无创评估人类皮质运动神经元传导的变化

摘要

本研究旨在评估重复经颅磁刺激后人类皮质运动神经元突触传递的变化。为此，介绍了一种电生理学方法，可用于评估通路特异性的皮质脊髓传递， 即 快速、直接的皮质脊髓通路与多突触连接的区分

摘要

皮质脊髓通路是连接大脑与肌肉的主要通路，因此在运动控制和运动学习中具有重要意义。目前存在多种非侵入性电生理方法用于研究该通路的兴奋性和可塑性。然而，大多数方法基于复合电位的量化，忽略了皮质脊髓通路实际上由许多不同程度直接连接的通路组成。本文介绍一种可检测皮质脊髓传导中不同成分兴奋性的方法。这种称为H反射条件化技术的方法，能够评估最快（单突触）以及多突触的皮质脊髓通路的兴奋性。此外，通过使用两个不同的刺激部位——运动皮层和颈髓交界处，该方法不仅能区分皮层与脊髓水平的作用，还可评估皮质运动神经元突触的传导功能。在本文中，我们描述了如何利用该方法评估低频重复经颅磁刺激后皮质运动神经元传导功能的变化，此前研究表明该刺激可降低皮层神经元的兴奋性。本文结果表明，这种重复刺激不仅影响皮层神经元，还影响脊髓水平的皮质运动神经元突触传导。这一发现对于理解神经可塑性的基本机制及其发生部位具有重要意义。除了用于基础机制研究外，H反射条件化技术还可用于检测行为干预（例如，训练）、治疗干预、病理状态或衰老过程中皮质脊髓传导的变化，从而更深入地理解运动控制和运动学习背后的神经机制。

引言

在灵长类动物中，皮质脊髓束是控制随意运动的主要下行通路¹。皮质脊髓通路通过直接的单突触皮质-运动神经元连接以及间接的寡突触和多突触连接，将运动皮层区域与脊髓α-运动神经元相连接^2,3。尽管可通过经颅磁刺激（Transcranial Magnetic Stimulation, TMS）非侵入性地轻易激活运动皮层，但由此诱发的肌电图反应通常难以解释。其原因是，复合运动诱发电位（MEP）可能受到皮层内神经元、皮质脊髓神经元、脊髓中间神经元以及脊髓α-运动神经元兴奋性变化的影响^4,5,6,7。目前已有多种非侵入性电生理技术与刺激方案，旨在判断皮质脊髓兴奋性与传导性的改变是源于皮层水平还是脊髓水平的变化。通常，电刺激诱发的H反射幅度的变化被用作“提示性指标”来反映运动神经元池兴奋性的改变。然而，先前研究表明，H反射不仅依赖于运动神经元池的兴奋性，还受到其他因素的调节，例如突触前抑制^8,9或同突触后激活抑制^5,10。在比较MEP与H反射时的另一个局限性在于无法检测中间神经元水平的兴奋性变化^11,12。此外，外周神经刺激对运动神经元的激活方式可能与TMS不同，因此运动神经元兴奋性的改变对这两种刺激所诱发反应的影响方式也可能不同，特别是与经皮质脊髓通路介导的反应相比时更为明显^13,14,15。

另一种用于区分脊髓与皮层效应的方法是运动皮层的经颅电刺激（Transcranial Electrical Stimulation, TES）¹⁶。在低强度刺激条件下，TES被认为不受皮层兴奋性变化的影响。由于TES和TMS均通过皮质脊髓通路激活α-运动神经元，因此比较磁刺激和电刺激诱发的运动诱发电位（MEP）比比较H反射与MEP更能有效推断MEP幅值变化的皮层来源。然而，当刺激强度增加时，TES诱发的MEP也会受到皮层兴奋性变化的影响^17,18。这一问题可通过将电刺激施加于延髓颈交界处而非运动皮层来避免。然而，尽管电刺激可在上肢和下肢肌肉中诱发延髓颈运动诱发电位（cMEPs），但大多数受试者认为在脑干（及皮层）施加的电刺激极为不适且疼痛。一种疼痛较轻的替代方法是利用枕外隆凸处的磁刺激激活延髓颈交界处的皮质脊髓通路¹⁹。目前普遍认为，延髓颈磁刺激（Cervicomedullary Magnetic Stimulation, CMS）激活了与运动皮层TMS相似的大量下行纤维，通过比较MEP与cMEP可检测皮层兴奋性的变化¹⁹。皮层内神经元和皮质运动神经元兴奋性的升高被认为可促进皮层诱发的MEP，而延髓颈诱发的MEP则无相应改变。

然而，在大多数受试者中，静息状态下难以在下肢获得磁刺激诱发的皮质脊髓肌反应（cMEP）^20,21。克服这一问题的一种方法是通过主动预收缩目标肌肉来提高脊髓运动神经元的兴奋性。然而，众所周知，收缩强度的微小变化会影响cMEP的幅度，因此不同任务之间的比较较为困难。此外，由于预收缩引起的运动神经元兴奋性变化对MEP和cMEP的影响程度可能并不相同。最后，通过比较复合MEP与复合cMEP，会丢失下行放电序列中包含的部分信息。这一点已在利用磁刺激运动皮层对腓肠肌、胫前肌和桡侧腕屈肌H反射进行条件化调控的研究中得到证实^12,22。通过结合外周神经刺激与运动皮层经颅磁刺激（TMS），并在特定的刺激间期（ISI）下进行，可以研究不同下行放电序列对H反射的易化和抑制效应。该技术深受动物实验中用于评估神经通路传导功能的空间易化技术的启发，可视为该技术的一种无创、间接版本²³。H反射不仅有助于区分皮质脊髓通路中的不同成分（快速与较慢的皮质脊髓投射），而且对于以可控且可比的方式提高脊髓兴奋性也至关重要。因此，无论在静息状态还是活动状态下，这种联合刺激技术均可实现对皮质脊髓通路中不同成分传导变化的高时间分辨率评估，i.e. 包括最快的、可能是单突触的皮质运动神经元连接以及较慢的寡突触和多突触通路^12,22,24,25。最近，该技术进一步扩展，不仅使用运动皮层（M1）的TMS对H反射进行条件化（M1-条件化），还增加了颈延交界处的附加条件化刺激（CMS-条件化）²⁶。通过比较M1与CMS条件化的作用效果，该技术能够以高时间分辨率实现通路特异性的区分，并有助于判断效应源于皮层机制还是脊髓机制。此外，就本研究而言最重要的是，该技术在考察早期易化现象时，可用于评估皮质运动神经元突触的传导功能。H反射的早期易化极有可能由直接的单突触皮质运动神经元投射激活脊髓运动神经元所致^12,26。为了检测最快的皮质脊髓通路，即早期易化效应，H反射需在TMS刺激前2至4毫秒诱发。其原因是MEP的潜伏期略短于H反射（MEP约为32 ms；见²⁷，H反射约为34 ms；见²⁵）。在外周刺激稍早于TMS施加时，上行与最快的下行兴奋将在脊髓运动神经元水平发生汇聚。当TMS施加于颈延交界处时，下行放电到达脊髓运动神经元池的时间比刺激M1时提前约3至4毫秒。因此，在CMS条件化中，外周神经刺激应比磁刺激提前6至8毫秒。CMS条件化后早期易化的改变提示皮质脊髓束与α运动神经元之间突触的传导发生差异性变化²⁸。在本研究中，我们采用了这一新近发展的技术，以区分低频重复经颅磁刺激（rTMS）后脊髓与皮层机制的作用。更具体而言，我们假设：若rTMS干预后M1条件化下的早期易化减弱，而CMS条件化下的早期易化未发生变化，则该效应应完全源于皮层；相反，若CMS条件化下的早期易化也发生改变，则该变化应与脊髓水平的机制有关。更确切地说，由于H反射的早期易化被认为是由直接的皮质运动神经元投射激活脊髓运动神经元所致^12,29，因此在早期易化时间点上，CMS与M1条件化H反射的改变应反映皮质运动神经元传导功能的变化，i.e. 突触效能的变化²⁸。

方案

本方案已获当地伦理委员会批准，实验遵循《赫尔辛基宣言》（1964年）。

1. 受试者准备

注意：受试者说明 - 实验开始前，应向每位受试者说明研究目的及潜在风险因素。对于经颅磁刺激（TMS），医学风险包括任何 历史 癫痫发作史、眼部和/或头部植入物、心血管系统任何疾病以及妊娠。凡确认存在上述任一风险因素的受试者均应排除。此外，在针对健康个体的实验中，还应排除所有患有神经系统和/或骨科疾病的受试者。

1. 受试者体位安置
   1. 将受试者置于一把能够支撑其腿部、躯干和头部的椅子上。确保双腿伸直，使膝关节处于伸展状态，从而使周围神经更接近皮肤，以便通过电刺激更易且更可靠地激发神经。
   2. 确保受试者头部前屈， resting 在稳定的支撑面（如桌面）上，并用软垫固定。确保颈部及枕寰关节处于前屈状态，以利于皮质脊髓束通路的刺激。
   3. 将双锥形磁线圈放置于枕外隆凸处或其附近，使感应电流的一阶导数方向朝向颅侧^19,26。使用弹性绑带固定头部和躯干，以确保在整个实验过程中保持该位置不变。
2. 使用表面电极通过周围神经刺激（PNS）和经颅磁刺激（TMS）记录电生理反应。
   1. 对腓肠肌肌腹区域的皮肤进行剃毛、异丙醇消毒和轻度磨砂处理。
      1. 在腓肠肌肌腹区域的皮肤上贴附自粘式肌电图（EMG）电极。参考电极置于骨性结构表面的皮肤上，例如髌骨或内踝。
      2. 将所有电极连接至肌电放大器，最终接入模数转换器。放大肌电信号（×1000），带通滤波（10 - 1000 Hz），采样频率为 4 kHz。
   2. 周围神经刺激（PNS）
      1. 为进行H反射条件化实验，通过在腘窝处刺激胫神经，在腓肠肌中记录H反射。采用持续时间为1 ms的方波脉冲进行刺激。刺激时，将5 cm × 5 cm的阳极电极用胶带固定于髌骨下方膝关节前方位置。
         注：稳定的H反射振幅是成功实现H反射条件化的前提，而腓肠肌在所有肌肉中表现出最小的变异性，因此最适合用于记录。
      2. 在腘窝区域移动阴极电极，直至找到最佳刺激位置。
         注：最佳位置是指能够在最低刺激强度下记录到腓肠肌H反射，且在该低强度刺激下肌电图记录中无可见M波，同时在拮抗肌胫前肌中无任何反应。
      3. 避免在胫前肌中引发反应，因为腓总神经Ia传入纤维对腓肠肌脊髓运动神经元的交互抑制可能影响实验结果。确定最佳位置后，在皮肤上贴附自粘电极并用胶带固定，以确保刺激条件的一致性。
   3. 经颅磁刺激（TMS）
      1. 使用“8”字形线圈对对侧半球的运动皮层区域进行经颅磁刺激（TMS），以在腓肠肌的肌电图记录中诱发运动诱发电位（MEPs）。
      2. 为寻找最佳刺激位点，首先将线圈置于头顶（vertex）并向前移动1 cm。线圈手柄应指向后方，使线圈中心感应电流的方向为从后向前。
      3. 以最大刺激器输出的约20 - 30%的低强度开始刺激，使受试者逐渐适应磁刺激。连续刺激之间的间隔设为4秒。
      4. 经过数次尝试后，将刺激强度增加至最大刺激器输出的约40 - 60%，并在前-喙侧和中-外侧方向移动线圈，以寻找腓肠肌的热点（hotspot）。热点定义为能够以最低刺激强度诱发腓肠肌MEPs的位置。
      5. 确定腓肠肌热点后，测定静息运动阈值（1.0 MT），即在连续10次刺激中至少有6次能够诱发肌电图中峰-峰振幅大于50 µV的MEP所需的最小刺激强度³⁰。对于背景肌电活动已接近50 µV的受试者，阈值应设为100 µV。
   4. 线圈固定
      1. 将受试者头部置于桌面上（参见"受试者体位安置"），并使用刚性泡沫材料防止头部在各个方向上的移动。将线圈固定于支架上，同时将受试者头部固定于椅子上。
      2. 使用魔术贴带将线圈固定于头部，并采用影像引导的TMS导航系统全程监测线圈与头部的相对位置。应避免线圈相对于受试者头部的任何微小移动，因为这会改变TMS对神经元的募集情况。
   5. 延髓脊髓交界处的磁刺激
      1. 将双锥形磁线圈置于延髓脊髓交界处，以激发皮质脊髓束的轴突。
      2. 放置线圈时，使其感应电流的一阶导数方向朝向颅侧，且线圈中心位于或靠近枕外隆凸。以最大刺激器输出（100%）进行刺激。
         注：即使采用如此高强度的刺激，在大多数受试者中，该刺激仍不足以充分募集脊髓运动神经元并激活下肢肌肉（即腓肠肌和胫前肌）。因此，延髓脊髓交界处刺激不会在下肢肌肉的表面肌电图中产生复合电位。因此，需将延髓脊髓刺激与H反射结合使用（参见"3.1），以提高脊髓运动神经元的兴奋性。

2. 测量前准备

1. 调节H反射（外周神经刺激）的大小
   1. 对于H反射的条件化训练，将H反射的幅度调整至最大M波（Mmax）的20% ³¹ 通过改变电刺激器的刺激强度来获得Mmax。为此，记录H反射的招募曲线，即施加不同刺激强度的刺激，每次刺激之间的间隔为4秒。
   2. 在线记录软件中，以肌电图（EMG）的峰峰值幅度（单位：mV）计算H反射和M波。实验全程需确保对照H反射的幅度始终保持在Mmax的20%，并检查每次试验中H反射的大小。若发现H反射幅度出现系统性偏离（即对照H反射持续小于或大于目标值），应在下一次试验开始前调整刺激强度。
2. 在实验前调整经颅磁刺激（TMS）的刺激强度。
   1. 在静息状态下进行H反射条件反射实验时，将经颅磁刺激（TMS）作用于运动皮层的刺激强度设定为运动阈值（MT）的90%–100%。确保在未施加外周神经刺激（PNS）的试验中未观察到运动诱发电位（MEP）。
      注意：为了确保在静息状态下对条件性H反射产生显著影响，从而使早期易化效应易于被检测，模拟刺激强度应接近最大刺激强度（MT）的100%。
   2. 调整经颅颈髓刺激强度。与皮层刺激不同，经颅颈髓刺激的刺激强度应始终调整至刺激器最大输出的100%。
3. 以运动皮层磁刺激调节H反射。
   1. 通过改变经颅磁刺激（TMS）与周围神经刺激（PNS）之间的刺激间隔时间（H反射易化），评估皮质运动神经元传导的变化。为检测早期易化效应，起始条件刺激的刺激间期（ISI）设为 -5 ms，并以毫秒为步长逐步调整ISI，范围从 -5 至 +1 ms图1B).
      注意：负的ISI表示PNS在TMS之前诱发，正的ISI表示相反情况。
   2. 在每次经颅磁刺激（TMS）与外周神经刺激（PNS）的刺激试验中，随机改变TMS与PNS之间的刺激间间隔（ISI），以避免因刺激顺序固定而产生偏差。
      注意： "早期易化" 应在对运动皮层应用经颅磁刺激（TMS）时，于ISIs -4 ms至-2 ms范围内出现。这意味着，此时最快的（单突触皮质脊髓通路）与周围神经刺激（PNS）引发的传入冲动在脊髓运动神经元处发生碰撞（参见5.2节以检测早期易化现象）。
   3. 将连续刺激试验之间的间隔设置为4秒。
4. 在颈髓交界处施加磁刺激以调节H反射。
   注意：使用延髓脊髓交界处刺激进行条件刺激时，皮质脊髓通路的兴奋部位比刺激运动皮层时更接近脊髓运动神经元。因此，对应于早期易化的刺激间期（ISI）大约前移3 - 4 ms。例如，在初级运动皮层进行经颅磁刺激（TMS）时，-4 ms的早期易化效应，在延髓脊髓交界处刺激条件下对应的ISI为-7 - -8 ms。
   1. 在颈髓交界处条件刺激时，使用 -9 至 -3 ms 的刺激间期（ISI），以 1 ms 为步长。在每次试验中，同时应用经颅磁刺激（TMS）作用于运动皮层和颈髓交界处，并在同一试验中记录对照 H 反射和对照运动诱发电位（MEP）。以对照 H 反射作为条件化 H 反射的参考，以对照 MEP 确保刺激条件具有可比性。在前测阶段至少记录十次试验。
5. 交替刺激运动皮层与延髓颈交界区
   1. 以随机顺序在同一试验中应用运动皮层磁刺激（M1-条件刺激；见2.1）和颈髓磁刺激（CMS-条件刺激；见2.2）对腓肠肌H反射进行条件化。
      注意：建议在同一次实验中交替应用 M1 和 CMS 条件刺激，以便将条件化后的 H 反射与同一组对照 H 反射进行比较（参见 图1).

3. 干预——慢速重复经颅磁刺激

1. 将刺激强度设置为1.2 MT，以诱导皮质脊髓兴奋性的持久抑制^32,33，这是H反射调节所必需的，因为H反射调节需要数分钟才能完成。在rTMS干预期间，以1 Hz的频率在初级运动皮层上应用TMS，持续20分钟。

4. 测量后处理

1. 干预结束后立即进行H反射条件化测试，使用的刺激间期（ISIs）应与测量前相同。
2. 对初级运动皮层（M1）和颈髓交界处进行磁刺激时，使用的刺激强度应与测量前一致。
3. 确保对照H反射的幅度与测量前相同。若发现系统性偏差，需调整刺激强度。

5. 数据处理

1. 将所有生理反应（如H反射、运动诱发电位和条件化H反射）计算为未整流EMG信号的峰-峰振幅。
   1. 对于每个ISI，分别对a）皮质刺激和b）颈髓刺激的十次条件化H反射进行平均。此外，对十次对照（即. 作为参考的非条件性H反射（unconditioned）H反射即 100%）用于条件化H反射。
   2. 因此，将每个ISI条件下条件性H反射的平均振幅表示为前后测量中对照H反射平均振幅的百分比。在确定早期易化时需格外谨慎，因其具有关键意义：
      注意：由于不同个体之间早期易化现象的出现存在差异，需在预测量阶段对每位受试者分别确定其早期易化情况。
2. 使用非参数 Wilcoxon 检验确定条件性 H 反射的首次升高。对于 CMS 条件刺激，从 ISI -9 ms 开始进行检验；对于 M1 条件刺激，从 ISI -5 ms 开始搜索早期易化。比较同一 ISI 下前测与后测所获得的早期易化幅度。
3. 此外，通过目视检查验证早期易化现象。
   注意：M1条件刺激后，早期易化最可能出现在ISI为-3 ms左右。在条件刺激的H反射首次升高后不久， 即 1到2毫秒后，条件化H反射在再次上升之前出现下降。在CMS条件刺激后，早期易化可能出现在约ISI -7毫秒处，即比M1条件刺激后大约早4毫秒。

结果

M1和CMS条件刺激后早期易化现象的出现

在M1区施加经颅磁刺激（TMS）进行H反射条件刺激后，早期易化效应出现在刺激间期（ISI）约为-3和-4 ms时。而脊髓刺激（CMS）条件刺激后的早期易化效应则提前约3 ms出现（ISI分别为-6和-7 ms）。一名受试者的典型ISI曲线如图1所示。本研究中，无论是在M1区还是CMS条件刺激下，均在早期易化效应出现后的首个毫秒内对其进行评估（见图1C、D）。因此，可以合理推测该早期易化效应反映了直接的单突触皮质脊髓通路的活动^12,22,24,

讨论

本文所述的H反射易化程序专门用于评估锥体束通路重复激活后，皮质运动神经元突触传递功能的急性变化²⁸。在此方面，H反射易化研究揭示了重复经颅磁刺激（rTMS）不仅影响皮质结构的兴奋性，还会对皮质运动神经元突触处的皮质运动神经传递产生作用。然而，该方法实际上可能具有更广泛的应用价值，因为皮质脊髓传递功能的变化可出现在运动发育与衰老、运动学习、锻炼与训练、疲劳、失活动、损伤后恢复、神经生理学及治疗性干预、病理状态等多种情况下。此外，只要遵循经颅磁刺激（TMS）的安全操作规范，该方法既可用于健康受试者，也可用于患者。

该方法可用于研究单次实验内的效应（如本研究中的情况），也可用于研究更长时间跨度的纵向效应。已有研究证实，M1-条件化技术能够可靠地评估某些干预后的效应，例如8周固定³⁵、4周平衡训练^36,37以及4周爆发性力量训练³⁶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自粘式肌电图电极	蓝色传感器 N，Ambu，Ballerup，丹麦		用于记录肌电图信号
电刺激器	Digitimer DS7A，赫特福德郡，英国		用于诱发比目鱼肌H反射
刺激电极	蓝色传感器 N，Ambu，丹麦巴勒鲁普		用于诱发比目鱼肌H反射
磁刺激仪 #1	Magstim Rapid2 TMS 刺激器，Magstim 公司，英国惠特兰		用于诱发腓肠肌对侧运动诱发电位
线圈 #1：90 毫米双圆形线圈	英国惠特兰，Magstim 公司有限公司		用于诱发腓肠肌对侧运动诱发电位
			刺激器 #1 和线圈 #1 在原始发表文献（Taube et al. 2014；Cerebral Cortex）中使用
磁刺激仪 #2	MagPro X100 配 MagOption，MagVenture A/S，丹麦法鲁姆		用于诱发腓肠肌对侧运动诱发电位
Co#2：95 mm 焦距 “蝴蝶形” 线圈（D-B80）	MagVenture A/S，法鲁姆，丹麦
视频实验中使用了刺激器2和线圈2
磁刺激器 #3	英国惠特兰，Magstim 公司有限公司		用于刺激延髓脊髓交界处
线圈 #3：双锥形磁线圈	英国惠特兰，Magstim 公司有限公司		用于刺激延髓-颈髓交界处
影像引导的经颅磁刺激导航系统 #1	Brainsight 2，Rouge Research，加拿大蒙特利尔		在原始发表文献（Taube et al. 2014；Cerebral Cortex）中用于在实验全程监测线圈位置
影像引导的经颅磁刺激导航系统 #2	TMS Navigator SW版本2.0，LOCALITE GmbH，德国圣奥古斯丁	用于视频拍摄环节
文献：
陶贝等人，2014	Taube, W., Leukel, C., Nielsen, J. B. & Lundbye-Jensen, J. 重复经颅磁刺激（rTMS）激活皮质脊髓通路可能降低皮质运动神经元突触的效率。Cerebral cortex, doi:10.1093/cercor/bht359 (2014)。