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方法文章

斑马鱼幼鱼视觉反应的视网膜电图分析

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⸱

DOI：

10.3791/52662

⸱

2015年3月16日

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Ophthalmology, Duke University

本文内容

摘要

我们介绍一种利用显微操作和视网膜电图（ERG）技术对斑马鱼幼鱼进行视网膜电图分析的方法。该方法简便直接，适用于检测斑马鱼幼鱼的视觉功能。 体内.

摘要

视网膜电图（ERG）是一种无创的电生理学方法，用于评估视网膜功能。通过将电极置于角膜表面，可记录视网膜对光刺激产生的电活动，进而用于评价视网膜细胞的功能状态。 体内本文描述了使用视网膜电图（ERG）测量斑马鱼视觉功能的方法。斑马鱼长期以来被用作脊椎动物发育的模型，因其可通过吗啉代寡核苷酸实现基因抑制，并易于进行药理学干预。在受精后5-10天（5-10 dpf），幼鱼视网膜中仅有视锥细胞具有功能。因此，与其他动物不同，斑马鱼是研究视锥细胞视觉功能的有力模型系统。 体内本方案采用斑马鱼研究实验室常用的标准化麻醉、显微操作和体视显微镜技术。所述方法利用标准的电生理设备和低照度相机，引导记录微电极准确放置于幼鱼角膜表面。此外，我们展示了如何将一种 commercially available 的ERG刺激/记录系统（最初设计用于小鼠）简便地改造用于斑马鱼。对斑马鱼幼鱼进行视网膜电图（ERG）检测，是评估经吗啉寡核苷酸注射或新型基因组编辑技术（包括锌指核酸酶ZFNs、转录激活样效应因子核酸酶TALENs以及成簇规律间隔短回文重复序列CRISPR/Cas9系统）修饰后动物锥体细胞视觉功能的优良方法，这些技术显著提高了斑马鱼基因靶向的效率与效果。此外，我们利用药理学试剂可穿透斑马鱼幼体的特点，进一步评估参与光反应的分子组分。本方案描述的实验装置可根据研究人员不同的实验目的进行调整和应用。

引言

视网膜电图（ERG）是一种非侵入性电生理学方法，已广泛应用于临床以评估人类视网膜功能。该方法通过在角膜外表面放置记录电极，测量视网膜对光刺激产生的电活动。刺激范式和反应波形的特征决定了参与该反应的视网膜神经元类型。该技术已被适配用于多种动物模型，包括小鼠和斑马鱼。典型的脊椎动物ERG反应包含四个主要成分：a波，为源自感光细胞活动的角膜负向电位；b波，为源自ON双极细胞的角膜正向电位；d波，为解释为OFF双极细胞活动的角膜正向电位；以及c波，出现在b波数秒之后，反映穆勒胶质细胞和视网膜色素上皮的活动。1-4有关理解人类及模式动物ERG分析历史与原理的更多参考文献，包括犹他大学的在线教科书Webvision，以及《视觉临床电生理学原理与实践》等著作。4,5.

Danio rerio（斑马鱼）因其快速发育和身体透明的特性，长期以来被广泛用作脊椎动物发育研究的模型，其透明性使得无需侵入即可对器官系统进行形态学分析，并可用于行为学检测以及正向和反向遗传筛选（综述见 Fadool 和 Dowling6）。斑马鱼幼体易于进行遗传和药理学操作，加之其繁殖力高，使其成为高通量生物学分析的理想动物模型。斑马鱼幼体中视锥细胞与视杆细胞的比例较高——约为1:1，而小鼠仅为约3%视锥细胞——因此在视锥细胞功能研究中尤为适用7-9。

在脊椎动物视网膜中，视锥细胞比视杆细胞更早发育10。有趣的是，斑马鱼的视锥细胞早在4日龄时就已具备功能，使得在此阶段可对其进行选择性的电生理分析6,11,12。相比之下，视杆细胞的ERG反应出现在11至21日龄之间13。因此，4至7日龄的斑马鱼幼鱼在功能上相当于一个全视锥细胞视网膜。然而，4至7日龄幼鱼的天然明视觉ERG反应主要由b波主导。使用药理学试剂，如L-(+)-2-氨基-4-膦酰基丁酸（L-AP4）——一种作用于ON双极细胞表达的代谢型谷氨酸（mGluR6）受体的激动剂，可有效阻断b波的产生，从而揭示出分离的视锥细胞群感受器电位（即“a波”）14-17。

本文介绍一种利用市售的、专为小鼠设计但已改进适用于斑马鱼幼鱼的ERG设备进行ERG分析的简单且可靠的方法。该系统可用于具有不同遗传背景的斑马鱼幼鱼，以及经药理学试剂处理的个体，以帮助研究人员鉴定参与视觉敏感性和光适应的信号通路16。本实验方案中所述的实验步骤将指导研究人员利用ERG分析技术回答多种与视觉相关的生物学问题，并展示一种灵活的ERG装置的构建方法。

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方案

动物饲养和实验方案已获得北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物照护与使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）实验动物福利办公室以及国际实验动物评估与认证协会的所有要求。
注：为获得用于视网膜电图（ERG）分析的幼鱼，采用了已发表的标准斑马鱼饲养与维护方案18。幼鱼通过自然交配获得，并在14小时光照/10小时黑暗的循环条件下饲养。本方案已针对受精后5-7天（dpf）的幼鱼优化，但经过对操作步骤进行少量修改后，也可理想地应用于更年长的鱼类。此处使用5 dpf的野生型斑马鱼TL品系幼鱼。

1. 微量移液器的制备

  1. 使用1.5 × 0.86 mm（外径×内径）含丝硼硅酸盐玻璃毛细管（熔点821 °C）和配备盒式加热丝的P-97 Flaming/Brown微电极拉制仪，拉制若干微电极。采用表1中所述程序制备微电极。
  2. 在显微镜下使用适当的刻度尺检查每个微电极，确保尖端直径为10–15 µm，并具有光滑的开口（即无锯齿状边缘）。
  3. 小心存放微电极，防止尖端损坏或接触灰尘。可选用带实验室胶带的培养皿、泡沫衬里盒或市售的微电极储存容器进行储存。
    注意：只要能获得正确直径和高质量尖端的微电极，也可使用其他类型的微电极拉制仪和玻璃毛细管。
压力热量拉力速度时间
500560-30200
500450-30200
5004105540200

表1： 使用配备盒式加热丝的P-97 Flaming/Brown微电极拉制仪制备微电极的程序。 微电极采用带纤维丝的1.5 × 1.0 mm2（外径×内径）火焰抛光硼硅酸盐玻璃毛细管（熔点821 °C）制备。

2. 缓冲液的配制

  1. 在微电极毛细管中使用经过滤且充氧的金鱼林格氏液19，并用其饱和实验中放置幼虫的聚乙烯醇（PVA）海绵。也可选用E3胚胎培养基或亨克氏平衡盐溶液。
  2. 按照表2所述配制10倍浓度的金鱼林格氏液。调节pH至7.8，使用0.22 µm滤器灭菌，并将10倍储存液置于4 °C保存。
  3. 在实验当天，将10倍林格氏液用去离子蒸馏水稀释至1倍工作浓度。使用0.22 µm滤器系统过滤，并用95% O2/5% CO2气体鼓泡充氧10分钟。之后 tightly 密封，以确保溶液保持充氧状态。
NaCl1.25 M
KCl26 mM
CaCl225 mM
MgCl210 mM
葡萄糖100 mM
HEPES100 mM

表2： 10倍金鱼林格液的配制。

3. 视网膜电图平台

  1. 在法拉第笼内的防震台上进行ERG实验，以提高信噪比。使用六角螺母将定制的钢制平台固定在防震台上。在光源下方的台面上放置一个带有粘弹性聚氨酯减震底座的可移动塑料平台。
  2. 使用磁性支架将摄像头固定，使其朝下对准可移动塑料平台。使用第二个磁性支架将显微操作器（用于固定记录微电极）置于可移动塑料平台右侧。确保摄像头和显微操作器不会因其他设备的移动而受到干扰，且不会遮挡光源的照明。
  3. 将摄像头连接至视频监视器，并调整位置以便观察幼虫的眼睛，从而将电极准确放置于适当位置。
  4. 确保整个装置通过铜线正确接地。为检测噪声，将参考电极和记录微电极的尖端置于盛有任氏液的35 mm培养皿中。使用示波器或ERG设备内置功能检测装置的电噪声水平，噪声水平应不超过基线的±10 µV。

4. 海绵制备

  1. 裁剪一小块干燥的PVA海绵，使其能紧密贴合于35 mm培养皿中。海绵的厚度不应超过培养皿的深度。使用带有洁净剃须刀片的美工刀进行切割。
  2. 在海绵上再做一次切口，以容纳参比电极（可在海绵底部沿长度方向做浅切口，或在较小的一端垂直进行蝴蝶形切口）。
  3. 使用耐化学腐蚀的标记笔在海绵上标记一个小点（用于放置幼虫的位置），以便于相机定位。
  4. 将PVA海绵浸入任氏液中直至完全饱和。取出后在纸巾上快速轻压2–3次以吸去多余液体。将海绵放入洁净的35 mm培养皿中。
  5. 将盛有海绵的培养皿置于塑料平台上，调整位置使标记点可被相机清晰观察到。

5. 电极制备

注意：斑马鱼记录装置包括一个与浸有任氏液的聚乙烯醇（PVA）海绵接触的参考电极，以及一个与角膜接触的记录电极。参考电极由 Ag/AgCl 颗粒构成。记录电极为一根拉制的玻璃微电极，内充任氏液，并由含银丝的微电极夹持器固定。

  1. 将电极浸入6-9%的次氯酸钠（漂白剂）中进行氯化处理，记录微电极丝处理5分钟，参比电极处理15分钟。随后在Kimwipe纸上室温干燥5分钟。
    1. 根据第4.2步所做切口的类型，将参比电极的Ag/AgCl小球置于海绵内（适用于垂直蝴蝶形切口）或海绵下方（适用于底部纵向浅切口）。将参比电极导线连接至记录系统。
    2. 或者，若ERG装置空间受限，或Ag/AgCl电极产生较强的光伏伪迹，可通过琼脂盐桥将参比电极与海绵连接，以使电极移出光路。
  2. 将约40 cm长度、合适尺寸的管路连接至5 ml非鲁尔锁型注射器。用任氏液（Ringer's solution）充满注射器。带有压力接口的微电极夹持器通常随附适配器，可兼容内径为1/16”、3/32”、1/8”或5/32”的管路。
  3. 用1 ml非鲁尔锁型注射器吸取任氏液，并使用Micro-fil小心地填充微电极夹持器，避免气泡产生。
  4. 将5 ml注射器通过管路连接至微电极夹持器的压力接口，并用于确保夹持器内部完全充满任氏液。使用Micro-fil和装有任氏液的1 ml注射器，从尖端开始填充玻璃微移液管，确保无气泡存在。
  5. 将玻璃微移液管安装至微电极夹持器上，注意保持电极丝笔直。固定后，使用5 ml注射器缓慢推动任氏液通过微电极，直至电极尖端可见微量液体渗出。在未接触角膜时，偶尔对注射器施加压力，可防止微移液管尖端形成气泡，以及因灰尘或盐分沉积导致的堵塞。
    1. 若液体以连续液流形式流出，应更换玻璃微移液管，因其尖端开口过大或已受损。
  6. 小心将记录微电极安装至显微操作器上，并将导线连接至记录系统。

6. 视网膜电图分析

注意：由于幼体视网膜以视锥细胞为主，因此在低强度的间接白光（<1 勒克斯）下或在较高强度（≤250 勒克斯）工作光源下短暂暴露（<1 分钟）进行记录准备时，即可获得高质量的视网膜电图（ERG）结果。记录前仍需进行短暂的暗适应（见步骤 6.7）。然而，也可在红光或红外光下使用红外敏感相机进行实验。所有实验均使用来自北卡罗来纳大学斑马鱼养殖设施的滤膜除菌（0.22 µm）系统水进行，但也可使用其他胚胎培养液。

  1. 剪取约1 cm的纸巾方块2.
  2. 若测量孤立的视锥细胞质量受体电位，将3-5条幼虫置于系统水中，加入500 µM (±)-2-氨基-4-磷酸丁酸（APB），孵育5分钟。
    注意：虽然APB是AP4的活性（L）形式与非活性（R）形式的外消旋混合物，但其效果与L-AP4相当，且成本更低。
  3. 在系统培养水中加入0.02% (w/v) 三卡因麻醉3-5条幼虫，直至无反应，约1-2分钟。
  4. 使用巴斯德移液管和移液泵，在解剖显微镜下以最低光照（≤250 勒克斯）将单个幼虫小心转移至纸巾方块上 <1 分钟）。检查每条幼虫的位置，选择背侧朝上且眼睛未被遮挡的候选个体。
    1. 对于长时间记录（>30分钟），用细小的骆毛刷将3%甲基纤维素涂抹于幼虫体表以保持湿润，注意不要涂到头部。
  5. 用镊子将带有幼虫的纸巾块转移到湿润的PVA海绵上。
    1. 对于长时间记录（>30 分钟），持续通入经水饱和的 100% O₂2 通过将气体通入盛有蒸馏水的侧臂烧瓶中的砂芯曝气头，使气体加湿后覆盖幼虫。将从烧瓶侧臂引出的导管置于幼虫头部附近，以输送加湿的氧气。
      注意：步骤 6.4.1 和步骤 6.5.1 将延长鱼类的寿命16.
  6. 在微弱光照下，使用显微操作仪和摄像头将微电极尖端定位在眼睛鼻侧与尾侧末端的中点处，并轻柔地压向角膜的背侧边缘。
    注意：电极尖端若放置于角膜远端区域，可能导致视网膜电图（ERG）波形出现极性反转。
  7. 让幼虫在暗处适应5-10分钟。
  8. 使用现有的刺激和记录设备，记录来自LED光源或光学刺激器的测试闪光反应。根据实验需求调整实验参数，如闪光强度、闪光持续时间、闪光颜色、背景光强度与颜色以及滤光片设置。
  9. 实验结束后，根据 AVMA/IACUC 指南对幼虫实施安乐死。

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结果

通常在斑马鱼幼体发育至5天时（5 dpf）记录视网膜电图（ERG），因为已有大量研究在该阶段发表了ERG记录结果9,16,20。在暗适应条件下，使用持续20毫秒的白色LED光刺激，无背景光照，测量幼体的反应。我们采用了一套商用ERG系统，包含全视野光刺激器及计算机控制器/记录仪。该刺激器使用严格控制的专有脉冲宽度调制（PWM）系统，调节背景光和闪光刺激的亮度。反应信号通过专有的全差分放大器记录，该放大器配备硬件抗混叠滤波器，驱动16位模数转换器（ADC）。刺激与反应记录由设备配套的专有软件根据制造商协议进行控制。我们的设备设置为1 kHz的采样率，数字贝塞尔级联滤波器设定为0.312 Hz至300 Hz的带通范围，并使用60 Hz陷波滤波器以去除额外噪声。在暗适应的幼体中，b波振幅随光强增加而增大（图1）。a波通常被b波掩盖，难以可靠检测。通过将幼体与代谢型谷氨酸受体（mGluR6）激动剂4-磷酸丁酸（APB）孵育，可阻断b波，从而检测到视锥细胞群体受体电位（即“a波”）。该“a波”反应的振幅亦随光强增加而增大（图2）。

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讨论

在本方案中，详细描述了一种对幼年斑马鱼进行ERG记录的简单操作流程。该方法可快速、全面地检测视觉功能。整个操作过程中有几个关键步骤需特别注意。实验前应确保斑马鱼幼体健康，以防止在潜在药物处理期间发生死亡，并保证ERG记录期间较长的存活时间。此外，实验所用幼体的年龄应尽可能一致，这是因为视网膜发育迅速（即，视锥细胞亚型的差异发育）以及幼虫的整体形态和生理特性。例如，在受精后7天（7 dpf）之后，上皮呼吸效率下降，使得维持鱼类存活更加困难。另一个重要因素是记录电极和参考电极的质量。在拉制玻璃毛细管时需格外小心，以避免产生边缘粗糙的尖端。可使用微电极火焰抛光仪对拉制后的电极进行火抛光，以改善信号采集质量。此外，维持Ag/AgCl电极的性能也极为重要。使用后必须立即用蒸馏水冲洗并自然晾干。虽然电极外表面随时间变暗通常不会影响其性能，但应避免使用变色（由黄色至深红色）或表面出现凹坑的电极。切勿用手直接接触电极，因为蛋白质污染可能对电极性能产生不利影响。最后需注意，Ag/AgCl电极具有光敏性，若未加以遮蔽，可能引起闪光伪迹。然而，我们发现这些伪迹通常极轻微（参见图注） 图1 和

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢北卡罗来纳大学斑马鱼养殖设施的工作人员对斑马鱼的维护。我们还要感谢 Diagnosys, LLC 在ERG设备安装过程中提供的帮助。特别感谢 Portia McCoy 博士以及 Ben Philpot 博士实验室在电生理学方法方面给予的支持。我们还感谢 Lizzy Griffiths 为幼体斑马鱼提供的插图。本研究得到了美国国立卫生研究院基金资助：F32 EY022279（授予 J.D.C）和 R21 EY019758（授予 E.R.W）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
法拉第笼80/20 Inccustom定制的铝制"工业 Erector 组合"，用于笼体框架
聚乙烯醇（PVA）海绵AmazonB000ZOWG1C为斑马鱼幼体提供柔软、湿润的放置平台
150 ml 无菌滤器系统Corning431154过滤溶液，防止微小颗粒堵塞微量移液管
Espion E2Diagnosys, LLCcontact模块化电生理系统，可为任意刺激器生成视觉刺激，并通过专有软件进行反应的数字记录与分析，更多信息请访问 http://www.diagnosysllc.com
ColordomeDiagnosys, LLCcontact配备 RGB LED 和氙灯光源的光刺激器，用于全视野视网膜电图（Ganzfeld ERG），更多信息请访问 http://www.diagnosysllc.com
显微操作器Drummond3-000-024-R用于固定和定位记录微电极
磁力搅拌器支架Drummond3-000-025-MB用于固定和定位相机及参考电极
导联延长线Grass TechnologiesF-LX备用的雌雄1.5 mm导联电缆，用于连接电极
雄针转雌 SAFELEAD 适配器Grass TechnologiesDF-215/10连接2 mm插针与1.5 mm头板插针
窗纱框（金属）及压条Lowes 或 Home Depotvarious用于将铜网固定在法拉第笼框架上
Steriflip 50 ml 滤器MilliporeSCGP00525过滤溶液，防止微小颗粒堵塞微量移液管
BNC 适配器Monoprice4127连接相机与BNC电缆
BNC 电缆Monoprice626连接相机与视频适配器
相机镜头Navitar1582232用于观察记录微电极在幼体角膜上的定位
相机连接器Navitar1501149用于观察记录微电极在幼体角膜上的定位
Luna BNC 转 VGA + HDMI 转换器SewellSW-29297-PROBNC 转 VGA 适配器，使相机图像可投射至计算机显示器
APBSigmaA1910mGluR6 激动剂，可阻断 b 波，从而分析分离的视锥细胞群受体电位
硼硅酸盐玻璃SutterBF-150-86-10火焰抛光的硼硅酸盐玻璃（熔点 = 821°C），带细丝，尺寸为 1.5 mm × 0.86 mm（外径 × 内径） 
P97 Flaming/Brown 拉制仪SutterP97用于拉制玻璃微量移液管
Sorbothane 垫片ThorlabsSB12A合成粘弹性聚氨酯聚合物，置于被动隔振支架和ERG平台下方，用于吸收震动并防止滑动，可按需裁剪
光学平台板ThorlabsB2436F为ERG刺激器和斑马鱼样本提供振动隔离的平台
被动隔振支架ThorlabsPWA074为光学平台板提供振动隔离
铜网TWP022X022C0150W36T用于衬里法拉第笼
移液器泵VWR53502-233与巴斯德移液管配合使用，用于小心转移斑马鱼幼体
巴斯德移液管VWR14672-608与移液器泵配合使用，用于小心转移斑马鱼幼体
相机WatecWAT-902B用于观察记录微电极在幼体角膜上的定位
三卡因（MS-222）Western ChemicalTricaine-S药用级麻醉剂
Micro-filWPIMF28G-5用于填充微电极夹持器和微电极玻璃管
微电极夹持器WPIMEH2SW15用于固定玻璃微电极，并连接至ERG设备
参考电极WPIDRIREF-5SH小心折断外壳末端约1厘米，以排出电解液并暴露烧结的Ag/AgCl颗粒电极
参考电极（替代型号）WPIEP1DRIREF-5SH 的替代品。Ag/AgCl电极，需焊接导线连接至导联
低噪声电缆（用于微电极夹持器）WPI13620连接记录微电极夹持器与适配器/头板

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