视网膜电图（ERG）是视网膜在光刺激下产生的电位反应。本文描述了如何在暗适应大鼠中利用ERG评估视网膜功能，以及如何应用ERG来评价一种神经保护干预措施——本例中为远程缺血预处理。
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本文内容
摘要
摘要
视网膜电图（ERG）是所有视网膜活动的总和。ERG通常从角膜记录，角膜起到天线的作用，收集并汇总来自视网膜的信号。ERG对全视网膜范围的功能变化非常敏感，但在检测局限于视网膜小区域的损伤时效果较差。本文描述了如何记录“闪光”ERG，即当视网膜暴露于短暂闪光时所产生的电位。我们介绍了记录过程中麻醉、散瞳和角膜管理的方法；如何保持视网膜处于暗适应状态；电极材料及其放置方式；刺激能量的范围与校准；记录参数及数据提取方法。我们还描述了一种在单个肢体上诱导缺血的方法，以及如何利用ERG评估这种远离视网膜的缺血在光损伤后对视网膜功能的影响。文中介绍了一种双闪光方案，可分离出暗适应ERG中由视锥细胞驱动的成分，从而实现视杆细胞与视锥细胞成分的分离。由于ERG可通过微创技术记录，因此已被广泛应用于视网膜生理学、药理学和毒理学研究中。我们在此提供一个应用实例，即利用ERG评估光损伤视网膜的功能状态，比较在有或无神经保护干预（远端缺血预处理）条件下的差异。
引言
视网膜电图（ERG）是视网膜在光刺激下产生并从眼球角膜表面记录到的电位。如果严格控制记录条件，ERG 可以以多种方式用于评估视网膜功能。本文介绍了如何记录“闪光 ERG”，即在全视野（Ganzfeld）背景下，视网膜受到短暂强闪光刺激时所产生的电位。Ganzfeld 能够均匀分散光线，使闪光大致均匀地到达整个视网膜。如果在记录前使视网膜处于暗适应状态，并在动物准备记录过程中持续保持暗适应，则所获得的 ERG 由视杆细胞和视锥细胞感光细胞共同产生。
暗适应闪光ERG具有特征性的波形，该波形可通过两种方式进行分析。首先，ERG波形的早期和晚期成分被区分开来，并与视网膜神经元激活的顺序相对应。最早出现的成分是一个潜伏期较短的负向电位，即a波（图1）。随后出现一个正向电位，称为b波。b波的上升支呈现振荡，这些振荡被认为是一个独立的成分（振荡电位，OPs）。一般认为，a波由光感受器产生，b波由内核层细胞产生，而OPs则由无长突细胞产生1。
根据刺激强度的不同，可以记录到对极微弱闪光产生的反应，这种反应被称为暗视阈值反应。目前认为暗视阈值反应起源于视网膜神经节细胞2-4。其次，闪光视网膜电图可通过光适应状态，或通过下文所述的双闪光方案，分离出由视杆细胞和视锥细胞介导的成分。在明视条件下，由于大鼠的视锥细胞数量较少，其a波无法被检测到，但振荡电位（OPs）和....
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方案
本实验方案遵循悉尼大学的动物护理指南。
1. 制作电极
- 用一段短（5 cm）直径为 1-2 mm 的铂丝制作正极（将接触角膜的一极），将其弯成直径几毫米的环状。将此环连接至一根常规导线，导线长度需足以连接到放大器的输入端（见图 4）。
- 用直径为 1-2 mm 的 Ag/AgCl 小球制作负极（将插入动物口腔的一极），同样连接至一根常规导线（见图 4）。
- 作为参考电极（将插入动物臀部的一极），使用一根洁净的皮下注射针头（23 G），同样连接至适当长度的导线（见图 4）。
- 理想情况下，应使用仪器制造商提供的三芯导线电缆，将三个电极（正极 → 角膜，负极 → 口腔，参考电极 → 臀部）连接至放大器。
2. 光刺激与视网膜电图装置的连接和校准
- 建立（或寻找）一个可完全遮光的小型记录实验室，并配备红色台灯或红色头灯中的一种或两种。
- 使用照度计确认在实验设置过程中到达大鼠眼睛的红光照度不超过 1 lux。
注意：可使用中性密度滤光片降低光源亮度，且光源必须专门发射红光。若光源发射较短波长（可见光范围）的光，将影响大鼠眼睛的暗适应。 - 彻底封堵所有进入记录实验室的....
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结果
该方案可用于活体测量啮齿类动物视网膜的视觉功能。in vivo条件下，a波反映光感受器功能，b波反映内层视网膜功能，如图1所示。
以视杆细胞为主的ERG信号随着光刺激强度的增加而增强，如图2A所示。a波在约0.4 log scot cd.s.m-2时开始显现，其波幅随刺激增强而增大，直至在2.5 log scot cd.s.m-2时达到饱和（未显示）。双闪光范式已被用于将混合的ERG信号分离为视锥细胞和视杆细胞的独立反应，如图2B所示。
该ERG记录技术可用于评估神经保护干预措施。光损伤前一周完成的基线记录如图3A所示。光损伤导致a波和b波振幅均下降，如图3B所示。远端缺血预处理可减轻ERG振幅的丢失，如图3C所示。远端缺血技术的效果依赖于在“膝”上方正确应用止血带.......
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讨论
上述暗适应闪光视网膜电图（ERG）方法是评估大鼠视网膜功能的可靠方法。光损伤导致a波和b波均下降。远隔缺血预处理减轻了光损伤引起的a波和b波降低。视网膜功能的这种保护作用提示，远隔缺血预处理已诱导产生神经保护效应，类似于其他形式的保护性预处理，如缺氧、缺血和运动8-10。所记录的ERG信号由三组因素决定：记录装置、光刺激参数以及动物的状态。
记录装置设置
当电极放置位置不正确或接地不完全时，视网膜电图（ERG）的波幅会降低11。正确接地附近的电气设备非常重要，有助于减少记录中的噪声；如果仍有明显噪声，应使用法拉第笼。正极应牢固地置于角膜中央，并在开始全视野ERG方案前及完成后检查其位置是否正确。该电极必须仅与角膜接触；若接触眼睑甚至胡须，均可能导致信号波幅下降。本方案中使用一根松散的棉线以防止眼睑接触正极。一些研究人员已开发出内置正极的接触镜片，以确保可靠的接触并防止眼睑触碰电极12。
光刺激设置
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披露
Jonathan Stone 是 CSCM Pty Ltd 的负责人
致谢
作者感谢Sharon Spana女士在啮齿类动物监测、操作与实验方面提供的协助。博士生研究经费由悉尼大学和澳大利亚卓越视觉研究中心提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PC 计算机 | |||
| Powerlab，四通道数据采集硬件 | AD Instruments | PL 35044 | ERG 信号采集 |
| 动物生物放大器 | AD Instruments | FE 136 | ERG 信号放大器 |
| Lab chart | AD Instruments | 信号采集软件 | |
| 全视野刺激仪（Ganzfield） | Photometric solutions | FS-250A | 光刺激设备 |
| Ganzfield 操作系统 | Photometric solutions | ||
| 研究用辐射计 | International light technologies | ILT-1700 | 校准光强序列 |
| 照度计 | LX-1010B | 检测红光照明强度 | |
| Excel | Microsoft | ||
| 导线 | AD Instruments | 连接正极、负极和接地电极至放大器 | |
| 鳄鱼夹导线 | AD Instruments | 将 Ganzfield 和采集硬件接地至计算机 | |
| 95% 铂丝 | A&E metals | 正极电极 | |
| 口腔电极 Ag/AgCl 颗粒 | SDR | E205 | 负极电极 |
| 26 G 针头 | BD | 接地电极 | |
| 水泵 | |||
| 水浴锅 | |||
| 管路 | |||
| 带柔性探头的恒温毯系统 | Harvard Apparatus | 507222F | |
| 阿托品 1% w/v | Bausch & Lomb | 局部散瞳剂 | |
| 丙美卡因 0.5% w/v | Bausch & Lomb | 局部麻醉剂 | |
| Visco tears 眼药水 | Novartis | 卡波姆聚合物 | |
| 缝合线 | 牵拉眼睑 | ||
| 镊子 | |||
| 可重复使用粘合剂 | Blu tac | 固定红光头灯及电极 | |
| 吸水垫料 | |||
| Ketamil - 氯胺酮 100 mg/ml - 50 ml | Troy Laboratories Pty Ltd | 分离麻醉剂 | |
| Xylium - 赛拉嗪 100 mg/ml - 50 ml | Troy Laboratories Pty Ltd | 肌肉松弛剂 | |
| 电子天平 |
参考文献
- Arden, G. B., Heckenlively, J. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. , MIT Press. 139-183 (2006).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. Journal of Physiology-London. 555 (1), 153-173 (2004)....
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