利用视网膜电图评估啮齿类动物视网膜功能及远端肢体缺血预处理的保护作用

摘要

视网膜电图（ERG）是视网膜在光刺激下产生的电位反应。本文描述了如何在暗适应大鼠中利用ERG评估视网膜功能，以及如何应用ERG来评价一种神经保护干预措施——本例中为远程缺血预处理。

摘要

视网膜电图（ERG）是所有视网膜活动的总和。ERG通常从角膜记录，角膜起到天线的作用，收集并汇总来自视网膜的信号。ERG对全视网膜范围的功能变化非常敏感，但在检测局限于视网膜小区域的损伤时效果较差。本文描述了如何记录“闪光”ERG，即当视网膜暴露于短暂闪光时所产生的电位。我们介绍了记录过程中麻醉、散瞳和角膜管理的方法；如何保持视网膜处于暗适应状态；电极材料及其放置方式；刺激能量的范围与校准；记录参数及数据提取方法。我们还描述了一种在单个肢体上诱导缺血的方法，以及如何利用ERG评估这种远离视网膜的缺血在光损伤后对视网膜功能的影响。文中介绍了一种双闪光方案，可分离出暗适应ERG中由视锥细胞驱动的成分，从而实现视杆细胞与视锥细胞成分的分离。由于ERG可通过微创技术记录，因此已被广泛应用于视网膜生理学、药理学和毒理学研究中。我们在此提供一个应用实例，即利用ERG评估光损伤视网膜的功能状态，比较在有或无神经保护干预（远端缺血预处理）条件下的差异。

引言

视网膜电图（ERG）是视网膜在光刺激下产生并从眼球角膜表面记录到的电位。如果严格控制记录条件，ERG 可以以多种方式用于评估视网膜功能。本文介绍了如何记录“闪光 ERG”，即在全视野（Ganzfeld）背景下，视网膜受到短暂强闪光刺激时所产生的电位。Ganzfeld 能够均匀分散光线，使闪光大致均匀地到达整个视网膜。如果在记录前使视网膜处于暗适应状态，并在动物准备记录过程中持续保持暗适应，则所获得的 ERG 由视杆细胞和视锥细胞感光细胞共同产生。

暗适应闪光ERG具有特征性的波形，该波形可通过两种方式进行分析。首先，ERG波形的早期和晚期成分被区分开来，并与视网膜神经元激活的顺序相对应。最早出现的成分是一个潜伏期较短的负向电位，即a波（图1）。随后出现一个正向电位，称为b波。b波的上升支呈现振荡，这些振荡被认为是一个独立的成分（振荡电位，OPs）。一般认为，a波由光感受器产生，b波由内核层细胞产生，而OPs则由无长突细胞产生¹。

根据刺激强度的不同，可以记录到对极微弱闪光产生的反应，这种反应被称为暗视阈值反应。目前认为暗视阈值反应起源于视网膜神经节细胞^2-4。其次，闪光视网膜电图可通过光适应状态，或通过下文所述的双闪光方案，分离出由视杆细胞和视锥细胞介导的成分。在明视条件下，由于大鼠的视锥细胞数量较少，其a波无法被检测到，但振荡电位（OPs）和b波清晰可辨⁵。在视网膜中视锥细胞比例较高的灵长类动物中，视杆细胞通路和视锥细胞通路均可产生可检测的a波⁶。

通常从闪光ERG中提取的两个有用指标是a波和b波的振幅，其测量方法如图1所示，典型的闪光反应见图2。当感光细胞数量减少时（例如因暴露于有害的强光下），ERG的所有组分均会降低。神经保护干预措施（如远程缺血预处理（RIP））可通过a波和b波振幅的保留得以验证（图3）。总之，ERG分析可实现健康视网膜、光损伤视网膜与神经保护视网膜之间的比较。

方案

本实验方案遵循悉尼大学的动物护理指南。

1. 制作电极

1. 用一段短（5 cm）直径为 1-2 mm 的铂丝制作正极（将接触角膜的一极），将其弯成直径几毫米的环状。将此环连接至一根常规导线，导线长度需足以连接到放大器的输入端（见图 4）。
2. 用直径为 1-2 mm 的 Ag/AgCl 小球制作负极（将插入动物口腔的一极），同样连接至一根常规导线（见图 4）。
3. 作为参考电极（将插入动物臀部的一极），使用一根洁净的皮下注射针头（23 G），同样连接至适当长度的导线（见图 4）。
4. 理想情况下，应使用仪器制造商提供的三芯导线电缆，将三个电极（正极 → 角膜，负极 → 口腔，参考电极 → 臀部）连接至放大器。

2. 光刺激与视网膜电图装置的连接和校准

1. 建立（或寻找）一个可完全遮光的小型记录实验室，并配备红色台灯或红色头灯中的一种或两种。
2. 使用照度计确认在实验设置过程中到达大鼠眼睛的红光照度不超过 1 lux。
   注意：可使用中性密度滤光片降低光源亮度，且光源必须专门发射红光。若光源发射较短波长（可见光范围）的光，将影响大鼠眼睛的暗适应。
3. 彻底封堵所有进入记录实验室的杂散光线（通常需要使用不透明胶带耐心处理），并准备足够大的中性密度滤光片（可购买成片材料），以便覆盖实验室内任何计算机屏幕，降低其亮度。
   注意：杂散光和屏幕发出的光足以干扰大鼠眼睛的暗适应过程。
4. 将放大器连接至数据采集硬件。将正极、负极和参考电极连接至放大器。确保计算机和LED全视野刺激器电源单元可靠接地。
   注意：一些实验室设有专用接地点，连接至建筑物接地系统；水管也可作为有效的替代接地方式。
5. 使用科研级辐射计对LED光源进行校准。将辐射计传感器固定在实验过程中动物眼睛所处的位置。
6. 编程控制全视野LED系统，运行全视野视网膜电图（ERG）刺激方案，逐步增加闪光能量、闪光持续时间、闪光重复频率以及闪光间的时间间隔（称为刺激间间隔，ISI）。示例全视野刺激方案见表1。
   注意：全视野ERG刺激从重复的弱闪光逐步过渡到强闪光。双闪光程序紧随全视野刺激方案之后，可用于分离视杆细胞和视锥细胞反应。

3. 视网膜电图实验前一天

1. 记录前将Sprague-Dawley大鼠暗适应12小时。在消除杂散光后，于记录实验室中进行暗适应较为方便。

4. 视网膜电图实验当天

1. 在记录过程中，需对动物进行温和加热。我们使用一种轻质金属平台，使动物的头部能够准确地置于Ganzfeld装置入口的合适位置。该平台内置管道，可通过循环水浴中预热至40 °C的水来维持温度。
   注意：经验表明，这种方法可使动物的核心体温保持在37 °C。
2. 在暗光条件下称量大鼠体重，记录体重数值，并配制相应剂量的氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）。轻柔固定大鼠，进行腹腔注射麻醉。
3. 记录注射时间。待动物失去意识后（通常在5分钟内），轻捏其一只足垫以检查麻醉深度，观察是否存在反射反应。建议在该反射消失或明显减弱后再继续操作。
4. 在角膜表面滴加一滴阿托品和一滴丙氧麻药（proxmethacaine）。
5. 剪取一段10 cm长的黑色缝线，打一个简单的结形成环状，将环套入眼球赤道部并轻轻收紧；其作用是将眼球轻微前拉，施加最小压力，从而保持角膜不被眼睑遮挡。
6. 在角膜表面滴加卡波姆眼药水。确保卡波姆保留在角膜表面，避免溢出至眼睑或面部。
7. 在加热平台上铺上吸水垫料。
8. 将大鼠置于垫料上，头部置于Ganzfeld装置开口的推荐位置。
9. 将体温探头插入直肠内，并用胶带将探头导线固定于尾巴上以保持位置稳定。
10. 将参考电极（23 G针头）皮下插入后肢，并连接至放大器。
11. 将负极（Ag/AgCl小球电极）稳妥置于口腔内。为防止电极滑出，应将连接导线固定于稳定物体上。
12. 将正极置于角膜中央上方。使用显微操作器调节，确保电极轻柔接触角膜表面。
13. 检查动物体温是否维持在37.0–37.5 °C之间。
14. 当动物体位和电极均正确放置后，用不透光材料将整个装置（Ganzfeld和动物）覆盖（以保持暗适应状态）。我们使用一块柔软的黑色布料。
15. 在采集软件中设置采样频率为2 KHz，采集时间为100–1000 msec，预采集采样时间为5 msec。设置带通滤波器为1–1,000 Hz，并确保采样触发后采集闪光刺激后约250 msec的时间段。
16. 检查记录基线。基线应无外界干扰噪声，但可显示一定的放大器噪声和呼吸振荡。
17. 若基线显示存在外界噪声，应开始排查问题。大多数问题与电极移位或接地不良有关。可使用法拉第笼确保记录不受外界噪声干扰。
18. 进行一次测试闪光刺激，强度为0.4 log scot cd·s·m^-2。应出现类似图2A的ERG波形。在本实验室中，0.4 log scot cd·s·m^-2闪光刺激的典型反应为（a波：-474 ± 39 µV，b波：1,512 ± 160 µV，n = 11）。
19. 让动物在暗环境中重新适应10分钟。可利用这段时间再次检查基线稳定性。
20. 确认信号稳定后，开始正式记录。
21. 记录结束后，检查体温是否维持稳定，移除电极。再次在角膜上涂抹卡波姆聚合物。将动物置于加热垫上恢复，直至其完全恢复活动能力后，再送回动物饲养设施。

5. 远程缺血

1. 在清醒或麻醉状态下的啮齿类动物中进行远程缺血处理。
2. 若动物处于麻醉状态，将其置于加热平台上（上方），并将血压计袖带套在后肢上部，避开膝关节。
3. 若动物习惯于操作处理，可在无麻醉情况下进行该操作；此过程需要两人配合。一人轻柔固定动物，另一人安装血压计袖带并操作血压计。
4. 对于清醒动物，使用一块约15 cm × 30–50 cm的毛巾轻轻包裹动物，留出一条后肢。将动物仰卧放置于操作者左前臂上，头部置于固定者手臂与躯干之间，然后按上述方法放置袖带。
5. 排空袖带气体，并确保气压阀门已关闭。对麻醉动物将袖带充气至160 mmHg，对清醒动物充气至180 mmHg。此压力高于收缩压（通常分别为140 mmHg和160 mmHg）。
6. 根据需要，使用手持气泵维持上述压力。
7. 在预定的缺血时间后（我们采用两个5分钟缺血期，中间间隔5分钟再灌注），通过松开气压阀门释放袖带压力。
8. 使用足垫皮肤温度探头确认远程缺血效果。皮肤温度通常在5分钟内从32–30 °C下降，并在再灌注时恢复。

6. 光损伤

1. 在进行光损伤实验前，确保大鼠已过夜暗适应。
2. 在肢体缺血后的适当时间（本实验中无延迟），将每只动物单独放入一个聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）箱中，箱内底部放置盛有水和食物的容器。
   注意：光诱导损伤仅可在白化动物中进行。
3. 在固定时间（通常为上午9点）开启预先校准的1,000 lux白色光源，并持续维持24小时。

7. 视网膜电图数据提取与分析

1. 获取ERG的平均波形。如有需要，通过减法校正非零基线。
2. 测量a波的振幅（在中至高强度刺激下呈现），即基线与第一个（<30毫秒潜伏期）波谷之间的电压差（图1）。
3. 测量b波振幅，即a波波峰与随后正向波峰之间的电压差，通常出现在80–100毫秒的潜伏期（图1）。
4. 通过傅里叶变换将数据滤波至60–235 Hz（过渡带为90 Hz）以分离振荡电位⁷。如有需要，可将分离出的振荡电位信号从未经滤波的波形中减去，以确认a波波谷的特征。
5. a波和b波峰值的隐含时间（潜伏期）也可作为有用的测量指标（图1）。使用双闪刺激分离视杆细胞反应，将锥细胞反应（闪光2）从混合反应（闪光1）中减去，从而获得视杆细胞反应（图2）。
6. 对个体在不同光强下的a波和b波振幅进行归一化处理（治疗后/治疗前基线），或对治疗组的平均值进行归一化。光强-反应曲线用于绘制各组振幅及其误差随闪光能量的变化关系。

结果

该方案可用于活体测量啮齿类动物视网膜的视觉功能。in vivo条件下，a波反映光感受器功能，b波反映内层视网膜功能，如图1所示。

以视杆细胞为主的ERG信号随着光刺激强度的增加而增强，如图2A所示。a波在约0.4 log scot cd.s.m^-2时开始显现，其波幅随刺激增强而增大，直至在2.5 log scot cd.s.m^-2时达到饱和（未显示）。双闪光范式已被用于将混合的ERG信号分离为视锥细胞和视杆细胞的独立反应，如图2B所示。

该ERG记录技术可用于评估神经保护干预措施。光损伤前一周完成的基线记录如图3A所示。光损伤导致a波和b波振幅均下降，如图3B所示。远端缺血预处理可减轻ERG振幅的丢失，如图3C所示。远端缺血技术的效果依赖于在“膝”上方正确应用止血带...

讨论

上述暗适应闪光视网膜电图（ERG）方法是评估大鼠视网膜功能的可靠方法。光损伤导致a波和b波均下降。远隔缺血预处理减轻了光损伤引起的a波和b波降低。视网膜功能的这种保护作用提示，远隔缺血预处理已诱导产生神经保护效应，类似于其他形式的保护性预处理，如缺氧、缺血和运动^8-10。所记录的ERG信号由三组因素决定：记录装置、光刺激参数以及动物的状态。

记录装置设置

当电极放置位置不正确或接地不完全时，视网膜电图（ERG）的波幅会降低¹¹。正确接地附近的电气设备非常重要，有助于减少记录中的噪声；如果仍有明显噪声，应使用法拉第笼。正极应牢固地置于角膜中央，并在开始全视野ERG方案前及完成后检查其位置是否正确。该电极必须仅与角膜接触；若接触眼睑甚至胡须，均可能导致信号波幅下降。本方案中使用一根松散的棉线以防止眼睑接触正极。一些研究人员已开发出内置正极的接触镜片，以确保可靠的接触并防止眼睑触碰电极¹²。

光刺激设置

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PC 计算机
Powerlab，四通道数据采集硬件	AD Instruments	PL 35044	ERG 信号采集
动物生物放大器	AD Instruments	FE 136	ERG 信号放大器
Lab chart	AD Instruments		信号采集软件
全视野刺激仪（Ganzfield）	Photometric solutions	FS-250A	光刺激设备
Ganzfield 操作系统	Photometric solutions
研究用辐射计	International light technologies	ILT-1700	校准光强序列
照度计		LX-1010B	检测红光照明强度
Excel	Microsoft
导线	AD Instruments		连接正极、负极和接地电极至放大器
鳄鱼夹导线	AD Instruments		将 Ganzfield 和采集硬件接地至计算机
95% 铂丝	A&E metals		正极电极
口腔电极 Ag/AgCl 颗粒	SDR	E205	负极电极
26 G 针头	BD		接地电极
水泵
水浴锅
管路
带柔性探头的恒温毯系统	Harvard Apparatus	507222F
阿托品 1% w/v	Bausch & Lomb		局部散瞳剂
丙美卡因 0.5% w/v	Bausch & Lomb		局部麻醉剂
Visco tears 眼药水	Novartis		卡波姆聚合物
缝合线			牵拉眼睑
镊子
可重复使用粘合剂	Blu tac		固定红光头灯及电极
吸水垫料
Ketamil - 氯胺酮 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		分离麻醉剂
Xylium - 赛拉嗪 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		肌肉松弛剂
电子天平