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方法文章

一种快速可靠的细菌转录组分析流程 案例研究：丝氨酸依赖性基因调控 肺炎链球菌

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DOI：

10.3791/52649

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2015年4月25日

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department of Bioinformatics and Biotechnology, Government College University Faisalabad

本文内容

摘要

本文描述了利用DNA微阵列提供的尖端技术。微阵列可提供细菌在特定条件下所发生的转录组变化的全面概览。此外，我们还强调了通过使用便捷的自主开发软件包，能够轻松分析大量数据的优势。

摘要

基因表达及其调控对于理解细胞在不同条件下的行为至关重要。目前有多种技术可用于研究基因表达，但大多数技术在提供整个转录组表达情况的整体图景方面存在局限性。DNA 微阵列提供了一种快速且经济的研究技术，能够全面概述全局基因表达，其应用广泛，包括新基因和转录因子结合位点的鉴定、细胞转录活性的表征，以及帮助在单次实验中分析数千个基因。在本研究中，我们优化了从细菌细胞收获到 DNA 微阵列分析的转录组研究条件。综合考虑实验的时间、成本和准确性，该技术平台被证明在研究细菌转录组方面非常有用且具有广泛的适用性。在此，我们以肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）为案例，通过比较在培养基中添加不同浓度 L-丝氨酸条件下 S. pneumoniae 的转录响应，进行 DNA 微阵列分析。采用 Macaloid 方法并结合 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，并使用 RNA 质量检测试剂盒检测 RNA 质量。利用逆转录酶合成 cDNA，并使用两种胺反应性荧光染料之一对 cDNA 样本进行标记。采用自制的 DNA 微阵列芯片对标记后的 cDNA 样本进行杂交，微阵列数据通过 cDNA 微阵列数据预处理框架（Microprep）进行分析。最后，使用 Cyber-T 对 Microprep 生成的数据进行分析，以鉴定具有统计学显著性的差异表达基因。此外，还使用了自主研发的软件包（PePPER、FIVA、DISCLOSE、PROSECUTOR、Genome2D）对数据进行分析。

引言

在特定时间点或特定条件下，对单细胞生物或真核细胞基因组所编码的全部mRNA丰度（转录组）进行的研究，包括基因过表达或基因敲除情况下的分析，称为转录组学。转录组学使我们能够观察在某一时间点X的特定条件下基因的表达程度，并提供基因表达水平相对于参考样本的强弱信息。

微阵列是一种固定在固体基质（通常为玻璃载片或硅薄膜芯片）上的二维阵列，可用于利用高通量筛选以及微型化、多重化和平行化处理与检测方法来检测大量生物材料。微阵列有多种类型，包括DNA微阵列、蛋白质微阵列、多肽微阵列、组织微阵列、抗体微阵列、细胞微阵列等。DNA微阵列本质上是由固定在固体表面（通常为玻璃）上的大量微小DNA点组成。DNA微阵列可用于同时检测一个或多个基因的表达水平，或对基因组的多个区域进行基因分型2,3。每个代表特定DNA序列（也称为报告基因）的DNA点中含有皮摩尔（10-12 摩尔）量的探针。来自样本的标记mRNA分子被称为“靶标”。通过使用荧光染料来检测探针与靶标的杂交情况，荧光标记靶标的检测结果可反映靶标中核酸序列的相对丰度。由于微阵列可包含数万个探针，因此一次微阵列实验可同时完成多项遗传检测。一个简单的微阵列实验设计如图1所示。最近，我们实验室及其他实验室已证实这些微阵列可重复使用，使该技术具有较高的成本效益。

多年来已开发出多种RNA分离与纯化技术，包括C-TAB、SDS和GT法4–8。此外，市面上也有多种商用试剂盒可供选择。对于基因表达研究而言，高质量的RNA至关重要。因此，RNA分离方法经过优化以获得最大量的RNA。同样，cDNA的制备及标记步骤也得以简化。扫描后的数据归一化通过使用自主研发的软件包和工具高效完成9。

Streptococcus pneumoniae 是一种革兰氏阳性人类病原菌，定植于鼻咽部，可引起肺炎、败血症、中耳炎和脑膜炎等多种感染10。该细菌能够利用多种生长和生存所必需的营养物质11,12。已有大量研究关注肺炎链球菌的氮代谢及其调控机制，强调了氨基酸及其在毒力中的作用13,14。本研究采用DNA微阵列技术，报道了S. pneumoniae 对L-丝氨酸（一种在人血浆中含量丰富的氨基酸）不同浓度的转录组响应。通过比较S. pneumoniae 在最低L-丝氨酸浓度（150 µM）与最高浓度（10 mM）条件下的转录组反应，开展分析。本研究使用化学成分明确的培养基（CDM或最小培养基）15，以精确控制丝氨酸浓度。本研究的重点是使该技术更易于操作，并提供多种数据标准化与分析工具。因此，开发了多种用于数据分析与解释的工具。FIVA（功能信息查看与分析平台）提供了一个处理具有相似基因表达模式的基因簇中所含信息的平台，并可用于构建功能谱型16。PROSECUTOR 是另一款软件包，有助于识别基因的假定功能和注释17。通过使用聚类方法，DISCLOSE 提供了一种DNA结合位点检测算法，可用于预测基因的cis-调控基序18。Genome2D 提供了一个基于Windows的平台，通过多种颜色范围在基因组图谱上可视化和分析转录组数据，以表征基因表达水平的变化19。PePPER网络服务器除了提供一体化分析方法外，还提供了一个用于挖掘调控子、启动子和转录因子结合位点的工具箱20。使用该软件包可实现对细菌基因组中非编码区的完整注释。生物学家可从PePPER中获益良多，因为它提供了一个实验设计平台，可用于在体外验证假设信息in vitro20。这些软件包极大地促进了微阵列数据分析，其中大多数均可免费获取，使数据标准化和分析过程更加可靠。

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方案

1. 培养基制备与细胞培养

  1. 培养 S. pneumoniae D39 野生型菌株21 如前所述11. 将保存在 -80 的细胞接种 o在50 ml化学成分明确培养基（CDM）中，含10%甘油（以1/100比例加入50 ml无菌管），终末pH为6.4 15，但需从氨基酸混合物中省略L-丝氨酸。
    注意：使用了两种不同的化学成分明确培养基（CDM）；一种含有最低浓度的L-丝氨酸（150 µM），另一种含有最高浓度的L-丝氨酸（10 mM）。该最低浓度基本相当于人血浆中L-丝氨酸的浓度，目的是比较基因表达水平 S. pneumoniae D39菌株在这两种条件下。

2. 总RNA的提取

  1. 材料
    1. 使用酸性酚（酸性苯酚），RNA 级，用于总 RNA 的提取。
    2. Macaloid
      1. 将2克Macaloid悬浮于100 ml TE中，煮沸5分钟。冷却至室温，超声处理至Macaloid形成凝胶。在2,000 × g条件下离心溶液5分钟。 室温下，重悬于50 ml TE缓冲液（pH 8）中，4 °C保存。
    3. 溶液：
      1. 所有溶液均用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。每100 ml溶液中加入100 µl DEPC，37 °C孵育过夜，然后15 min高压灭菌。
  2. 方法
    1. 培养50 ml的 S. pneumoniae D39 细胞在 50 ml 离心管中于 37 ℃ 培养 oC（不振荡）至对数中期（OD ~0.3）。在 4 °C、10,000 × g 孵育2分钟。弃去培养基，立即将细胞沉淀物在液氮中冷冻。
    2. 预先混合 300 µl 氯仿:IAA（24:1）和 300 µl 苯酚（酸性苯酚，RNA 级）。在步骤 2.2.3 中使用 500 µl 有机相。
    3. 提前在无RNA的螺旋盖管中配制以下混合液：0.5 g 玻璃珠、50 µl 10% SDS、500 µl 苯酚/氯仿:IAA（按步骤2.2.2制备）、Macaloid层（150–175 µl，体积无需精确，因其黏稠度较高）。用400 µl TE（DEPC）重悬细胞沉淀，并将重悬后的细胞加入螺旋盖管中。
    4. 为破碎细胞，将带螺口盖的离心管放入珠磨机中，以每次60秒、共2次脉冲（“均质”）进行处理，两次之间间隔1分钟 冰上孵育一定时间。将样品离心10分钟 在10,000 × g (4 °C)
    5. 将上层相转移至新离心管中，加入500 µl 氯仿:IAA（24:1），在10,000 × g条件下离心5分钟 g (4 °C)
    6. 将上相500 µl转移至新的离心管中，加入2倍体积（1 ml）裂解/结合缓冲液，通过反复吹打混匀。使用RNA提取试剂盒并按照制造商推荐的方案分离总RNA。

3. RNA 纯化

  1. 为去除总RNA中的DNA污染，加入100 µl DNA酶I混合液（90 µl DNA酶缓冲液和10 µl DNA酶I），在15-25 ºC下孵育20-30分钟。
  2. 使用RNA酶试剂盒洗涤纯化后的RNA，收集50 µl洗脱液。

4. RNA 分析

  1. 使用分光光度计测定 RNA 浓度。通过以下方法检测 RNA 质量（图 2）。
    1. 取 1 µl 样品与 50 µl DEPC 水混合稀释，使浓度达到 20–200 ng/µl。
    2. 取 1 µl 稀释后的 RNA 样品，按照制造商说明书在 Bioanalyzer 上检测其质量。
  2. 注意：23S:16S 比值约为 2.0 时视为质量良好。1 A260 单位的 RNA 相当于 40 µg/ml。建议用于标记的 RNA 量为 10–20 µg。

5. cDNA 的制备与标记

注意：以下方案用于 cDNA 的制备与标记。

  1. 退火
    1. 在300 µl PCR管中进行退火反应，自制载片的总RNA浓度保持为10–15 µg，商用载片为5 µg。将RNA与2 µl随机九聚体（1.6 µg/µl）混合，必要时加入无核酸酶水，使退火混合物的终体积为18 µl。
    2. 将退火混合物在70 °C孵育5分钟。随后冷却至室温 10分钟（退火），如需要，短暂离心使反应液沉降至管底。将反应管置于冰上至少1分钟。
  2. 逆转录
    1. 按如下方法配制逆转录酶混合液：向18 µl退火混合物中加入12 µl主混合液（包含6 µl 5x第一链缓冲液、3 µl 0.1 M DTT、1.2 µl 25x AA-dUTP/核苷酸混合液和1.8 µl逆转录酶（商用载片使用1 µl））。在42 °C孵育反应混合物2–16小时。

6. mRNA 的降解与 cDNA 的纯化

  1. 为降解反应混合物中的 mRNA，加入 3 µl 的 2.5 M NaOH，并于 37 °C 孵育约 15 分钟。随后加入 15 µl 的 2 M HEPES 游离酸以中和 NaOH。
  2. 使用 PCR 纯化柱纯化 cDNA 混合物，并按照制造商的说明书操作。

7. cDNA 浓度的测定

  1. 使用分光光度计测定 cDNA 浓度。若要继续进行标记步骤，需确认 cDNA 浓度至少为 60 ng/µl（自制载玻片）或 20 ng/µl（公司制备的载玻片）。

8. 使用胺反应性染料标记 cDNA 及纯化

  1. 使用胺反应性染料标记 cDNA。将 cDNA 与一份胺反应性染料（5 µl）直接混合。
  2. 将混合物在室温避光条件下孵育 60 至 90 分钟，随后直接进行染料标记 cDNA 的纯化。使用 PCR 纯化柱并按照制造商的说明书纯化染料标记的 cDNA。用 50 µl 洗脱缓冲液洗脱 cDNA。

9. 标记cDNA的测定

  1. 使用分光光度计检测胺反应性染料在cDNA中的掺入情况。检查胺反应性染料的浓度是否在50 µl总体积中至少达到0.5 pmol/µl。

10. 标记cDNA样品的混合

  1. 对于自制芯片，应使用全部标记的cDNA进行杂交，且cDNA浓度差异不超过30%。对于商业芯片，所用cDNA的浓度差异不得超过2倍。
    注意：通常情况下，商业芯片约需300 ng cDNA，与自制芯片所需的cDNA量相比，用量极少。

11. 杂交与洗涤

  1. 使用以下试剂：去离子水、99% 乙醇、SHY 缓冲液（自制；含 40 µl 酵母RNA）。SHY溶液最大制备量为1 ml。
  2. 仪器与溶液的准备
    1. 至少在干燥前1小时打开真空浓缩仪和加热器。打开杂交炉，并将设定温度调整至正确的杂交温度（对于 S. pneumoniae DNA 微阵列使用 45 °C。同样，将杂交盒和烘箱预热 30-60 分钟。
    2. 将SHY缓冲液在68 ˚C预热至少30分钟。
  3. 样品制备（标记的 cDNA）
    1. 等量混合标记的cDNA（最大差异不超过30%）。使用真空浓缩仪在高温下干燥样品（约40分钟），直至体积小于7 µl。
  4. 升降器-滑脱
    1. 使用洁净的盖玻片。注意：载玻片上可加载约 ± 30 µl 液体。
    2. 用肥皂、大量自来水和100%乙醇清洁载片架。注意：脏的载片架会导致高背景。
    3. 用气枪吹干载片架，以去除灰尘颗粒。将一块干净的载片架放置在载玻片上，确保两侧的白色聚四氟乙烯衬垫朝下。
  5. 加入杂交缓冲液（至标记的 cDNA）
    1. 将干燥的染料样品溶于 7 µl H2O，并在 94 °C 下孵育 2 分钟。
    2. 立即加入35 µl预热的SHY缓冲液（68 °C），轻轻混匀后以最大速度离心1分钟，以去除沉淀物。在上样前，将探针于68 ˚C预热约5分钟。
  6. 载玻片托架-载玻片组件装配及预热
    1. 将杂交玻片架置于50 ˚C的加热块上。将带有加样槽的DNA微阵列玻片放置在预热的杂交玻片架上，并预热带加样槽的玻片约1分钟。随后步骤应尽快完成。
    2. 向载玻片末端加入 40 µl 样品靶标，通过毛细作用使液体在玻璃表面间流动。所有移液操作均应缓慢且小心进行。
    3. 始终保持载玻片与升降滑块水平，并缓慢移动，以确保升降滑块未发生位移。
    4. 从杂交炉中取出预热的杂交盒，并关闭仪器。将用3 ml 2x SSC（标准柠檬酸钠）溶液浸润的滤纸放入杂交盒中。
    5. 将装有载玻片的杂交孵育盒轻轻放入杂交盒中，盖上杂交盒并再次置于杂交炉中（约16-18小时）。
  7. 载玻片清洗
    1. 配制新鲜的洗涤缓冲液 I、II 和 III（每个洗涤步骤需 750 ml）。配制 500 ml 洗涤缓冲液 I，使用 2 x SSC / 0.5 % SDS；配制 500 ml 洗涤缓冲液 II，使用 1 x SSC / 0.25 % SDS；配制 500 ml 洗涤缓冲液 III，使用 1 x SSC / 0.1 % SDS（可选）
    2. 将洗涤缓冲液置于 30 °C（以确保 SDS 完全溶解）。
    3. 尽快但非常轻柔地将载玻片浸入装有50 ml洗涤缓冲液I的 Falcon 管中，直至玻片底部接触管子的锥形底部。
    4. 数秒后，当提升滑块沉降至管底时，用镊子取出载玻片，避免刮擦芯片阵列，并将其放入洗涤站的支架中。立即继续洗涤步骤，不得有时间间隔。
    5. 在洗涤站中用500 ml洗涤缓冲液I洗涤载玻片5分钟。随后在洗涤站中用500 ml洗涤缓冲液II洗涤20-30分钟。同样，在洗涤站中用500 ml洗涤缓冲液III洗涤载玻片5分钟（可选）。
    6. 以2,000 rpm离心2分钟，干燥载玻片。

12. 微阵列分析

  1. 使用扫描仪以相应波长扫描图像，并保存至“Jove Project”文件夹中。
  2. 使用软件初步分析扫描文件，具体方法如前所述22。运行该软件后，选择“Open Image”选项卡，将红色图像文件（-.550）加载为“Red”，绿色图像文件（-.635）加载为“Green”。通过选择“Load Array List”选项卡，上传包含 S. pneumoniae 芯片列表的 gal 文件（.gal）至图像文件中22。
    注意：此阵列列表包含48个网格，每个网格有16行和15列。网格上的每个点代表一个单独的基因，点的位置信息（包括基因名称）通过点描述文件添加。点的编号从左到右、从上到下依次排列。
  3. 仔细点样后，选择“Find Array, Find Blocks, Align Features”选项卡以对点阵进行对齐。完成所有特征对齐后，选择“Analyzing”选项卡进行图像分析。创建包含结果、直方图和散点图的新文件。通过“Save results as”选项卡将该文件保存为.gpr文件，用于后续分析。
  4. 使用内部开发的 Microprep 软件包对数据进行进一步的标准化和处理，具体步骤如下所述9.
  5. 使用染料交换的独立生物学重复样本进行DNA微阵列数据分析。按照文献1所述方法，采用CyberT实现一种t检验的变体，并计算错误发现率（FDR）。9.
  6. 对于差异表达基因，取 p < 0.001 和 FDR < 0.05 作为标准。
  7. 在NCBI提交页面上传DNA微阵列数据，以获取GEO（基因表达综合数据库）登录号。

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结果

RNA、cDNA 的提取与分析

L-丝氨酸是一种必需氨基酸，在儿童和成人血液血浆中的浓度范围为60-150 µM。它在嘌呤和嘧啶生物合成中的作用凸显了其在代谢过程中的重要性，并且是多种氨基酸（甘氨酸、半胱氨酸和色氨酸）的前体。为了研究L-丝氨酸对S. pneumoniae D39野生型菌株全转录组的影响，进行了微阵列分析，比较了D39菌株在化学成分确定培养基（CDM）中分别含有最低浓度（150 µM）和最高浓度（10 mM）L-丝氨酸条件下的基因表达差异。首先，从两种不同浓度条件下培养的细胞中提取总RNA。RNA样品的浓度见表1。使用质控检测方法评估总RNA的质量。在进行该检测前，RNA经DNase I处理以去除可能存在的基因组DNA。图2展示了RNA的质量情况；其中L泳道为分子量标记，泳道1和2代表150 µM丝氨酸条件下的RNA，泳道3和4代表10 mM丝氨酸条件下的RNA。两条对应于两种RNA亚基的清晰条带表明RNA质量良好，可进行后续实验步骤。

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讨论

我们描述了一种用户友好的实验方案，可用于细菌的全转录组分析。该技术的关键在于，细胞收获的条件可能因具体情况而异。在收获细胞并提取RNA之后，此技术对所有类型的细菌样本均相同，并遵循完全一致的操作步骤，因此可适用于任何类型的细菌培养物。该方案非常简单便捷，从RNA提取开始。我们的RNA提取方案（使用Macaloid和RNA提取试剂盒）相较于传统的苯酚-氯仿法和Trizol法更节省时间。下一步是使用逆转录酶III进行cDNA的合成。随后进行cDNA标记，首先将cDNA与胺反应性染料混合，然后纯化标记后的cDNA。标记过程同样简便，耗时较短，样品只需在避光条件下孵育约1小时即可。所有这些步骤均可在任何标准实验室中完成，无需特殊设备。扫描芯片需要使用微阵列扫描仪。芯片扫描与数据分析采用GenePix Pro软件，该软件操作极为简单且易于使用22。

完成所有实验后，使用 MicroPrep 和 CyberT 进行数据分析。MicroPrep 软件包包含三个模块， 即PrePreP、PreP 和 PostPreP9该数据预处理框架可...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢 Anne de Jong 和 Siger Holsappel 在 DNA 微阵列芯片制备方面的帮助。同时感谢 Anne de Jong 在生物信息学分析方面的支持。我们还感谢 Jelle Slager 对论文的审阅。Muhammad Afzal 和 Irfan Manzoor 由巴基斯坦高等教育委员会（HEC Pakistan）教师发展计划资助，由巴基斯坦费萨拉巴德政府学院大学（GC University, Faisalabad, Pakistan）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酸性酚SigmaAldrichP4682
Roche RNA 提取试剂盒Roche Applied Science11828665001
玻璃珠105015
氯仿Boom92013505.1000.
IAA106630
NanodropNanodropND-100
Agilent BioAnalyserAgilentG2940CA
Superscript IIILife technologies Invitrogen18080044
AA-dUTPLife technologies InvitrogenAM8439
DDTLife technologies Invitrogen18080044
第一链缓冲液Life technologies Invitrogen18080044
NaOHSigmaAldrichS8045-1KG
HEPESSigmaAldrichH4034-500G
DyLight-550Thermoscientiffic62262
DyLight-650Thermoscientiffic62265
SHY 缓冲液SigmaAldrichH7033-125ML
Speedvac 冷却器EppendorfRUGNE3140Speedvac 浓缩仪 plus
杂交炉Grant BoekelIso-20
Lifter-slipsErie Scientific25x60I-M-5439
擦拭纸KIMTECH
SDSSigmaAldrichL3771-100g
SSCSigmaAldrichW302600-1KG-K
Genpix 自动加载仪 4200A1MSD analytical technologies微阵列扫描仪
碳酸氢钠SigmaAldrich104766

参考文献

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