本方案中所述的直立成像方法可实现对发育中黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）卵的两极进行精细可视化观察。这种端面视角为了解卵泡上皮中多种细胞类型的排列方式和形态特征提供了新的观察角度。
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摘要
摘要
Drosophila melanogaster 的卵子发生为研究多种发育过程提供了理想体系，因为其卵巢结构相对简单，特征明确，且适于遗传学分析。每个卵室由生殖系细胞构成，外围包裹着一层单层上皮的体细胞滤泡细胞。在特定发育阶段，部分滤泡细胞会分化为多种不同类型的细胞。常规技术主要提供卵室的侧向视图，因而对滤泡细胞的排列与身份识别具有局限性。本直立成像方案描述了一种制片技术，可利用标准共聚焦显微镜实现卵室全新的垂直视角观察。首先将样品以侧向（水平）位置封片于载玻片上两层明胶甘油之间；随后将包裹卵室的凝胶切割成小块，转移至盖玻片，并翻转使卵室呈直立状态。制备好的卵室样品可在正置或倒置共聚焦显微镜上进行成像。该技术使得从新的视角对滤泡细胞的命运决定、空间排列、分子标记以及卵的发育过程进行更精细的研究成为可能。
引言
对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的研究极大地增进了我们对多种生物学现象遗传调控机制的理解。特别是卵子发生过程中的卵发育研究已十分广泛，因为卵子发生为研究多种不同的发育过程提供了可行的模型，包括组织模式形成、细胞极性变化、细胞周期转换以及翻译调控1,2,3,4。在卵子发生过程中一个重要的形态发生事件是被称为边界细胞（border cells）的一类细胞的特化、获得运动能力及其迁移过程（详见综述5）。由于细胞迁移是动物形态发生的关键特征之一，且该过程的遗传调控机制在进化上高度保守，因此在果蝇中发现的机制很可能在其他生物体系中也具有重要意义。因此，我们正在研究边界细胞迁移的分子调控机制。为开展相关研究，我们开发了一种新方法，用于观察发育中卵子的前端极区——即边界细胞起源的位置，以详细探究其发育过程。
在卵巢内，沿着称为卵管（ovarioles）的链状结构分布着处于不同发育阶段的卵室，这些卵管被一层薄薄的鞘包裹（图1A）。每个卵室最终将发育形成一个卵子。在卵子发生过程中，多种不同的细胞类型必须协调发育。D. melanogaster 卵室包含16个生殖系细胞，其中包括一个卵母细胞，其外围由单层滤泡上皮细胞包绕6。在上皮的前后极会形成少量特化的细胞，称为极细胞。6–8个边界细胞起源于卵室前端的上皮区域，由极细胞诱导产生5,7。在卵子发生的中期（9期），边界细胞从邻近细胞中脱离，并在滋养细胞之间迁移，最终到达卵室后端的卵母细胞处5,7。在此过程中，边界细胞必须以包含两个非运动性极细胞的细胞簇形式进行迁移，因此属于一种集体细胞迁移。边界细胞簇的成功迁移对于卵壳微孔的正常发育至关重要，而微孔是受精所必需的结构。
前极细胞通过激活信号转导级联反应来指导边界细胞命运。在卵母细胞发育的第8阶段，极细胞分泌一种细胞因子——Unpaired（UPD），该因子会与邻近滤泡细胞上的跨膜受体Domeless（DOME）结合8,9。UPD的结合促使Janus酪氨酸激酶（JAK）对信号转导子和转录激活子（STAT）进行磷酸化8,10,11。随后，STAT进入细胞核以激活转录。Slow Border Cells（SLBO）是一种转录因子，是STAT的直接转录靶标，同时也为边界细胞迁移所必需12。卵室的侧向观察显示，STAT活性在前部上皮呈梯度分布8,11,13。距离极细胞最近的滤泡细胞具有最高水平的活化STAT，因此它们转化为边界细胞并侵入相邻的生殖系组织。
为了理解边界细胞如何在上皮组织内被确定并从其中脱离，我们需要观察该组织的结构方式。如果从卵室的前端视角进行观察，我们预期在围绕极性细胞的滤泡细胞中，STAT 活性呈辐射对称分布。端面观察还能比在不同焦平面上比较细胞更准确地显示脱离前和脱离过程中膜蛋白及细胞间界面的差异。由于卵室呈长椭圆形，并通过柄细胞相互连接，它们在载玻片上通常侧向沉降，这使得难以观察卵室前端的结构。因此，关于卵室极区细胞的许多信息都是从侧面观察推断而来的。尽管可以通过算法对光学切片进行三维重建来获取部分信息，但由于光散射、光漂白以及Z轴方向分辨率较低，在缺乏超分辨率显微镜等昂贵技术的情况下，这些信息往往不够详细且可靠性较差14。其他类型的切片成像（例如电子显微镜或切片机切片）则需要对组织进行大量操作，包括脱水处理，从而增加了产生假象的可能性。因此，我们开发了一种新的方法，用于对直立状态下的D. melanogaster卵室进行成像。该方法已在阐明运动细胞命运决定机制方面显示出重要价值（见代表性结果及Manning et al, 正在审稿中），并有望在卵子发生其他方面的研究中具有更广泛的应用价值。
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方案
1. 卵巢管的解剖
- 将约十五只2至4日龄的雌蝇和少量雄蝇转移至添加了活性干酵母的新鲜果蝇培养管中。使用棉塞封口，并在棉塞上滴加几滴水以保持高湿度。
- 将培养管置于25 °C培养箱中孵育14–16小时，以最大化获得8–10期卵室的数量。
注意：孵育时间根据温度和目标发育阶段的不同而有所变化。 - 根据需要配制解剖液、0.1 M KPO4 和 NP40 溶液（见材料部分）。
- 使用CO2麻醉果蝇，并将其置于解剖显微镜下。在玻璃凹面载玻片的每个凹槽中加入数滴解剖液。
- 双手各持一把镊子，使其与台面大致呈30°角，将一只雌蝇腹部朝下放置。用非优势手的镊子夹住雌蝇腹部前端靠近胸部的位置，将其浸入凹面载玻片的解剖液中（图1A插图）。
- 用另一把镊子夹住腹部腹面后端的外骨骼并刺穿，随后夹住位于后端的卵巢，将其从体内拉出并放入凹面载玻片另一侧的新鲜解剖液中（图1A插图）。注意避免拉断肠道。弃去尸体。
- 重复上述操作，直至所有雌蝇的卵巢均被解剖完毕。弃去雄蝇。
- 用一把镊子夹住卵巢的后端（靠近最大卵室处），另一只手用镊子夹住最前端的一个卵室（生殖囊，germarium）（图1A）。
- 缓慢而稳定地将一个卵管链从卵巢鞘中拉出。继续逐个分离卵管，直至所有目标卵室均被取出。
- 对所有已解剖的卵巢重复步骤1.7–1.8。
- 完成后，用塑料移液器将卵管转移至0.6 ml离心管中。
- 让卵管自然沉降至管底，随后进行固定和染色步骤。
2. 卵巢管的免疫荧光（IF）染色
- 用移液器小心移除卵管中的解剖液，注意不要吸走任何卵管或卵室。保留约 50 μl 的卵管和解剖液。
- 在离心管中加入 50 μl 的 16% 多聚甲醛至 150 μl 的 0.1 M KPO4 缓冲液中，然后将溶液加入卵室以进行固定。在摇床上孵育 10 分钟。注意：多聚甲醛具有毒性。
- 移除固定液，并用 0.5 ml NP40 洗涤缓冲液清洗两次。
- 在室温下每次洗涤 15 分钟，共洗涤两次。
- 后续步骤请参考标准免疫荧光（IF）实验方案15。
- 简而言之，固定后，在适当稀释比例下加入一抗，并在 4 °C 下孵育过夜。用 NP40 缓冲液多次洗涤后，加入二抗（1:200 稀释）。
- 用 NP40 缓冲液多次洗涤后，加入 DAPI（1:1,000）孵育 10 分钟，然后重复洗涤。免疫荧光步骤完成后，向卵室中加入 200 μl 含 50% 甘油的 PBS 溶液，在室温下静置 2 小时。
- 移除溶液，替换为含 70% 甘油的 PBS 溶液，并用铝箔包裹。将样品置于 4 ᵒC 保存，直至准备封片。在此期间，继续进行第 3 步操作。
3. 甘油明胶切片的预先制备
- 至少测量 4 ml 用刮勺取适量甘油明胶，填充至玻璃细胞培养管的一半刻度处。将甘油明胶置于55 °C水浴中加热30分钟以熔化。
- 从储备液中取约300 μl甘油，分别滴加一小滴至两片显微镜载玻片上。用纸巾将甘油在每张载玻片上均匀涂抹成薄层。此步骤可提供基础涂层，并便于在步骤5.6中轻松去除甘油明胶。
- 剪去一个带滤膜的1,000 μl枪头的尖端。用剪切后的枪头缓慢转移1,000–1,500 μl温热的甘油明胶至每张显微镜载玻片上，注意避免产生气泡。
- 让甘油明胶载片在室温下静置5分钟 以设定。
- 将每个明胶甘油玻片置于60 毫米 × 15 将培养皿置于4 °C过夜，并用塑料膜覆盖。可选：将甘油明胶载玻片在4 °C保存最多5天。
4. 卵室的制备
- 使用步骤 2.5 中的样品，将多个 3 μl 的卵室液滴加入 70% 甘油中，均匀分布在一张明胶甘油载玻片上。继续点加 3 μl 液滴，直至所有卵室均转移至该载玻片。确保每个液滴至少含有十个卵室。同时，将一管明胶甘油置于 55 °C 水浴中加热。
- 将带有卵室的明胶甘油载玻片置于解剖显微镜下。调节放大倍数，使视野中仅包含一个卵室液滴（图 1B）。
- 使用 30 号针头作为“勺子”，挑取目标发育阶段的卵室。必要时，用针头作为“刀”将目标卵室从卵巢管链中分离出来。
- 为避免可能干扰成像的杂质，将卵室转移至第二张明胶甘油载玻片，使卵室前端朝左（图 1E-1）。重复此操作，直至至少有七个卵室排列成一列（图 1C）。
- 继续形成每列七个卵室的新列，直至所有目标卵室均转移至第二张明胶甘油载玻片。
- 撕下一小块纸巾并捻成细条。轻轻触碰每个卵室，以吸除多余的 PBS-甘油溶液。注意不要带走卵室。
- 剪去一个带滤芯的 200 μl 吸头的尖端。用其转移 150 μl 明胶甘油，覆盖所有卵室列。
注意：覆盖卵室列所需的明胶甘油量取决于卵室的发育阶段和列数，可根据实际情况调整用量。 - 将封片后的卵室在室温下静置 5 分钟，直至明胶甘油表层完全凝固（图 1D）。
- 将载有卵室的载玻片放入 60 mm × 15 mm 的培养皿中，并用塑料封膜覆盖。于 4 °C 过夜保存，使明胶甘油各层充分融合凝固（若担心光漂白，应置于避光环境中）。
5. 成像用卵室的制备
- 将已封片的卵室载玻片置于解剖显微镜下。调节放大倍数，使视野中仅包含一列卵室。
- 使用45°角的微型解剖刀，沿第一列卵室的右侧（靠近卵室后端）切出一条直线。（图1D-E）
- 接着，在该列最上方的卵室上方和最下方的卵室下方分别进行切割。此时，该列卵室应已在三个侧面被切开。
- 使用显微刀，尽可能贴近卵室前端，沿该列的左侧进行切割（图1E-3）。
- 用移液器将100 μl冷的1X PBT滴加到已切开的卵室列上。
- 使用圆头刮勺去除卵室列三个侧面多余的甘油胶，并弃去，保留载玻片上的其余部分。
- 将刮勺插入卵室前端的切口处，将卵室列从原始的甘油胶块中分离出来。
- 准备用于倒置显微镜（5.8.1）或正置显微镜（5.8.2）的样品。
- 用于倒置显微镜：将卵室列转移至盖玻片上，使卵室前端朝下。重复步骤5.2–5.8，直至所有甘油胶列均被移除并封片。在每块卵室样本上滴加数滴50% PBS-甘油，防止其干燥。直接在盖玻片上对卵室进行成像。
- 用于正置显微镜：将卵室列转移至显微镜载玻片上，使卵室前端朝上。重复步骤5.2–5.9，直至所有甘油胶列均被移除并安装在载玻片上。在每块卵室样本上滴加数滴50% PBS-甘油，并用#1 ½盖玻片覆盖样本。
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结果
直立成像方法使我们能够直接观察第8阶段卵泡上皮前部细胞的排列情况。卵泡细胞命运的通用标记物——Eyes Absent（EYA）蛋白，以及细胞核DNA标记物DAPI，在这群细胞中均表现出均匀表达，表明所有细胞的染色强度相似（图2B）。然而，受细胞因子UPD调控的蛋白质则表现出不同的表达模式和水平。极性细胞在此卵发育阶段之前即从顶端释放UPD16,17，因此我们预期STAT会在极性细胞周围呈放射状激活，这种情况有时确实存在。但通常情况下，我们观察到STAT的下游靶标（如SLBO）具有更复杂的表达模式。例如，SLBO表达的GFP报告信号出现在大多数但并非全部围绕极性细胞的细胞中（图2B，参见Manning et al under review）。我们注意到E-钙黏蛋白（E-cadherin）在表达/定位上存在细微差异（图2B’），这可能反映了黏附状态的变化，但要定量分析并解释这一结果还需进一步研究。这些细微差异无法通过卵室的侧向三维重建来检测（图2C-D）。使用直立成像...
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讨论
本文介绍了一种从端面视角对小型发育中卵室进行装片和成像的方法。目前常见的卵室成像技术主要针对侧向视图优化，当使用荧光抗体染色时，仅能精确观察中侧向的滤泡细胞。虽然Z轴堆叠图像或三维重建有助于查看多个焦平面，但对于椭圆形卵室的极区进行亚细胞分辨率成像仍显不足（图2D）。尽管最新的显微技术（如超分辨率成像）可在一定程度上克服该问题，但这些方法成本高昂且并非普遍可用。我们改进了适用于黑腹果蝇胚胎的直立式成像方案24,25，使其适用于体积小得多的卵室。本方法在多个关键步骤上进行了调整，以适应卵室远小于胚胎的尺寸特点。所述技术的一个关键环节是将单个卵室进行物理分离，而胚胎成像则无需此步骤。另一项改进是在装片过程中使用第二块甘油明胶载片（4.4）。由于卵室体积较小，并通过柄细胞与其他卵室相连，在操作过程中需使用细针，容易破坏甘油明胶结构。因此，必须使用细针将卵室转移至新的甘油明胶载片上进行装片（4.5）。直立式成像能够清晰显示侧向或水平视图中模糊的区域，揭示卵发育过程中组织结构的新信息。该方法使我们对卵室的模式形成事件获得了新的认识，并建议此技术可用于进一步探索卵发生过程中的其他方面。
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
我们感谢果蝇研究领域的各位成员，特别是 Denise Montell 博士、Lynn Cooley 博士和 Pernille Rorth 博士在试剂方面提供的帮助。感谢 Flybase、布卢明顿果蝇品系中心（Bloomington Drosophila Stock Center）以及发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）分别提供信息、果蝇品系和抗体。LM 获得了美国教育部 资助的国家急需领域研究生助学金（GAANN）培训项目（P200A120017）以及美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）学生发展最大化计划资助（2 R25-GM55036）的支持。部分显微成像工作得到了美国国家科学基金会（NSF）MRI 资助（DBI-0722569）和 Keith R. Porter 核心成像设施的支持。本研究部分得到了美国国家科学基金会职业奖（NSF CAREER Award，1054422）以及美国畸形儿基金会（March of Dimes）颁发的 Basil O’Connor 新晋学者奖的资助，上述奖项均授予 MSG。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 M 磷酸钾缓冲液（KPO4 缓冲液） | 将 3.1 g NaH2PO4•H2O 和 10.9 g 无水 Na2HPO4 溶于蒸馏 H2O 并定容至 1 L。最终溶液的 pH 值为 7.4。该缓冲液可在 4°C 下保存最多 1 个月。 | ||
| 16% 甲醛水溶液，电镜级 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 无甲醇，以保护 GFP 荧光 |
| 30G × 1/2 英寸针头 | VWR | BD305106 | 普通斜面 |
| 活性干酵母 | Genesee Scientific | 62-103 | 用于喂养雌蝇使其增肥 |
| 牛血清白蛋白 | PAA-cell culture company | A15-701 | 用于 NP40 洗涤缓冲液 |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar 合金，生物尖端；尖锐的尖端对卵巢管解剖至关重要 |
| DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐） | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml 储存液 |
| 胎牛血清（FBS） | Life Technologies | 16140-071 | 添加至解剖培养基中作为补充成分（10%） |
| 玻璃培养管 | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| 凹面玻璃载片 | VWR | 470019-020 | 1.2 mm 厚，双凹腔 |
| 甘油明胶 | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | 封片介质 |
| 甘油 | IBI Scientific | IB15760 | 在 PBS 中配制成 70% |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | （可与 Nonidet P-40 互换） 用于 NP40 洗涤缓冲液 |
| Leica 荧光体视显微镜 | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | 40x/0.55NA 干式物镜 | |
| 微型刮铲 | VWR | 82027-518 | 不锈钢材质 |
| 显微镜载玻片 | VWR | 16004-368 | 75×25×1 mm |
| NP40 洗涤缓冲液 | 50 mM TRIS-HCl、150 mM NaCl、0.5% Igepal、1 mg/ml BSA 和 0.02% 叠氮化钠 | ||
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | Life Technologies | 10378-016 | 添加至解剖培养基中作为补充成分（0.6X） |
| 培养皿—聚苯乙烯，无菌 | VWR | 82050-548 | 60 W × 15 H mm |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 包粉末 |
| 磷酸氢二钾 | Sigma Aldrich | P3786-500G | 用于 0.1 M KPO4 缓冲液 |
| 磷酸二氢钾 | Sigma Aldrich | P9791-500G | 用于 0.1 M KPO4 缓冲液 |
| [header] | |||
| Schneider’s 昆虫培养基 | Life Technologies | 11720018 | 含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠 |
| 叠氮化钠 | Sigma Aldrich | S2002-25G | 用于荧光抗体染色 |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S3014-500G | 用于 NP40 洗涤缓冲液 |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl，pH 7.4 |
| Volocity 3D 图像分析软件 | PerkinElmer | 用于处理共聚焦 Z 轴层扫图像 |
参考文献
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