测定冷灵敏度和适应小鼠一种简单廉价的方法

Summary

冷足底测定 （CPA） 可测量 30 °C 至 5 °C 之间的冷反应性，也可以测量冷适应。该协议描述了如何使用 CPA 测量小鼠的冷超敏反应、镇痛和适应。

Abstract

冷超敏反应是一个严重的临床问题，影响广泛的患者群体并导致生活质量显着下降。 冷足底测定可以客观且廉价地评估小鼠的冷敏感性，并且可以量化镇痛和超敏反应。 将小鼠在玻璃板上适应，并将压缩的干冰颗粒靠在后爪下方的玻璃表面上。 从冷却玻璃中撤出的延迟用作冷敏感性的衡量标准。

冷感对于在季节性温度变化的地区的生存也很重要，为了保持敏感性，动物必须能够调整其热响应阈值以匹配环境温度。足底冷测定 （CPA） 还允许在 30 °C 至 5 °C 的温度范围内测试小鼠的冷敏感性，从而研究对环境温度变化的适应能力。 如上所述使小鼠适应，但使用装满热水、湿冰或干冰的铝盒（或铝箔包）将玻璃板冷却至所需的起始温度。 使用细丝 T 型热电偶探头在中心测量板的温度。 一旦板达到所需的起始温度，如上所述对动物进行测试。

该检测允许在从无害到有害的温度范围内对小鼠进行测试。CPA 在未受伤的小鼠中产生明确且一致的行为反应，可用于量化超敏反应和镇痛。该协议描述了如何使用 CPA 测量小鼠的冷超敏反应、镇痛和适应。

Introduction

在啮齿类动物中测量冷响应为正常和病理条件下改善的冷敏感性的潜在机制的理解在人类重要的。冷足底测定（CPA），最初开发几年 ​​前^1，被设计为生成可再生的，明确的小鼠的行为反应，以冷的刺激在RT递送。更近的本测定法的改进已经允许冷灵敏度的再现性的测定在一个宽温度范围内的^2。这两个版本也被设计成相对高的通量，且廉价使用。

了很大的进步已取得理解冷灵敏度的机制使用其他行为的方法。一种方法是将丙酮蒸发试验，这涉及到涂抹或鼠标爪子喷洒丙酮和测量的时间，该鼠标花费轻弹爪^3,4的量。不幸的是，该反应的丙酮蒸发由湿感和丙酮的气味混淆。此外，即在丙酮蒸发试验施加冷刺激可以基于施加的丙酮的量而变化，并且是难以量化。最后，未受伤的小鼠具有最小响应丙酮在基线，使它不可能测量镇痛在没有敏感症的这种方法。

另一个经典测定法冷的反应是在甩尾试验中，在那里的等待时间停药后的尾部浸入冷水^5,6被测量。而在此测定的行为反应是明确的和测定测量的响应，以特定的温度，动物必须在测试期间被限制，从而可以改变通过充分描述应力诱发镇痛机构⁷冷响应能力。

另一种常用的工具是冷板试验，其测量行为小鼠的应答后，便被放置在一个珀尔帖冷却板^8-10。虽然这种工具提供有关在特定温度下的动物的反应....

Protocol

所有的鼠标协议均符合卫生指引国家机构，并批准了华盛顿大学医学院的动物研究委员会（圣路易斯，MO）。

1.准备测试板和外壳

1. 清洁过的玻璃表面。
2. 固定在T型丝热电偶探头的表面在玻璃板与实验室磁带的中间。
3. 放置在玻璃板上的动物罩在沿板的中间一行。
4. 通过该中心的动物外壳螺纹热电偶探头和插入数据记录器。转动而停用自动关机功能上的数据记录器，并附加数据记录仪到计算机提供的电缆。
   1. 如果在实验过程中记录板温度，打开数据记录软件开始录制板温度。
   2. 如果有必要，调整软件重新线板温度每秒一次。
   3. 开始录制用打包带的热数据记录器软件温度。
5. 与黑色插入机箱分离，以防止老鼠之间的视觉交互。
6. 位置镜玻璃，使得所述外壳的下侧是从舒适的就座位置可见的下方。

2.变暖/冷却玻璃板

1. 填充铝框用温热水，湿冰或干冰，并将它们在玻璃板适当地定位（填充有干冰铝箔包也可以被用于冷却玻璃; 图^1）2。
   1. 用于测试在30℃下，约定位铝框0.25''远离动物罩（ 图^2B）2。
      1. 在玻璃板的两侧设置了加热水循环。设置....

Results

从小鼠引起开始在30℃，23℃，17℃，和12℃下的行为反应是高度可再现的（ 图^4A）20。为了测量后爪下所产生的冷刺激，将小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪鸡尾酒和它们的爪子被固定在上一个T型热电偶丝（ 图^4B）20顶部的玻璃。玻璃被冷却或加热至所需的测试范围。虽然该板被均匀地冷却沿所述板（ 图^5A）2的长度，但应注意的是，在整个行为罩（ 图^5B）2，产生一个冷梯度。外壳是靠近干冰上机箱的两侧的部分是冷却器，而中央部分是稍暖（ 图^5B）2。在最寒冷的气温üSED，小鼠花大部分时间在机箱的中部地区。一旦玻璃板的温度已经稳定，焦点干冰刺激被放置在爪/热电极下方的玻璃。基于来自此设置中记录的温度的痕迹，很显然，使用该CPA中产生的冷刺激是在各温度范围（ 图^4C）20的高度可重复的.......

Discussion

CPA可用于评估小鼠的冷敏感性和冷适应能力。 它提供了一种经济实惠、有效的方法来测量不受约束、适应的动物在各种温度范围内的冷反应。 它还提供明确的行为响应，并具有易于量化和分析的输出变量。 它已经用于评估炎症¹、神经损伤¹、镇痛药¹、基因敲除²⁰ 和遗传神经元消融研究²⁶ 引起的冷敏感性变化。 它可以进行修改，以测量使用不同厚度的玻璃对各种冷却速率的响应，并且可以使用不同尺寸的注射器改变所施加的冷刺激的大小。

正确执行此测定的最关键步骤是在测试过程中均匀冷却或加热玻璃板。仔细布置铝盒，使它们均匀分布在动物围栏的两侧，这将有助于产生更均匀的温度。 在玻璃板上做标记以标准化实验之间的铝盒放置也将提高测定的可重复性，尽管这些标记可能必须定期重新校准以考虑建筑温度的季节性变化。

在实验过程中保持一致的玻璃板温度也可能具有挑战性。 确保铝盒始终均匀地装满干冰/湿冰/温水将产生稳定板温度的实验。 此外，在17°C的测试条件下.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
T型热电偶探头	Physitemp	IT-24p	用于测量玻璃表面温度 （http://www.physitemp.com/products/probesandwire/）
玻璃板	当地玻璃公司（在圣路易斯，Stemmerich Inc）		我们使用耐热玻璃（硼硅酸盐浮子）。我们的实验室通常使用 1/4 英寸，但 3/16 英寸和 1/8 英寸也很有用
热数据记录器	Extech	EA15	温度记录仪 跟踪玻璃温度 （http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408）
3 ml 注射器	BD	309657	切掉顶部，在注射器中压缩干冰以产生冷探针
计算机	如果使用 Extech 记录器，任何 Pcwill 都可以工作
圣路易斯华盛顿大学机械车间		铝盒	长 3 英尺，宽 4.5 英寸，高 3 英寸，带有密封盖。每个盒子的短边上钻有一个 1/2 英寸的孔，靠近底部。当箱子装满湿冰或热水时，这些孔会用橡胶旋塞填充。
加热水循环器	VWR		任何带泵的水循环器型号都可以工作
21 G 针	BD	305165	确切的针尺寸并不重要
手动计时器			任何手动计时器都可以工作
镜子			任何平面镜子都可以工作