一种快速可靠的细菌转录组分析流程 案例研究：丝氨酸依赖性基因调控 肺炎链球菌

摘要

本文描述了利用DNA微阵列提供的尖端技术。微阵列可提供细菌在特定条件下所发生的转录组变化的全面概览。此外，我们还强调了通过使用便捷的自主开发软件包，能够轻松分析大量数据的优势。

摘要

基因表达及其调控对于理解细胞在不同条件下的行为至关重要。目前有多种技术可用于研究基因表达，但大多数技术在提供整个转录组表达情况的整体图景方面存在局限性。DNA 微阵列提供了一种快速且经济的研究技术，能够全面概述全局基因表达，其应用广泛，包括新基因和转录因子结合位点的鉴定、细胞转录活性的表征，以及帮助在单次实验中分析数千个基因。在本研究中，我们优化了从细菌细胞收获到 DNA 微阵列分析的转录组研究条件。综合考虑实验的时间、成本和准确性，该技术平台被证明在研究细菌转录组方面非常有用且具有广泛的适用性。在此，我们以肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）为案例，通过比较在培养基中添加不同浓度 L-丝氨酸条件下 S. pneumoniae 的转录响应，进行 DNA 微阵列分析。采用 Macaloid 方法并结合 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，并使用 RNA 质量检测试剂盒检测 RNA 质量。利用逆转录酶合成 cDNA，并使用两种胺反应性荧光染料之一对 cDNA 样本进行标记。采用自制的 DNA 微阵列芯片对标记后的 cDNA 样本进行杂交，微阵列数据通过 cDNA 微阵列数据预处理框架（Microprep）进行分析。最后，使用 Cyber-T 对 Microprep 生成的数据进行分析，以鉴定具有统计学显著性的差异表达基因。此外，还使用了自主研发的软件包（PePPER、FIVA、DISCLOSE、PROSECUTOR、Genome2D）对数据进行分析。

引言

在特定时间点或特定条件下，对单细胞生物或真核细胞基因组所编码的全部mRNA丰度（转录组）进行的研究，包括基因过表达或基因敲除情况下的分析，称为转录组学。转录组学使我们能够观察在某一时间点X的特定条件下基因的表达程度，并提供基因表达水平相对于参考样本的强弱信息。

微阵列是一种固定在固体基质（通常为玻璃载片或硅薄膜芯片）上的二维阵列，可用于利用高通量筛选以及微型化、多重化和平行化处理与检测方法来检测大量生物材料。微阵列有多种类型，包括DNA微阵列、蛋白质微阵列、多肽微阵列、组织微阵列、抗体微阵列、细胞微阵列等。DNA微阵列本质上是由固定在固体表面（通常为玻璃）上的大量微小DNA点组成。DNA微阵列可用于同时检测一个或多个基因的表达水平，或对基因组的多个区域进行基因分型^2,3。每个代表特定DNA序列（也称为报告基因）的DNA点中含有皮摩尔（10^-12 摩尔）量的探针。来自样本的标记mRNA分子被称为“靶标”。通过使用荧光染料来检测探针与靶标的杂交情况，荧光标记靶标的检测结果可反映靶标中核酸序列的相对丰度。由于微阵列可包含数万个探针，因此一次微阵列实验可同时完成多项遗传检测。一个简单的微阵列实验设计如图1所示。最近，我们实验室及其他实验室已证实这些微阵列可重复使用，使该技术具有较高的成本效益。

多年来已开发出多种RNA分离与纯化技术，包括C-TAB、S....

方案

1. 培养基制备与细胞培养

1. 培养 S. pneumoniae D39 野生型菌株²¹ 如前所述¹¹. 将保存在 -80 的细胞接种 ^o在50 ml化学成分明确培养基（CDM）中，含10%甘油（以1/100比例加入50 ml无菌管），终末pH为6.4 ¹⁵，但需从氨基酸混合物中省略L-丝氨酸。
   注意：使用了两种不同的化学成分明确培养基（CDM）；一种含有最低浓度的L-丝氨酸（150 µM），另一种含有最高浓度的L-丝氨酸（10 mM）。该最低浓度基本相当于人血浆中L-丝氨酸的浓度，目的是比较基因表达水平 S. pneumoniae D39菌株在这两种条件下。

2. 总RNA的提取

1. 材料
   1. 使用酸性酚（酸性苯酚），RNA 级，用于总 RNA 的提取。
   2. Macaloid
      1. 将2克Macaloid悬浮于100 ml TE中，煮沸5分钟。冷却至室温，超声处理至Macaloid形成凝胶。在2,000 × g条件下离心溶液5分钟。 室温下，重悬于50 ml TE缓冲液（pH 8）中，4 °C保存。
   3. 溶液：
      1. 所有溶液均用焦碳酸....

结果

RNA、cDNA 的提取与分析

L-丝氨酸是一种必需氨基酸，在儿童和成人血液血浆中的浓度范围为60-150 µM。它在嘌呤和嘧啶生物合成中的作用凸显了其在代谢过程中的重要性，并且是多种氨基酸（甘氨酸、半胱氨酸和色氨酸）的前体。为了研究L-丝氨酸对S. pneumoniae D39野生型菌株全转录组的影响，进行了微阵列分析，比较了D39菌株在化学成分确定培养基（CDM）中分别含有最低浓度（150 µM）和最高浓度（10 mM）L-丝氨酸条件下的基因表达差异。首先，从两种不同浓度条件下培养的细胞中提取总RNA。RNA样品的浓度见表1。使用质控检测方法评估总RNA的质量。在进行该检测前，RNA经DNase I处理以去除可能存在的基因组DNA。图2展示了RNA的质量情况；其中L泳道为分子量标记，泳道1和2代表150 µM丝氨酸条件下的RNA，泳道3和4代表10 mM丝氨酸条件下的RNA。两条对应于两种RNA亚基的清晰条带表明RNA质量良好，可进行后续实验步骤。

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讨论

我们描述了一种用户友好的实验方案，可用于细菌的全转录组分析。该技术的关键在于，细胞收获的条件可能因具体情况而异。在收获细胞并提取RNA之后，此技术对所有类型的细菌样本均相同，并遵循完全一致的操作步骤，因此可适用于任何类型的细菌培养物。该方案非常简单便捷，从RNA提取开始。我们的RNA提取方案（使用Macaloid和RNA提取试剂盒）相较于传统的苯酚-氯仿法和Trizol法更节省时间。下一步是使用逆转录酶III进行cDNA的合成。随后进行cDNA标记，首先将cDNA与胺反应性染料混合，然后纯化标记后的cDNA。标记过程同样简便，耗时较短，样品只需在避光条件下孵育约1小时即可。所有这些步骤均可在任何标准实验室中完成，无需特殊设备。扫描芯片需要使用微阵列扫描仪。芯片扫描与数据分析采用GenePix Pro软件，该软件操作极为简单且易于使用²²。

完成所有实验后，使用 MicroPrep 和 CyberT 进行数据分析。MicroPrep 软件包包含三个模块， 即PrePreP、PreP 和 PostPreP⁹该数据预处理框架可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酸性酚	SigmaAldrich	P4682
Roche RNA 提取试剂盒	Roche Applied Science	11828665001
玻璃珠		105015
氯仿	Boom	92013505.1000.
IAA		106630
Nanodrop	Nanodrop	ND-100
Agilent BioAnalyser	Agilent	G2940CA
Superscript III	Life technologies Invitrogen	18080044
AA-dUTP	Life technologies Invitrogen	AM8439
DDT	Life technologies Invitrogen	18080044
第一链缓冲液	Life technologies Invitrogen	18080044
NaOH	SigmaAldrich	S8045-1KG
HEPES	SigmaAldrich	H4034-500G
DyLight-550	Thermoscientiffic	62262
DyLight-650	Thermoscientiffic	62265
SHY 缓冲液	SigmaAldrich	H7033-125ML
Speedvac 冷却器	Eppendorf	RUGNE3140	Speedvac 浓缩仪 plus
杂交炉	Grant Boekel	Iso-20
Lifter-slips	Erie Scientific	25x60I-M-5439
擦拭纸	KIMTECH
SDS	SigmaAldrich	L3771-100g
SSC	SigmaAldrich	W302600-1KG-K
Genpix 自动加载仪 4200A1	MSD analytical technologies		微阵列扫描仪
碳酸氢钠	SigmaAldrich	104766