我们介绍一种利用显微操作和视网膜电图（ERG）技术对斑马鱼幼鱼进行视网膜电图分析的方法。该方法简便直接，适用于检测斑马鱼幼鱼的视觉功能。 体内.
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摘要
摘要
视网膜电图（ERG）是一种无创的电生理学方法，用于评估视网膜功能。通过将电极置于角膜表面，可记录视网膜对光刺激产生的电活动，进而用于评价视网膜细胞的功能状态。 体内本文描述了使用视网膜电图（ERG）测量斑马鱼视觉功能的方法。斑马鱼长期以来被用作脊椎动物发育的模型，因其可通过吗啉代寡核苷酸实现基因抑制，并易于进行药理学干预。在受精后5-10天（5-10 dpf），幼鱼视网膜中仅有视锥细胞具有功能。因此，与其他动物不同，斑马鱼是研究视锥细胞视觉功能的有力模型系统。 体内本方案采用斑马鱼研究实验室常用的标准化麻醉、显微操作和体视显微镜技术。所述方法利用标准的电生理设备和低照度相机，引导记录微电极准确放置于幼鱼角膜表面。此外，我们展示了如何将一种 commercially available 的ERG刺激/记录系统（最初设计用于小鼠）简便地改造用于斑马鱼。对斑马鱼幼鱼进行视网膜电图（ERG）检测，是评估经吗啉寡核苷酸注射或新型基因组编辑技术（包括锌指核酸酶ZFNs、转录激活样效应因子核酸酶TALENs以及成簇规律间隔短回文重复序列CRISPR/Cas9系统）修饰后动物锥体细胞视觉功能的优良方法，这些技术显著提高了斑马鱼基因靶向的效率与效果。此外，我们利用药理学试剂可穿透斑马鱼幼体的特点，进一步评估参与光反应的分子组分。本方案描述的实验装置可根据研究人员不同的实验目的进行调整和应用。
引言
视网膜电图（ERG）是一种非侵入性电生理学方法，已广泛应用于临床以评估人类视网膜功能。该方法通过在角膜外表面放置记录电极，测量视网膜对光刺激产生的电活动。刺激范式和反应波形的特征决定了参与该反应的视网膜神经元类型。该技术已被适配用于多种动物模型，包括小鼠和斑马鱼。典型的脊椎动物ERG反应包含四个主要成分：a波，为源自感光细胞活动的角膜负向电位；b波，为源自ON双极细胞的角膜正向电位；d波，为解释为OFF双极细胞活动的角膜正向电位；以及c波，出现在b波数秒之后，反映穆勒胶质细胞和视网膜色素上皮的活动。1-4有关理解人类及模式动物ERG分析历史与原理的更多参考文献，包括犹他大学的在线教科书Webvision，以及《视觉临床电生理学原理与实践》等著作。4,5.
Danio rerio（斑马鱼）因其快速发育和身体透明的特性，长期以来被广泛用作脊椎动物发育研究的模型，其透明性使得无需侵入即可对器官系统进行形态学分析，并可用于行为学检测以及正向和反向遗传筛选（综述见 Fadool 和 Dowling6）。斑马鱼幼体易于进行遗传和药理学操作，加之其繁殖力高，使其成为高通量生物学分析的理想动物模型。斑马鱼幼体中视锥细胞与视杆细胞的比例较高——约为1:1，而小鼠仅为约3%视锥细胞——因此在视锥细胞功能研究中尤为适用7-9。
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方案
动物饲养和实验方案已获得北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物照护与使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）实验动物福利办公室以及国际实验动物评估与认证协会的所有要求。
注：为获得用于视网膜电图（ERG）分析的幼鱼，采用了已发表的标准斑马鱼饲养与维护方案18。幼鱼通过自然交配获得，并在14小时光照/10小时黑暗的循环条件下饲养。本方案已针对受精后5-7天（dpf）的幼鱼优化，但经过对操作步骤进行少量修改后，也可理想地应用于更年长的鱼类。此处使用5 dpf的野生型斑马鱼TL品系幼鱼。
1. 微量移液器的制备
- 使用1.5 × 0.86 mm（外径×内径）含丝硼硅酸盐玻璃毛细管（熔点821 °C）和配备盒式加热丝的P-97 Flaming/Brown微电极拉制仪，拉制若干微电极。采用表1中所述程序制备微电极。
- 在显微镜下使用适当的刻度尺检查每个微电极，确保尖端直径为10–15 µm，并具有光滑的开口（即无锯齿状边缘）。
- 小心存放微电极，防止尖端损坏或接触灰尘。可选用带实验室胶带的培养皿、泡沫衬里盒或市售的微电极储存容器进行储存。
注意：只要能获得正确直径和高质量尖端的微电极，也可使用其他类型的微电极拉制仪和玻璃毛细管。
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结果
通常在斑马鱼幼体发育至5天时（5 dpf）记录视网膜电图（ERG），因为已有大量研究在该阶段发表了ERG记录结果9,16,20。在暗适应条件下，使用持续20毫秒的白色LED光刺激，无背景光照，测量幼体的反应。我们采用了一套商用ERG系统，包含全视野光刺激器及计算机控制器/记录仪。该刺激器使用严格控制的专有脉冲宽度调制（PWM）系统，调节背景光和闪光刺激的亮度。反应信号通过专有的全差分放大器记录，该放大器配备硬件抗混叠滤波器，驱动16位模数转换器（ADC）。刺激与反应记录由设备配套的专有软件根据制造商协议进行控制。我们的设备设置为1 kHz的采样率，数字贝塞尔级联滤波器设定为0.312 Hz至300 Hz的带通范围，并使用60 Hz陷波滤波器以去除额外噪声。在暗适应的幼体中，b波振幅随光强增加而增大（图1）。a波通常被b波掩盖，难以可靠检测。通过将幼体与代谢型谷氨酸受体（mGluR6）激动剂4-磷酸丁酸（APB）孵育，可阻断b波，从而检测到视锥细胞群体受体电位（即“a波”）。该“a波”反应的振幅亦随光强增加而增大（图2）。
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讨论
在本方案中，详细描述了一种对幼年斑马鱼进行ERG记录的简单操作流程。该方法可快速、全面地检测视觉功能。整个操作过程中有几个关键步骤需特别注意。实验前应确保斑马鱼幼体健康，以防止在潜在药物处理期间发生死亡，并保证ERG记录期间较长的存活时间。此外，实验所用幼体的年龄应尽可能一致，这是因为视网膜发育迅速（即，视锥细胞亚型的差异发育）以及幼虫的整体形态和生理特性。例如，在受精后7天（7 dpf）之后，上皮呼吸效率下降，使得维持鱼类存活更加困难。另一个重要因素是记录电极和参考电极的质量。在拉制玻璃毛细管时需格外小心，以避免产生边缘粗糙的尖端。可使用微电极火焰抛光仪对拉制后的电极进行火抛光，以改善信号采集质量。此外，维持Ag/AgCl电极的性能也极为重要。使用后必须立即用蒸馏水冲洗并自然晾干。虽然电极外表面随时间变暗通常不会影响其性能，但应避免使用变色（由黄色至深红色）或表面出现凹坑的电极。切勿用手直接接触电极，因为蛋白质污染可能对电极性能产生不利影响。最后需注意，Ag/AgCl电极具有光敏性，若未加以遮蔽，可能引起闪光伪迹。然而，我们发现这些伪迹通常极轻微（参见图注） 图1 和
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢北卡罗来纳大学斑马鱼养殖设施的工作人员对斑马鱼的维护。我们还要感谢 Diagnosys, LLC 在ERG设备安装过程中提供的帮助。特别感谢 Portia McCoy 博士以及 Ben Philpot 博士实验室在电生理学方法方面给予的支持。我们还感谢 Lizzy Griffiths 为幼体斑马鱼提供的插图。本研究得到了美国国立卫生研究院基金资助：F32 EY022279（授予 J.D.C）和 R21 EY019758（授予 E.R.W）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 法拉第笼 | 80/20 Inc | custom | 定制的铝制"工业 Erector 组合"，用于笼体框架 |
| 聚乙烯醇（PVA）海绵 | Amazon | B000ZOWG1C | 为斑马鱼幼体提供柔软、湿润的放置平台 |
| 150 ml 无菌滤器系统 | Corning | 431154 | 过滤溶液，防止微小颗粒堵塞微量移液管 |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | 模块化电生理系统，可为任意刺激器生成视觉刺激，并通过专有软件进行反应的数字记录与分析，更多信息请访问 http://www.diagnosysllc.com |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | 配备 RGB LED 和氙灯光源的光刺激器，用于全视野视网膜电图（Ganzfeld ERG），更多信息请访问 http://www.diagnosysllc.com |
| 显微操作器 | Drummond | 3-000-024-R | 用于固定和定位记录微电极 |
| 磁力搅拌器支架 | Drummond | 3-000-025-MB | 用于固定和定位相机及参考电极 |
| 导联延长线 | Grass Technologies | F-LX | 备用的雌雄1.5 mm导联电缆，用于连接电极 |
| 雄针转雌 SAFELEAD 适配器 | Grass Technologies | DF-215/10 | 连接2 mm插针与1.5 mm头板插针 |
| 窗纱框（金属）及压条 | Lowes 或 Home Depot | various | 用于将铜网固定在法拉第笼框架上 |
| Steriflip 50 ml 滤器 | Millipore | SCGP00525 | 过滤溶液，防止微小颗粒堵塞微量移液管 |
| BNC 适配器 | Monoprice | 4127 | 连接相机与BNC电缆 |
| BNC 电缆 | Monoprice | 626 | 连接相机与视频适配器 |
| 相机镜头 | Navitar | 1582232 | 用于观察记录微电极在幼体角膜上的定位 |
| 相机连接器 | Navitar | 1501149 | 用于观察记录微电极在幼体角膜上的定位 |
| Luna BNC 转 VGA + HDMI 转换器 | Sewell | SW-29297-PRO | BNC 转 VGA 适配器，使相机图像可投射至计算机显示器 |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 激动剂，可阻断 b 波，从而分析分离的视锥细胞群受体电位 |
| 硼硅酸盐玻璃 | Sutter | BF-150-86-10 | 火焰抛光的硼硅酸盐玻璃（熔点 = 821°C），带细丝，尺寸为 1.5 mm × 0.86 mm（外径 × 内径） |
| P97 Flaming/Brown 拉制仪 | Sutter | P97 | 用于拉制玻璃微量移液管 |
| Sorbothane 垫片 | Thorlabs | SB12A | 合成粘弹性聚氨酯聚合物，置于被动隔振支架和ERG平台下方，用于吸收震动并防止滑动，可按需裁剪 |
| 光学平台板 | Thorlabs | B2436F | 为ERG刺激器和斑马鱼样本提供振动隔离的平台 |
| 被动隔振支架 | Thorlabs | PWA074 | 为光学平台板提供振动隔离 |
| 铜网 | TWP | 022X022C0150W36T | 用于衬里法拉第笼 |
| 移液器泵 | VWR | 53502-233 | 与巴斯德移液管配合使用，用于小心转移斑马鱼幼体 |
| 巴斯德移液管 | VWR | 14672-608 | 与移液器泵配合使用，用于小心转移斑马鱼幼体 |
| 相机 | Watec | WAT-902B | 用于观察记录微电极在幼体角膜上的定位 |
| 三卡因（MS-222） | Western Chemical | Tricaine-S | 药用级麻醉剂 |
| Micro-fil | WPI | MF28G-5 | 用于填充微电极夹持器和微电极玻璃管 |
| 微电极夹持器 | WPI | MEH2SW15 | 用于固定玻璃微电极，并连接至ERG设备 |
| 参考电极 | WPI | DRIREF-5SH | 小心折断外壳末端约1厘米，以排出电解液并暴露烧结的Ag/AgCl颗粒电极 |
| 参考电极（替代型号） | WPI | EP1 | DRIREF-5SH 的替代品。Ag/AgCl电极，需焊接导线连接至导联 |
| 低噪声电缆（用于微电极夹持器） | WPI | 13620 | 连接记录微电极夹持器与适配器/头板 |
参考文献
- Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, ....
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