤维排列梯度的纳米纤维支架，并测试其在调控细胞形态和取向方面的潜在应用。通过一种新型的制备装置，可实现对支架中纤维排列程度的渐进式调控。通过在单轴取向的电纺纤维膜上逐步减少随机电纺纤维的沉积时间，即可实现纤维排列方式的改变。通过在收集器上设置一个与纤维沉积方向同轴移动的屏障/掩模，可便捷地控制纤维的组织结构。在组织工程应用中，可将脂肪来源的干细胞接种于此类支架上。干细胞因其在不同组织结构区域的位置不同而发生形态学变化，并可能根据其所处位置分化为不同类型的细胞。此外，纤维的梯度排列增强了纳米纤维支架的仿生特性，使其更接近肌腱-骨连接处天然胶原纳米纤维的取向结构，优于传统支架。通过纳米包封技术，梯度纤维还为在纤维支架中构建化学梯度提供了可能，从而进一步增强其在细胞-材料相互作用高通量筛选及界面组织再生中的应用潜力。该技术不仅能够制备连续梯度的支架，还可通过控制移动屏障/掩模的离散运动，实现分步式纤维结构的制备。
引言
纳米纤维因其结构和相对尺寸能够模拟细胞外基质，已成为组织工程中广泛使用的一种工具1。然而，某些天然组织界面（如肌腱-骨连接处）含有胶原纤维，其组织结构具有可变性，在朝向肌腱方向排列逐渐趋于有序，而在骨组织部位则排列逐渐变得松散2-5。因此，为了实现有效的组织再生，有必要构建一种能够有效模拟这种结构梯度的支架。
此前，已有研究关注纤维成分的渐变，特别是矿物质含量的变化6。然而，对于结缔组织中结构成分的重建仍鲜有探索。早期一项研究通过分析表面二氧化硅颗粒密度对大鼠颅骨成骨细胞增殖的影响，探讨了形态梯度效应，发现二氧化硅颗粒密度与细胞增殖呈负相关关系7。但此前研究中影响细胞增殖的形态变化主要与表面粗糙度有关，缺乏模拟纤维排列变化的能力7,8。最近一项研究尝试利用新型静电纺丝集电极制备能够模拟独特胶原纤维取向的支架9。尽管该研究成功制备出同时包含取向排列和随机分布纤维的支架，却未能模拟天然组织中所呈现的渐变结构。此外，由于该支架在取向纤维与随机纤维之间存在 abrupt 转变，导致其生物力学性能显著下降。迄今为止，尚无研究能够成功制备出具有从取向到随机纤维取向连续梯度的可用纳米纤维支架。我们近期的研究已成功重建出具有纤维排列梯度的纳米纤维支架，有望模拟肌腱-骨连接处天然胶原的组织结构10。本研究旨在介绍用于制备此类纳米纤维支架的实验方案，其结构可高度模拟天然肌腱-骨组织界面中的纤维排列特征。
梯度纳米纤维结构在多个领域具有广泛的应用前景。我们重点研究了将此类支架与脂肪源性干细胞（ADSCs）结合，应用于肌腱-骨连接处的组织工程，这些干细胞已被用于多种基质上的组织再生11-14。此外，ADSCs在多向分化潜能方面与骨髓间充质干细胞非常相似，且来源丰富，可通过简单的抽脂手术获取15,16。将这些细胞接种于具有梯度结构的纳米纤维支架上，可通过控制细胞分布，进一步增强其在组织工程中的应用潜力，从而促进细胞向不同类型组织分化。除了接种干细胞外，还可将信号分子包载于纳米纤维中，以调控细胞反应。将纳米包封技术与支架的结构梯度相结合，有助于研究细胞行为，或用于设计新型植入物及其表面涂层。包载具有功能的分子（如骨形态发生蛋白2（BMP2）），已证实可诱导成骨细胞分化15,16，有望进一步提升这些支架在组织工程中的应用效果10。
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方案
1. 溶液的配制
- 配制浓度约为 100 mg/ml 的聚(ε-己内酯) (PCL) (Mw = 80,000 g/mol) 溶液。将 PCL 溶于二氯甲烷 (DCM) 与 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 按 4:1 (v/v) 体积比组成的混合溶剂中，配制成 10% (w/v) 的溶液。
- 将溶液置于 20 ml 玻璃试管中进行混合。将玻璃试管放入超声波清洗器中处理 30 分钟，直至溶液呈半透明状。
2. 仪器准备
- 将制备好的PCL溶液加入一个装有21号平头针头的5 ml注射器中。
- 根据图1，将注射泵置于垂直静电纺丝位置。
- 使用带有2 cm × 5 cm开口区域的不锈钢间隙收集器，用于收集取向纤维基底。将收集器放置在距针尖12 cm处。
- 将直流（DC）高压电源连接至针头，并将收集器接地。确保收集器单独接地，且不与其他实验设备接触。
3. 电纺丝
- 将注射泵设定为 1.50 ml/hr，直至针尖形成的液滴在移除后立即被新液滴取代。然后将流速调至 0.50 ml/hr。
- 将电压调节至 12 kV。
- 继续静电纺丝，直至单向排列的纤维完全覆盖收集器上的间隙区域。
- 在小块玻璃片边缘涂上胶水，将间隙收集器上的纤维转移至玻璃片上。将玻璃片放置在一块与玻璃片尺寸相同且已接地的铝箔上方。
- 根据图3所示位置放置第二个注射器收集器。
- 将塑料掩膜固定在第二个注射器泵上，并将其置于收集器上方 2 mm 处。
- 若需实现纳米包封，则向 PCL 溶液中加入 1% (w/w) 的香豆素 6，并搅拌至溶液呈半透明状。
- 将 PCL 或 PCL/香豆素 6 溶液装入带有钝头 21 号针头的 5 ml 注射器中。设定垂直泵流速为 0.50 ml/hr，水平方向以 9 ml/hr 或约 1 mm/min 的速度拉动。
- 进行静电纺丝，直至掩膜几乎完全移出收集器区域，但边缘部分仍处于掩膜下方。
4. 纤维表征
- 使用磁控溅射仪在40 mA条件下镀铂40秒，将样品用双面导电胶带固定在金属载物钉上。
- 根据我们之前的研究17,18，通过扫描电子显微镜（SEM）观察纤维。
- 在加速电压为15 kV的条件下采集图像。
- 对单独的纤维样品进行快速傅里叶变换（FFT）分析，以测量纤维的取向性。有关通过FFT测量纤维取向性的详细信息可参考之前的研究19,20。
5. 接种干细胞。
- 将纤维样品浸入70%乙醇溶液中2小时以进行灭菌，然后用蒸馏水清洗纤维以去除任何污染物。
- 获取人脂肪来源间充质干细胞（ADSCs），并在37 °C、95%空气/5% CO2的条件下，于25 cm2培养瓶中进行细胞培养。每隔一天更换一次细胞培养基10。
- 用胰蛋白酶消化细胞并计数。具体操作为：从细胞培养瓶中移除所有培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞两次。随后加入1 ml预热至37 °C的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，使其覆盖细胞单层，并将培养瓶置于细胞培养箱中孵育2-3分钟。加入4 ml培养基，通过移液操作将细胞从表面完全冲洗下来。离心细胞悬液后，将细胞沉淀重新悬浮于培养基中。使用血细胞计数板进行细胞计数。将约1 × 104个细胞接种至置于35 mm培养皿中的纳米纤维支架上，分别培养3天和7天。
- 使用荧光素二乙酸酯（5 mg/ml丙酮溶液）（FDA）对细胞进行染色，然后使用荧光显微镜观察样品。具体操作为：向培养皿中加入100 μl FDA溶液，孵育30分钟。在进行荧光成像前，用PBS清洗细胞三次。根据我们之前的研究10，使用定制的Matlab程序分析细胞取向。
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结果
通过该方案，制备出具有组织梯度的纤维膜。图3展示了在纳米纤维支架不同位置拍摄的扫描电镜（SEM）图像。从定性角度来看，可以观察到纤维排列从0 mm处的单轴取向（图3A）逐渐过渡到6 mm处的随机分布（图3D）。快速傅里叶变换（FFT）可对纤维取向提供定量分析，具体的定量分析方法详见文献19。在0 mm处的纤维其FFT结果表明纤维具有取向性，而在6 mm处的FFT图样则表明纤维呈随机排列。在扫描电镜图像中（图3），纤维结构从有序排列向越来越随机的沉积方式呈现出明显的渐变过程（图3B–C）。
ADSCs 根据其在纳米纤维支架中的位置发生了形态学变化。图 4 显示了使用荧光显微镜（Zeiss）在培养 3 天（图 4A–D）和 7 天（图 4E
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讨论
该实验方案中最关键的步骤是梯度支架的制备。覆盖在收集器上的掩膜必须以恒定速度移动，以确保纤维支架内部形成渐变结构。此外，正确配制PCL溶液也至关重要，以保证静电纺丝的成功。建议在静电纺丝前检查纤维的形貌，尤其是在包封香豆素-6之后，可能需要更高的电压才能实现正确的静电纺丝。
此外，该方案可实现纤维排列的离散梯度构建。然而，该方案所获得的支架厚度存在不均匀性，可能限制其在力学性能方面应用。纤维随机沉积增加的区域将比取向排列区域更厚。该方案也无法重现肌腱-骨连接处的化学成分。为成功模拟连接处天然的矿物质含量，需要构建矿物质梯度。具有矿物质成分梯度和结构排列梯度的纤维支架的制备将进一步被探索，以更好地复制肌腱-骨界面组织中的完整天然微环境。
目前，这是首个用于制备具有组织梯度的静电纺纳米纤维支架的实验方案。以往的研究虽已制备出包含随机排列和定向排列纤维的支架，但二者仅为两个独立区域，其间组织结构发生 abrupt 转变9。梯度结构可实现对细胞取向及其细胞外基质沉积的调控，从而有助于在整个组织构建物中形成梯度化的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了内布拉斯加大学医学中心启动资金和美国国立卫生研究院（资助号 1R15 AR063901-01）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚己内酯 | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| 二氯甲烷 | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| 香豆素6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| 脂肪来源干细胞 | Cellular Engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 26140-111 | |
| 荧光素二乙酸酯 | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-改良伊格尔培养基 | Invitrogen | a10490-01 | |
| 丙酮 | Fisher Scientific | s25120a | |
| 磷酸盐缓冲液 | Invitrogen | 10010023 | |
| 载玻片 | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| 注射泵 | Fisher Scientific | 14-831-200 | 单通道注射泵 |
| 超声波清洗器 | Branson | 1510 | |
| 高压直流电源 | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| 扫描电子显微镜 | FEI | Nova 2300 | |
| 荧光显微镜 | Zeiss | Axio Imager 2 |
参考文献
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