Caulobacter crescentus 的同步化以研究细菌细胞周期

摘要

细菌细胞的同步化对于细菌细胞周期与发育研究至关重要。Caulobacter crescentus 可通过密度梯度离心实现同步化，从而为细菌细胞周期研究提供一种快速而有效的方法。本文提供了Caulobacter细胞同步化的详细实验方案。

摘要

细胞周期对所有细胞的生长、基因组复制和发育都至关重要。在细菌中，细胞周期的研究主要集中在非同步化细胞上，这使得确定细胞周期进程、基因组复制和分裂所需的时间顺序事件变得困难。Caulobacter crescentus 为研究细菌细胞周期提供了一个极佳的模型系统，可通过密度梯度离心法将细胞快速同步于 G0 期。细胞周期同步实验已被用于阐明染色体复制与分离的分子事件，绘制调控细胞周期进程的遗传调控网络，并鉴定不对称细胞分裂所必需的极性信号复合物的形成过程。本文提供了一种快速同步 Caulobacter NA1000 细胞的详细实验方案。该同步方法既可用于大规模实验（如基因表达谱分析和蛋白质印迹检测），也可用于小规模实验（如显微镜观察或流式细胞术检测）。Caulobacter 具有快速同步能力和高细胞得率，使其成为研究细菌细胞周期的强有力模型系统。

引言

细菌细胞周期同时调控基因组的复制和子细胞的分裂。尤为重要的是，由于抗生素耐药性正日益威胁公共健康，细菌细胞周期为抗生素的研发提供了一个尚未充分开发的靶点。

在细菌 Caulobacter crescentus 中，每次细胞周期都会发生不对称分裂，产生两种命运不同的子代细胞（图 1A）^1,2。其中一个子代细胞继承鞭毛，具有运动能力；而另一个子代细胞则继承菌柄，处于固着状态。一个整合的遗传回路通过转录调控、磷酸化信号传导以及受控的蛋白质降解来调控细胞周期进程和细胞命运³。此外，染色体复制及其伴随的分离过程确保每个子代细胞恰好含有一份染色体拷贝⁴。重要的是，在可同步的 NA1000 菌株中，可通过胶体二氧化硅密度梯度离心快速分离这两种细胞类型^5-7，从而高效地将游动子细胞从群体中其他细胞中分离出来（图 1B）。分离得到的游动子细胞随后将同步地经历不对称细胞分裂。本文详细描述了用于同步 Caulobacter NA1000 菌株的实验方案，并提供了大规模和小规模同步操作的实验步骤及常见问题解决方案。该实验方法为研究 Caulobacter 细胞周期与细胞命运的时空调控提供了强有力的工具。

方案

1. 大规模同步化——适用于蛋白质印迹、微阵列/RNA测序及其他需要大量材料的检测方法

1. 从冻存菌种或平板中接种，培养5 ml 在 PYE 培养基中于 28 °C 摇床培养 NA1000 菌株过夜。
2. 接种步骤1中0.5 ml的细胞 在25 ml M2G（表1-2）中于28 °C振荡培养，直至菌液达到OD₆₀₀ 介于 0.5 和 0.6 之间。
3. 将细胞接种至1 L M2G培养基中，在28 °C下振荡培养。
4. 一旦 OD₆₀₀ 达到0.5至0.6时，使用液体封片相差显微镜确认游动细胞的存在。取1 µl 将细胞置于载玻片上，加盖盖玻片，通过相差显微镜观察成像。通过观察群体中快速游动的细胞，确认游动细胞的存在。
5. 在JA-10转子中，4 °C、7 k × g离心15分钟。
6. 弃去上清液，加入180 ml冷M2培养基（表1-2），用血清移液管轻轻重悬所有细胞。弃去沉淀松散的细胞，这些是分裂前且具菌柄的细胞。
7. 加入60 ml冷的胶体二氧化硅溶液（加入前务必充分混匀胶体二氧化硅悬液），并充分混匀细胞悬液。
8. 将细胞悬液分装至八个30 ml离心管中，在JA-20转子中于4 °C、6.4 k × g条件下离心30分钟。
   注意：应观察到两条 distinct 的条带；游动型细胞位于下方条带，而带柄细胞/分裂前细胞位于上方条带图 1B).
9. 小心吸去上层条带，移除液体至距游动细胞条带（下层条带）约1 cm处。
10. （关键步骤）使用巴斯德吸管小心移除游动细胞带，转移至一支洁净离心管中。为去除胶体二氧化硅，加入预冷的M2培养基至管满，随后在JA-20转子中以6.4 k × g于4 °C离心10分钟。
11. 小心弃去上清液，将细胞重悬于20 ml预冷的M2溶液中，在4 °C条件下使用JA-20转子以6.4 k × g离心10分钟。
12. 将所有沉淀重悬于30 ml冷M2培养基中，并测定OD值₆₀₀ 使用分光光度计测定，并以冷M2培养基作为空白对照。保留1 µl 进行相位成像以检测游动细胞；90–95% 的细胞应为游动细胞。
13. 在4 °C、JA-20转子6.4 k × g条件下离心5 min。将细胞重悬于28 °C的M2G培养基中，使A₆₀₀ 约为0.3–0.4，并在28 °C开始振荡培养。
    注意：通常每1升不同步细胞可获得30至60 mL的游动细胞培养物。
14. 开始记录时间点（野生型培养物分裂大约需要135–140分钟） ^8,9在每个时间点，测定OD值₆₀₀. 检查 OD₆₀₀ 分裂后约为初始OD的2倍₆₀₀.
15. 在所需时间点取1 mL培养物，于台式离心机中以最大速度离心30秒，迅速倾倒或抽去上清液，将细胞沉淀在液氮中快速冷冻。将细胞保存于-80 °C，直至进行后续分析。

2. 小规模同步化——适用于显微镜观察的最佳方法

1. 从冻存菌种或平板中接种，于 M2G 培养基中在 28 °C 下振荡培养 5 ml 过夜培养物。
2. 将过夜培养物按 1:3 比例稀释至 15 ml M2G 培养基（见表 1-2），继续培养至对数中期（OD₆₀₀ = 0.5–0.6）。
3. 在 4 °C 条件下，使用 JA-20 转子以 6.4 k × g 离心 10 分钟 ，弃上清，用 1 ml 冰冷的 M2 培养基（见表 1-2）重悬菌体，转移至 2 ml 微量离心管中。
4. 在微量离心管中以 15 k × g 离心 3 分钟收集菌体，吸除上清，将菌体沉淀置于冰上，用 900 µl 冰冷的 M2 培养基重悬。
5. 加入 900 µl 冰冷的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的胶体二氧化硅溶液，在微量离心管中于 4 °C 以 15 k × g 离心 20 分钟 。
6. （关键步骤）小心吸除或用移液器移走上层的有柄/前分裂细胞条带，收集底部的游动细胞条带至新的微量离心管中。
7. 用 1 ml 冰冷的 M2 培养基洗涤游动细胞两次，每次在 15 k × g 条件下离心 3 分钟。
8. 最后一次离心前，将细胞转移至预冷的 1 ml 玻璃试管中，以 M2 培养基为空白对照，测定细胞的 OD₆₀₀ 值。
9. 将最终的细胞沉淀重悬于 28 °C 的 M2G 培养基中，使 OD 值介于 0.3–0.4 之间，并在 28 °C 下振荡或滚动培养细胞。
   注意：通常可获得 2 至 4 ml 的游动细胞培养物。
10. 进行显微镜实验时，在预定时间点取 1 µl 细胞样品滴加至 M2G 琼脂糖垫上，用于成像。

结果

同步化通常会产生两条细胞条带（图1B）：密度较高的游动细胞条带和密度较低的有柄细胞/分裂前细胞条带。为确保同步化效率，常见的对照措施包括监测OD₆₀₀值，并在细胞周期的不同时间点通过Western blot检测CtrA蛋白水平。在整个细胞周期过程中，OD₆₀₀应大约增加2倍（图2）。对细胞周期主调控因子CtrA进行Western blot分析是验证良好同步性的有效对照方法（图2）。CtrA在游动细胞中发挥作用，抑制DNA复制，并在DNA复制启动时被降解¹⁰。随后在细胞周期的后期重新合成CtrA，激活一系列发育相关基因的转录，包括鞭毛的多种组分^11,12。成功的同步化应呈现出CtrA蛋白水平的振荡变化模式。

讨论

细菌细胞周期是生命的基本过程，对于生长研究以及作为下一代抗生素的作用靶点具有重要意义。本文详细介绍了模式生物——C. crescentus NA1000 的快速同步化操作步骤，该生物常用于研究细菌细胞周期和不对称细胞分裂。该方法适用于蛋白质印迹（western blot）、基因表达谱分析以及荧光显微镜检测，以研究细菌细胞周期在时空上的调控机制。

该方案快速，可获得健康的同步化细胞。其他同步化方法需要长时间的细胞饥饿处理，并依赖严紧反应将细胞周期阻滞在相同阶段，从而导致细胞状态与对数生长期的培养细胞差异较大。 ¹³。 当 “婴儿培养箱” 以及其他表面固定方法已成功应用^14,15，它们通常产生的同步化细胞产量较低。本文提供的密度梯度离心方案可获得更高纯度和更高产量的同步化细胞 C. crescentus NA1000 游动细胞。

在同步化过程中可能会出现其他复杂情况，从而导致潜在问题。准备一台带有液体封片功能的相差显微镜，用于在细胞同...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅（Percoll）	Sigma-Aldrich	P4937
胶体二氧化硅（Ludox AS-40）	Sigma-Aldrich	420840
JA10 转子	Beckman-Coulter	369687
JA20 转子	Beckman-Coulter	334831
硫酸亚铁螯合溶液	Sigma-Aldrich	F0518
30 ml 离心管	Corning	8445
Na2HPO4	EMD	SX0720-1
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
NH4Cl	Amresco	0621-500g