利用小分子调控分化及后续葡萄糖饥饿法从人诱导性多能干细胞中衍生高纯度心肌细胞

摘要

本文介绍一种稳定的人心肌细胞诱导方案，该方案结合了小分子调控的心脏分化与葡萄糖剥夺介导的心肌细胞纯化，可实现高纯度心肌细胞的制备，适用于心血管疾病建模与药物筛选。

摘要

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为重要的细胞来源，用于解决基础研究和转化应用中缺乏原代心肌细胞的问题。为了将hiPSCs分化为心肌细胞，研究人员已开发出多种方案，包括基于拟胚体（embryoid body, EB）的分化方法和生长因子诱导法。然而，这些方法在生成纯化心肌细胞的效率方面较低，且结果变异性高。近期，一种基于小分子、通过调控Wnt/β-Catenin信号通路的分化方案被证明可高效促进心脏分化。采用该方案， consistently 观察到超过50%–60%的分化细胞为心肌肌钙蛋白阳性的心肌细胞。为进一步提高心肌细胞纯度，利用心肌细胞与非心肌细胞之间的代谢差异，对分化细胞实施葡萄糖饥饿处理，以特异性清除非心肌细胞。通过这一筛选策略，我们在分化细胞群体中心肌细胞与非心肌细胞的比例 consistently 提高了30%以上。这些高度纯化的心肌细胞应能增强基于人iPSC的研究结果的可靠性 体外 疾病建模研究和药物筛选实验。

引言

由于需要进行侵入性心脏活检、难以解离为单个细胞以及体外培养时细胞长期存活率差，原代人类心肌细胞难以获取。鉴于原代人类心肌细胞的缺乏，患者特异性的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）技术已被视为基础研究以及疾病建模和药物发现等临床与转化应用中强有力的心肌细胞替代来源¹。早期将多能干细胞分化为心肌细胞的研究采用的是拟胚体（EB）分化方案，但该方法在心肌细胞生成方面效率较低，因为拟胚体中跳动的心肌细胞通常不到25%^2,3。相比之下，使用细胞因子activin A和BMP4的单层培养分化方案比拟胚体法效率更高，但该方案仍相对低效，需要昂贵的生长因子，且仅适用于少数几种人类多能干细胞系⁴。最近，通过调控Wnt/β-Catenin信号通路，开发出一种高效、基于hiPSC单层培养的心肌细胞分化方案⁵。这些hiPSC-CM表达心肌肌钙蛋白T和α-辅肌动蛋白，这两种肌节蛋白是心肌细胞的标准标志物⁶。本文所述方案即基于该小分子诱导、无饲养层细胞、单层分化方法的改进版本^5,7。我们可在7–10天后获得跳动的心肌细胞（图1）。然而，在心肌细胞分化后获得约50%跳动细胞的情况下，免疫染色结果持续显示存在一群不表达心肌细胞特异性标志物（如心肌特异性肌钙蛋白T和α-辅肌动蛋白）的非心肌细胞。为进一步纯化心肌细胞并清除非心肌细胞，将异质性的分化细胞群体置于极低葡萄糖培养基中进行多天的葡萄....

方案

注意：本实验方案中使用的所有试剂的供应商信息均已列在表1和材料清单中。所有与细胞接触的溶液和设备必须无菌，并应相应地采用无菌操作技术。除非另有说明，所有细胞培养孵育均应在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中进行。在本方案中，所有分化操作均在6孔板中进行，hiPSCs被接种于其中。完成分化和纯化后，细胞可被解离并重新接种，用于后续实验。

1. 培养基制备

1. 对于 E8 培养基，为每种培养基组分（NaHCO₃、L-抗坏血酸-2-磷酸、亚硒酸钠、转铁蛋白、胰岛素、FGF2、TGFB1）分别配制储存液，并将储存液保存于 -20 °C。将适量储存液加入 DMEM/F12 培养基瓶中，过滤除菌。储存液组分及 E8 培养基的溶液浓度与反应体系设置详见表 1。
2. 对于细胞外基质溶液，于 4 °C 过夜解冻基底膜基质（通常浓度为 10 mg/ml）。Matrigel 常用于多能干细胞培养，因为人类多能干细胞可通过 α-6-β-1 整合素很好地黏附于该材料⁹。解冻后，使用预冷的枪头和离心管在冰上分装成每份 2.25 mg（250 µl），并保存于 −80 °C。
   1. 使用细胞外基质溶液（ECMS）预包被培养板时，于冰上解冻并分装 ECMS。在冰上按 1:200 的比例将....

结果

hiPSC 分化过程中的形态学变化。

在无饲养层培养板中培养的hiPSC以扁平的二维集落形式生长。当细胞融合度达到约85%时，使用6 µM CHIR处理hiPSC以诱导分化（图1A）。CHIR处理24小时后，观察到大量细胞死亡，这是一种正常且常见的现象。经过两天的CHIR处理后，hiPSC继续向中胚层命运分化。与hiPSC集落中的细胞相比，第2天细胞的细胞体积增大，并通过细胞分裂使细胞数量增加（图1B）。在第5天，中胚层细胞被引导进入心肌谱系（心脏中胚层）。此时，细胞开始聚集并形成特征性的树枝状结构（图1C）。到第10天，树枝状结构变得非常明显，心肌细胞开始自发搏动（图1D）。终末分化的心肌细胞在此之后不再增殖。分化方案的时间线见图2。

免疫染色和流式细胞术结果表明，通过葡萄糖饥饿法可实现心肌细胞的纯化。

讨论

获得大量高纯度的由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的心肌细胞，对于基础心脏研究以及临床和转化应用均至关重要。近年来，心脏分化方案取得了巨大改进，已从基于拟胚体并利用心源性生长因子的方法²，发展到基质夹心法¹²，最终演进为小分子调控的单层培养方法⁵。在上述各种方案中，本文所述方案通过使用小分子CHIR和IWR调控Wnt/β-catenin信号通路，对不同hiPSC细胞系均表现出最高且最可重复的心脏分化效率^5,7。具体而言，未分化的hiPSC首先通过GSK3-β抑制剂CHIR诱导中胚层分化，随后使用Wnt信号抑制剂IWR1促进心脏分化。这些Wnt信号通路调控的连续步骤，结合心脏谱系诱导阶段的胰岛素去除，实现了高效的心脏分化。CHIR是一种常用于中胚层诱导的GSK3-β小分子抑制剂，但其他GSK3-β抑制类小分子也已在心肌细胞分化方案中得到测试¹¹。在后续的Wnt小分子抑制剂选择上也有多种替代方案。例如，近期一篇专注于化学成分明确条件下将多能干细胞分化为心肌细胞的研究报道，采用2 µM Wnt-C59实现有效的Wnt信号抑制和心脏中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Matrigel（9-12 mg/ml）	BD Biosciences	354277
RPMI 培养基	Invitrogen	11835055
无葡萄糖 RPMI 培养基	Invitrogen	11879-020
B27（不含胰岛素）	Invitrogen	A1895601
B27 补充剂（含胰岛素）	Invitrogen	17504-044
青霉素-链霉素抗生素	Invitrogen	15140122
胎牛血清	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
ROCK 抑制剂 Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
细胞刮	Fisher	08-100-240
冻存管	Fisher（NUNC 管）	375418
TrypLE Select 酶	Invitrogen	12563-011